Name: הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: חקור את תכונות הנוגדות קרישה של תאי אנדותל באמצעות דם שלם ללא מניעי קרישה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר של דינמיקת קרישת הדם במחקרים קרדיווסקולריים וכירורגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (SNSF, 320030_156193 מענק מס). המחברים תודה ד ר בנואה Werlen למתן את החרוזים microcarrier Biosilon. אנו מודים גם פרופסור הנס פיטר קולר, פרופסור אנדרה Haeberli לקבלת עזרה בהתקנת הדגם חרוז microcarrier.

צמחי תרבות מסורתיים גרמנית חזירים (פראי סוג שחונך בבית חווה מקומיים ו הטרנסגניים bred המכון של גידול בעלי חיים מולקולרית, ביוטכנולוגיה, אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן, מינכן, גרמניה), במשקל בין 30 ק ג עד 40 ק ג, שהיו בשימוש מחקר זה. כל החיות שוכנו בתנאים סטנדרטיים עם מים ומזון מודעה lib. כל הניסויים בוצעו על פי חוק חיות בבריטניה (וצפייה) המדריך NIH עבור הטיפול, שימוש של חיות מעבדה, כמו גם חוק שוויצרי. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל פעלו לפי ההנחיות יגיעו. הוועדה לניסויים בבעלי חיים של השירות הווטרינרי הקנטונים (קנטון של ברן, שווייץ) אישר כל ההליכים בבעלי חיים, רשות. לא. BE70/14. פרוטוקולים ניסיוני היו מעודנת על פי עקרונות 3R, המדינה-of-the-art הרדמה וניהול הכאב שימשו כדי לצמצם את מספר בעלי חיים, לצמצם את החשיפה של החיות מתח וכאב במהלך הניסויים.
 דם אנשים בריאים שבסמל מערכת סגורה venipuncture על פי הנחיות השיפוט והאתיקה שוויצרי של בית החולים של אוניברסיטת ברן. הביטוי &#34; הלא-anticoagulated דם &#34; אומר כי הדם לא התייחסו עם קרישה לכל.
 השלבים הבאים מבוצעות בתנאים סטריליים. היכרות עם התרבות התא הבסיסי סטרילי טכניקה נדרש.
 1. בידוד של PAEC הערה: אבי העורקים החזי מקטעים של 6 עד 10 ס מ, התקבלו לאללה חזירים גרמנית צמחי תרבות מסורתיים של 3 עד 6 חודשים של גיל (משמש לניסויים אחרים ב- vivo) ומיד הועבר לתוך בקבוק 500-מ"עמ המכיל אמצעי התעבורה (DMEM + 1% פניצילין/סטרפטומיצין).
<ol><li>מראש מעיל צלחת 6-ובכן עם fibronectin 12.5 µg/mL ב- PBS 1 x ולמקם אותו באינקובטור ב 37 ° C עבור ה 1</li>
	<li>לחמם PBS עקר 1 x ותא תרבות בינוני (DMEM).</li>
	<li>להוציא את העורקים חזירי מאמצעי התחבורה.</li>
	<li>במקום אבי העורקים על צלחת פוליסטירן.</li>
	<li>לשטוף עם PBS חמה בעדינות מראש.</li>
	<li>לחתוך אבי העורקים longitudinally ותקן אותה באמצעות מחטים.</li>
	<li>להוסיף בינוני תרבות תא חמים על המשטח הפנימי כלי.</li>
	<li>תשאף בינוני התרבות תאים fibronectin ולהוסיף תא טריים תרבות בינוני (DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו- 0.4% של תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת מיקס).</li>
	<li>לטבול מטלית כותנה אחד המדיום התרבות תאים. לנקות את ניצן צמר גפן על העליון של פני השטח הכלי הפנימי ובאיטיות באותו כיוון.</li>
	<li>לשפשף התאים באר אחת של 6-ובכן צלחת עגולה על ידי סיבוב.</li>
	<li>לעשות זאת גם עבור שאר הבארות.</li>
	<li>לבדוק תאים במיקרוסקופ ולמקם את הצלחת 6-ובכן חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.</li>
	<li>לשנות את המדיום ביום השני ולשנות אותו שוב כל 2-3 ימים.</li>
	<li>כאשר תאים לא יהיו confluent, trypsinize תאים, זרע אותם לתוך בקבוקון T75 (PAEC P1).</li>
</ol> 2. אפיון PAEC <ol><li>מראש מעיל של chamberslide 8-ובכן עם fibronectin 12.5 µg/mL ב- PBS 1 x ולמקם אותו באינקובטור ב 37 ° C עבור ה 1</li>
	<li>זרע 5 x 10 4 תאים/טוב, דגירה בין לילה בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לרחוץ את התאים פעמיים עם PBS ++ (PBS בתוספת CaCl 2 ו- MgCl 2), μL 300/טוב.</li>
	<li>לתקן תאים עם 3.7% paraformaldehyde 10 דקות בטמפרטורת החדר, μL 200/טוב.</li>
	<li>לרחוץ תאים 3 פעמים עם PBS ++, μL 300/טוב.</li>
	<li>להוסיף 300 μL של PBS 1 x-3_% BSA (מאגר חסימה) ולהשאיר 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להחיל נוגדנים הראשי (anti-VE-קדהרין, anti-CD31, אנטי-vWF) מדולל ב- PBS 1x-1%BSA-0.05% דטרגנט, μL 160/טוב, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBS ++ (200 μL היטב).</li>
	<li>החל נוגדנים משניים, דאפי מדולל ב- PBS 1x-1%BSA-0.05% דטרגנט, μL 160/טוב, ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBS ++ (200 μL היטב).</li>
	<li>הר שקופיות בינונית הרכבה המבוסס גליצרול ולוודא תא אנדותל ביטוי סמני תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. 
	הערה: ניתן להגיע תרבות חזירי תאי אנדותל אבי העורקים בבקבוקון T175 (DMEM גלוקוז נמוך בינוני + 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו- 0.4% של תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת) עד 90% הנהרות. (זריעה צפיפות עונה 1 פרק 10 6 תאים, 90% הנהרות שיתאימו בערך 5 x 10 6 תאים).</li>
</ol> 3. ציפוי של חרוזים Microcarrier <ol><li>לערבב mL 7 של חרוזים microcarrier עם 42 מ של קולגן פתרון שפופרת 50-mL (100 μg/mL, מדולל ב- 0.2% חומצה אצטית פתרון), תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ חרוזים פעמיים עם 25 מ של PBS pH 7.4 (להוסיף 25 מ של PBS, מערבבים היטב עם pipet ולחכות עד החרוזים הם התיישבו ואז להשליך את תגובת שיקוע, חזור) פעם אחת עם 25 מיליליטר בינוני DMEM.</li>
	<li>מכסים את החרוזים לשפופרת 50-mL עם 10 מ"ל בינוני 199 בתוספת 10% FBS בסה כ, הפניצילין 1% / סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין, 0.4% תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת ו 25 μL של הפארין (5000 IU/mL) ולאפשר equilibration 10 דקות לפני שימוש נוסף.</li>
</ol> 4. איסוף תאים <ol><li>להסיר המדיום התרבות תאים מן הבקבוק T175 המכיל PAEC ולהוסיף 5 מ של PBS pH 7.4.</li>
	<li>PBS להסיר מן הבקבוק T175.</li>
	<li>הוסף 5 מ של Trypsin-0.05% EDTA ואת תקופת דגירה של 3-4 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את התאים על ידי שטיפה את הבקבוק עם 15 מ"ל של התא תרבות בינוני ולהעביר את המתלים בשפופרת 50-mL-</li>
	<li>צנטריפוגה תאים ב g x 1,200 במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר, הסר בינוני עודף, resuspend בגדר ב 5 מ של מדיום התרבות התא.</li>
</ol> 5. זריעה תאים לתוך הבקבוק קדירות <ol><li>להוסיף 20 מ של התא תרבות בינוני התליה תא, resuspend.</li>
	<li>להוסיף 20 מ"ל תא תרבות בינונית (ללא תאים) לתוך הבקבוק פלב מ 500-ל.</li>
	<li>להוסיף את התאים החרוזים microcarrier שטף מהשלב 3.3 ומערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית 25-mL-</li>
	<li>להעביר את התערובת חרוזים/תא לתוך הבקבוק טווה מגנטי.</li>
	<li>שטוף הצינורית 50-mL עם 10 מ"ל של תא בינוני תרבות כדי לאסוף את התאים הנותרים.</li>
	<li>להוסיף אוטם 85 נוספים של התא תרבות בינוני הבקבוק טווה ולמקם אותו לתוך החממה ללון ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף (g 100 x, ערבוב מרווח: 3 דקות כל 45 min).</li>
	<li>להוסיף 50 מ של התא תרבות בינוני (נפח כולל 200 מ ל) ולהמשיך ערבוב במשך 24 שעות נוספות-37 מעלות צלזיוס על מטרף (g 100 x, ערבוב מרווח: 3 דקות כל 45 min).</li>
	<li>בינוני RPMI השקופה הוספה (בתוספת 10% FBS בסה כ, הפניצילין 1% / סטרפטומיצין, 1%-גלוטמין, 0.4% תא אנדותל הצמיחה בינונית תוספת תערובת ו 25 μL של הפארין) עד 320 מ של הנפח הכולל.</li>
	<li>להחליף את המדיום כל 48 ח': להסיר 100 מיליליטר המדיום הישן ולהוסיף 100 מ של טרי RPMI השקופה שהושלם.</li>
	<li>התרבות התאים במשך 5 עד 7 ימים. משך הזמן תלוי מצב זרימה של חרוזים מצופים תא.</li>
</ol> 6. אימות הנהרות <ol><li>לאסוף μL 200 של חרוזים מצופים התא באמצעות פיפטה ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן.</li>
	<li>לרחוץ את החרוזים 3 פעמים עם 600 μL של PBS 1 x (להוסיף PBS, להטות את שפופרת, מערבבים בעדינות כדי למנוע ניתוק של התאים, לחכות את החרוזים כדי להתיישב, למחוק את PBS וחזור).</li>
	<li>לתקן את החרוזים 10 דקות על-ידי הוספת μL 200 של חומצה parapicric.</li>
	<li>שטיפת 3 פעמים עם 600 μL של PBS 1 x.</li>
	<li>להוסיף דאפי מדולל ב- PBS 1 x דגירה במשך 10 דקות</li>
	<li>להעביר את החרוזים על משטח זכוכית ולהחיל את coverslip באמצעות המבוסס גליצרול הרכבה בינונית.</li>
	<li>להמחיש את החרוזים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.</li>
</ol> 7. ניתוח ניסיוני <ol><li>להסיר את החרוזים מצופים תא מן הבקבוק פגים (הליכים לא צריך להיעשות בתנאים סטריליים) עם פיפטה סרולוגית 10-mL ולהעביר אותם לתוך צינורות פוליפרופילן סיבוב המדרגה 12 mL-</li>
	<li>לתת החרוזים להתיישב (בסביבות 1-2 דקות) ולהסיר עודפי בינונית.</li>
	<li>להוסיף יותר חרוזים הצינורות עד כל שפופרת מכיל בדיוק 2 מ"ל של חרוזים.</li>
	<li>להוסיף 5-mL RPMI ברור כל שפופרת ומערבבים היטב בעזרת פיפטה סרולוגית 10-mL-</li>
	<li>לתת החרוזים להתיישב ולהסיר עודפי בינונית.</li>
	<li>חזור על הפעולות כביסה פעם נוספת עם RPMI ולהסיר כל עודף בינונית.</li>
</ol> 8. הדגירה בדם Non-anticoagulated <ol><li>לאט ובזהירות (באמצעות סילון וגם vacutainers) להוציא. דם מתנדבים בריאים ולאסוף זה 9 מ ל צינורות פוליפרופילן ניטרלי (לא נוגד קרישה).</li>
	<li>להעביר לאט 8 מ של דם עם פיפטה סרולוגית 10-mL לתוך כל צינורות פוליפרופילן המכיל 2 מ"ל של חרוזים מצופים תא (לנפח הכללי יהיה 10 מ ל). תמיד להימנע טיפול אגרסיבי של דם או חרוזים כדי למנוע הפעלת EC מוקדמת. ההליך לוקח 1-2 דקות</li>
	<li>בקפידה להטות את תערובת דם/חרוז כדי להבטיח ערבוב שווה. ואטמו את הכובע עם סרט פרפין.</li>
	<li>במקום הצינורות על טבלת הטיית אופקי (עם עדינה הגדרות הטיית בלבד) בתוך 37 ° C ואז הרשומה קרישת פעמים.
	<ol><li>במרווחי זמן קבועים, למשל אחרי 10, 20, 30, 50, 70, 90 דקות, להסיר לפחות 1.5-2 מ"ל של דם-חרוז תערובת לניתוח סרום או פלסמה. 
		הערה: עבור 6 נקודות זמן אנו מציעים שיש יותר מ-3 משכפל בתוך קבוצה אחת של תאים, כפי שהדגימה הדם ייעשה צינורות שונים.</li>
		<li>אוסף של נסיוב, להשאיר את הדם והקרשה. כדי לאסוף הפלזמה, להוסיף EDTA או ציטראט 2 mL צינורות לפני הוספת דגימות דם.</li>
		<li>לאחסן הצינורות על קרח, צנטריפוגה ב g 2,500 x 10 דקות ב 4 ° C ו לאחסן סרום/פלזמה ב 80 ° C עד שימוש. 
		הערה: פרטים על חומרים הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים</li></ol></li></ol>

<ol><li>Rajendran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium and human diseases.</a> Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).</li>
<li>Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+recalcified+citrated+whole+blood+-+a+pragmatic+approach+for+thromboelastography+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Anesthesia%22%5BJournal%5D)">The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children.</a> Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).</li>
<li>Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Suppression+of+the+Coagulation+of+Nonanticoagulated+Whole-Blood+in-Vitro+by+Human+Umbilical+Endothelial-Cells+Cultivated+on+Microcarriers+Is+Not+Dependent+on+Protein-C+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation.</a> Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).</li>
<li>Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+suppress+prothrombin+activation+in+nonanticoagulated+whole+blood+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro.</a> J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).</li>
<li>Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+protection+and+complement+inhibition+in+xenotransplantation%3A+a+novel+in+vitro+model+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood.</a> Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).</li>
<li>Cowan, P. J., d'Apice, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+activation+and+coagulation+in+xenotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Complement activation and coagulation in xenotransplantation.</a> Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).</li>
<li>Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endothelial+glycocalyx%3A+composition%2C+functions%2C+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization.</a> Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).</li>
<li>Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-coagulation+crosstalk+on+cellular+and+artificial+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces.</a> Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).</li>
<li>Bongoni, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Expression+of+Human+CD46+on+Porcine+Endothelium%3A+Effect+on+Coagulation+and+Fibrinolytic+Cascades+During+Ex+Vivo+Human-to-Pig+Limb+Xenoperfusions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions.</a> Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).</li>
<li>Miyazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+shear+stress+can+initiate+both+platelet+aggregation+and+shedding+of+procoagulant+containing+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles.</a> Blood. 88, 3456-3464 (1996).</li>
<li>Wuensch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Sequences+of+the+Porcine+THBD+Gene+Facilitate+Endothelial-Specific+Expression+of+Bioactive+Human+Thrombomodulin+in+Single-and+Multitransgenic+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs.</a> Transplantation. 97, 138-147 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המודל המוצג כאן מתאים קרישה הקשורות לימודי המאפשר הניתוח של היבטים שונים של קרישת הדם והאינטראקציה שלו עם לכלכלת 8 במחקר השתלת איברים מבעלי חיים, זוהי מערכת שימושי כדי לבדוק את מאפייני קרישה שונים ECs חזירי מהונדסים לאחר דגירה עם דם אנושי 9.
השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם אלה המבטיח כיסוי תא מלאה (confluency) של גרגרי לפני תחילת הניסוי ואלה הנוגעים האוסף זהיר וטיפול של כל הלא-anticoagulated הדם כדי להימנע מוקדמת הפעלת טסיות עקב גזירה גבוהה...

אנדותל כלי הדם מורכב טפט של תאי אנדותל (EC) אשר קו לומן של כלי הדם. במצב פיזיולוגי, EC השבתה הדרגתית אחראים על קיום קרישה וסביבה אנטי דלקתיות. 1 זה מתווך על ידי הביטוי של קרישה, חלבונים אנטי דלקתיות על פני EC. לדוגמה, הפעלת EC הנגרמת על ידי פגיעה reperfusion/איסכמיה פציעה או כלי דם על ידי דחיית (קסנו-) מושתלים איברים תוצאות שינוי פני השטח אנדותל קרישה, מצב דלקתי של פרו-מקריש, הפרו דלקתיים המדינה. 1
ככל האפשר את האינטראקציה מרתק ומורכב בין הגורמים אנדותל, קרישה, מודלים במבחנה המחקות כמו המצב ויוו הם רצוי מאוד. מגבלה נפוצה המאפיינת קונבנציונאלי במבחנה מבחני קרישת הדם הוא השימוש של דם anticoagulated, מה שהופך את הניתוח של קרישת הדם בתיווך ההשפעות המפרך, אפילו recalcification של דם מלא citrated לא יכול להתרבות תוצאות השגה עם דם טרי ללא-anticoagulated. 2 . חוץ מזה, במערכות תרבות מסורתית תא שטוח-מיטה זה בלתי אפשרי לנצל את מאפייני אנדותל קרישה כמו משטח תא אנדותל מספיקות לכל נפח הדם לא יכול להגיע. המודל המוצג כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי culturing EC על פני השטח של microcarrier כדורי חרוזים, כך יחס השטח-כדי-דם EC של &#62; /mL216 ס"מ ניתן להגיע, בדומה למצב רבים קטנים או ורידים, ו אשר תוארה להיות מספיק כדי לאפשר בדיקות דם "טבעי" של הדם על ידי השטח EC. 3 , 4 דם יכול לשמש ללא קרישה נוסף בהגדרה זו. ניתן לאסוף דגימות דם במהלך הניסוי, ציטוקינים, פקטורי קרישה, סמני הפעלת המשלים מסיסים ועוזרת לכמת. יתר על כן, חרוזים מצופים EC microcarrier עשוי להיות מנותח התצהיר המשלים, אימונוגלובולינים, כמו גם הביטוי של EC הפעלה סמנים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יישום מעניין נוסף כולל בדיקה של תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. 5 . אף על פי מודל זה לחלוטין לא יכול להחליף ניסויים בבעלי חיים, הוא מציע שיטה לבדוק השערות ספציפיות תפקודית שמחוץ באמצעות תאים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר בסיסי על איסכמיה/פגיעה reperfusion השתלת פציעה או (קסנו).
המודל שתואר שימש לחקות השתלת איברים מבעלי חיים הגדרת אילו חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים (PAEC) גדל על החרוזים microcarrier, מודגרות עם דם אנושי שלם, ללא anticoagulated. PAEC הטרנסגניים שונים, נושאת מספר גנים אנושיים כגון CD46 הסדרת מערכת המשלים ו/או thrombomodulin (hTBM) הסדרת במערכת קרישת הדם, נותחו עבור מאפייניהם נוגד קרישה. מערכות הפעלה, המשלים, קרישה תא אנדותל הדוק נשלט, בינהם. 6 לכן חשוב להבין כיצד התאים הטרנסגניים שונים מתנהגים לאחר חשיפה דם אנושי ביחס אדהזיה מולקולה ביטוי ושחרור ציטוקינים, ששפך של glycocalyx ושל אובדן של חלבוני קרישה. 7

<table><tbody><tr><td>PAEC</td><td></td><td></td><td>מבודד מאבי העורקים של חזיר</td></tr><tr><td>בחרוזי מיקרו-נשא במעבדה שלנו (Biosilon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160-250</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, בקר</td><td>Gibco</td><td>A10644-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>בינוני 199</td><td>Sigma</td><td>M7528</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>צינורות ניטרליים</td><td>Sarstedt</td><td>02.1726.001</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליפרופילן</td><td>Simport</td><td>T406-2A</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות בוחש</td><td>Tecnomara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בוחש ביולוגי</td><td>Brouwer</td><td>MCS-104S</td><td></td></tr><tr><td>חולדה אנטי CD31</td><td>R& D Systems</td><td>MAB33871</td><td>דילול 1:100</td></tr><tr><td>דילול עיזים נגד חולדות IgG-Cy3</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>112-166-003</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>עיזים נגד VE-cadherin</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-6458</td><td>דילול 1:100</td></tr><tr><td>ארנב נגד vWF</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>דילול 1:100</td></tr><tr><td>Dk anti Gt IgG &ndash; Alexa 488</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A11055</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב - FITC</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-25MG-F</td><td>דילול 1 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>ריכוז: 10% במדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>מתאם</td><td>Sarstedt</td><td>14.1205</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה</td><td>J</td><td></td><td>זמין בחינם ב: https://imagej.net</td></tr><tr><td>תוסף תזונה בינוני לצמיחת תאי אנדותלMix</td><td>PromoCell</td><td>C-39216</td><td>2 מ"ל ב-500 מ"ל של DMEM</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>ריכוז: 1% במדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>ריכוז: 1% במדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>Heparinun natricum</td><td>Drossa Pharm AG</td><td></td><td>ריכוז מלאי: 5000 U.I./mL</td></tr><tr><td>Chamberslides</td><td>Bioswisstec AG</td><td>30108</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 x 2H2O</td><td>Merck</td><td>2382.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 x6 H2O</td><td>Merck</td><td>1.5833.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Axon Lab AG</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה גליצרג'ל</td><td>Dako</td><td>C0563</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3d ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, תאי אנדותל מכריעים עבור בדיקות דם טבעי של כלי-דם. כתוצאה מכך, תאי אנדותל הפעלת מוביל דם קרישה. תופעה זו נצפית במצבים קליניים רבים, כמו השתלת איברים בנוכחות נוגדנים אנטי-תורם הקבועים מראש, כולל השתלת איברים מבעלי חיים, כמו גם איסכמיה/פגיעה reperfusion לפציעה. על מנת להפחית לניסויים בבעלי חיים על פי 3R סטנדרטים (צמצום, החלפה, עידון), במבחנה הדגמים כדי לחקור את ההשפעה של תאי אנדותל הפעלה על קרישת הדם יהיה רצוי מאוד. עם זאת, מערכות סטילס משותף התרבות תאי אנדותל מספקות יחס השטח לבנפח של 1-5 ס מ2 של אנדותל לכל מיליליטר דם, וזה לא מספיק עבור בדיקות דם טבעי, בתיווך אנדותל. Culturing תאי אנדותל על חרוזים microcarrier עשוי להגדיל את היחס בין השטח לבנפח 40-160 ס מ2/mL. יחס מוגבר זה מספיקה להבטיח את בדיקות דם "טבעי" של דם מלא, כך ניתן למנוע את השימוש תרופות נגד קרישת דם. כאן במבחנה microcarrier מבוססי מערכת מתואר לחקור את ההשפעות של ההנדסה הגנטית של תאי אנדותל חזירי על קרישת הדם של דם אנושי שלם, של אי-anticoagulated. ב וזמינותו המתואר, ראשי חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים, או פראי סוג (WT) או הטרנסגניים האנושית CD46, thrombomodulin, היו גדל על microcarrier חרוזים, אז נחשפים דם אנושי טרי מצוירות בלתי-anticoagulated. דגם זה מאפשר מדידה של כימות של שחרור ציטוקינים, כמו גם הפעלת סמנים של המשלים קרישה בפלסמת הדם. בנוסף, הדמיה של תאי אנדותל מופעל, בתצהיר של immunoglobulins, חלבונים המשלים, קרישה על החרוזים endothelialized בוצעו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. Assay הזה יכול לשמש גם כדי לבדוק תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. על הפוטנציאל שלו כדי להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים לחקירות כאלה, וזמינותו המתואר הוא קל לביצוע, לשחזור באופן עקבי.

לאחר 7-10 ימים של תרבות בתוך הבקבוק טווה (איור 1) התאים היו confluent, מכסה את כל המשטח של חרוזים microcarrier (איור 2). אימות של המדינה confluency היא צעד חשוב כי טפט הלא-confluent של EC-גרגרי יוביל ירידה ניכרת במסגרת זמן קרישת דם, בהתחשב microcarrier פני השטח של חרוזים היא חריפה פרו-מקריש (זמן הקרישה: 4 ± 1 דקות) ( איור 3).
נקודה חשובה נו...

אנו מציגים במבחנה מודל המאפשר את מחקר וניתוח של קרישה בדם שאינו anticoagulated כולה,... בדיקות דם במערכת תלוי אפקט נוגד קרישה הטבעי של תאי אנדותל בריאים והתוצאה תא אנדותל הפעלת הקרישה.

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

המטרה הכללית של בדיקה זו היא להעריך את התכונות הנוגדות קרישה של תאי אנדותל, באמצעות דם שלם שאינו מעובד בנוגדי קרישה. שיטה זו יכולה לשמש למתן מענה לשאלות מחקר הקשורות למחקר קרדיווסקולרי, מחקר בנושאי הובלה ומחקר הקשור לניתוחים. ביסודו של דבר, ניתן להשתמש בה לכל השאלות הנוגעות לאנטי-אימוניות ולהפעלה של תאי אנדותל.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בדם מלא, ללא נוגדי קרישה, שכן תאי האנדותל מבטיחים את מניעת הקרישה. כדי להתחיל בפרוטוקול, ערבבו שבעה מיליליטר של חרוזי מיקרו-נשאים (microcarrier beads) עם 42 מיליליטר של תמיסת קרישה במבחנה של 50 מיליליטר, והדגרימו את החרוזים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגמה, שטפו את החרוזים ב-25 מיליליטר של phosphate buffered saline או PBS, ושטפו את החרוזים באמצעות פיפוט מעלה ומטה.המתינו עד שהחרוצים ישקעו לתחתית המבחנה, לפני השליפת של הנוזל העליון והחזרה על הפעולה. לאחר מכן, שטפו את החרוצים פעם אחת בעזרת 25 milliliters של Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM. לאחר מכן, כסו את החרוצים ב-10 milliliters של medium 199 והמתינו 10 דקות להשגה של שיווי משקל לפני המשך השימוש.הסיר את מצע תרבית התאים מבקבוק ה-T175 המכיל PAEC והוסף חמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, הסר את ה-PBS מבקבוק ה-T175 והחלף אותו בחמישה מיליליטר של trypsin עם 0.05%EDTA. דגור את התאים למשך שלוש עד ארבע דקות ב-37 degree celsius.אספו את התאים על ידי שטיפת הבקבוק עם 15 milliliters של מצע גידול תאים והעבירו את התססוף לנבובת של 50 milliliter. סבבו את התאים בצנטריפוגה, ולאחר הסבב, הסירו את עודפי המצע והשעיו את המשקע ב-five milliliters של מצע גידול תאים. הוסיפו 20 milliliters של מצע גידול תאים לתססוף התאים והשעיו את התאים מחדש.הוסיפו 20 milliliters של מצע גידול תאים ללא תאים לבקבוק ערבוב מגנטי של 500 milliliters. הוסיפו את התאים לחרוזי מיקרו-נשא (micro carrier beads) שטופים וערבבו את התמיסה בזהירות בעזרת פיפטה סרולוגית של 25 milliliters. העבירו את תערובת התאים והחרוזים לבקבוקר הערבוב המגנטי.שטפו את המבחנה עם 10 milliliters של מצע גידול תאים כדי לאסוף את התאים שנותרו. הוסיפו 85 milliliters נוספים של מצע גידול תאים אל תוך הבקבוק המערבב (spinner flask). הניחו את הבקבוק באינקובטור למשך הלילה, בטמפרטורה של 37 degree celsius על שייקר.הוסיפו 50 מיליליטר של מצע גידול תאים לנפח כולל של 200 מיליליטר. המשיכו בערבוב למשך 24 שעות נוספות על שייקר. הוסיפו מצע rockwell park memorial institute או RPMI חסר צבע, עד להגעה לנפח כולל של 320 מיליליטר.הסר 100 milliliters של המצע הישן והוסף 100 milliliters של RPMI חסר צבע, מועשר וטרי, מדי 48 שעות. תרבל את התאים למשך חמישה עד שבעה ימים, בהתאם למצב ההצטפות (confluency) של החרוזיים המצופים בתאים. באמצעות פפית סרולוגית של 10 milliliter, הסר את החרוזיים המצופים בתאים מבקבוק השקיעה המגנטי והעבר אותם לתוך מבחנות פוליפרופילן בעלות תחתית עגולה בנפח 12 milliliter.לאחר דקה עד שתי דקות, כאשר החרוצים שקעו, יש להסיר את עודפי המצע. הוסף חרוצים נוספים למבחנות עד שכל מבחנה תכיל בדיוק 2 mm של חרוצים. לאחר מכן, הוסף 5 mL של RPMI צלול לכל מבחנה וערבב את התמיסה בזהירות בעזרת פיפט סרולוגית של 10 mL.המתינו לשקיעת החרוזים והסירו את עודפי המצע. חזרו על הליך השטיפה פעם אחת נוספת עם RPMI והסירו את כל עודפי המצע. שאבו דם בזהירות ובאיטיות ממתנדב בריא ואספו אותו לשפרופורה ניטרלית מפוליפרופילן בנפח תשעה מיליליטר, ללא נוגד קרישה.העבירו באיטיות שמונה מיליליטר של דם לכל אחת מהמבחנות פוליפרופילן המכילות שני מיליליטר של חרוזי ציפוי תאים, כדי להגיע לנפח כולל של 10 מיליליטר. הקפידו לטפל בדם ובחרוזים בזהירות כדי למנוע הפעלה מוקדמת של EC. הטו בזהירות את תערובת הדם והחרוזים כדי להבטיח ערבוב שווה ואטמו את הפקק עם סרט פאראפין.הנח את המבחנות על שולחן נטייה אופקי עם הגדרות עדינות, בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 37 °C, ורשום את זמני הקרישה. במרווחי זמן קבועים, הוצא לפחות 1.5 עד שני מיליליטרים מתערובת פסוליות הדם לצורך ניתוח סרום או פלזמה. לאיסוף סרום, השאר את הדם להיקרש.לבסוף, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-2,500 G למשך 10 דקות ב-4 °C. אחסנו את הסרום או הפלסמה ב-80 °C עד למועד השימוש. חרוזי מיקרו-נשאי (Microcarrier beads) צבועים עבור CD31 וגרעינים מראים בבירור התמזגות (confluency).תצפית ויזואלית קבעה כי ניתן להבחין בהארכה של זמן הקרישה כאשר נוכח שכבה אחת של EC על פני חרוזי המיקרו-נשאים. עלייה משמעותית בזמן הקרישה נצפתה כאשר תאי אנדותל מאורטות של חזיר, PAEC GalTKO/hCD46/hTBM, היו נוכחים על חרוזי המיקרו-נשאים, מה שמעיד על מודולציה מוצלחת הן של מערכת המשלים והן של מערכת הקרישה. לאחר השליטה בפרוטוקול, ניתן לבצע את הדגראציה של חרוזים מצופים בתאי אנדותל עם דם אנושי ללא נוגדי קרישה בתוך כשיעתיים.משך הניסוי בפועל תלוי בעיקר בזמן הקרישה, הנצפה במהלך הניסוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להבטיח כיסוי מלא של המיקרו-חרוצים בתאי אנדותל ולמנוע הפעלה מוקדמת של דם אנושי.

assessment-anticoagulant-anti-inflammatory-properties-endothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

שיטת לתרבות monolayer תא האנדותל לאורך כל פני השטח הפנימי של המכשיר 3D microfluidic עם כלי הדם בגודל הערוצים (&lt;30 מיקרומטר) מתואר.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

הנגישות של מודלים אמינים לחקירת אינטראקציות דם וסקולריות בבני אדם לוקה בחסר. אנו מציגים מודל מבחנה של תאי אנדותל אנושיים ראשוניים בתרבית בשילוב עם דם מלא אנושי כדי לחקור אינטראקציות תאיות הן בדם (ELISA) והן בתא כלי הדם (מיקרוסקופיה).

רומן במבחנה מודל לחקר יחסי הגומלין בין אדם דם מלא והאנדותל

אנו מדווחים על שיטה במבחנה המאפשרת לכמת את המספר האמיתי של תאי דבק בתוך חד-שכבת תא אנדותל.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

אנדותל כלי הדם שולט בחוזקה ליקוציט גיוס. ליקוציט לקוי extravasation תורם למחלות דלקתיות. לכן, בחיפוש אחר הרומן יסודות ההפעלה אנדותל תקינה יש צורך לעצב משופרת טיפולים עבור הפרעות דלקתיות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה לאפיון הרומן הרגולטורים אנדותל היכולות לשנות ליקוציט סחר בעת דלקת.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

כאן, אנו מציגים שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים איפה תרבותי משותף עם אבי העורקים, נגזר רשתות אנדותל עכברוש תאים mesenchymal prelabelled. שיטה חדשנית זו מאפשרת הדמיה של תאי סטרומה Mesenchymal (MSCs) יונת ושילוב עם רשתות אנדותל, כימות של מאפייני רשת, והערכה של הביטוי immunophenotypes וג'ין MSC.

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

כתב יד זה מתאר את השימוש העכברים הטרנסגניים הכתב ואת נתיבי ממשל שונים של צבעי פלורסנט באנגיוטנסין II-induced יתר לחץ דם באמצעות מיקרוסקופ וידאו intravital של כלי הדם כדי להעריך את ההפעלה של תאים חיסוניים שלהם היכולת לגלגל, לדבוק אנדותל.

להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חדש כדי לחקור ולמפה את התצהיר הממוקד של נשאי סמים לתאי אנדותל במודלים מפוברקים, בגודל אמיתי, עורק אנושי תלת מימדי תחת זרימה פיזיולוגית. השיטה המוצגת עשויה לשמש פלטפורמה חדשה למיקוד נשאי סמים בתוך מערכת כלי הדם.

אין ויטרו מודלים עורקיים בתרבית תאים 3D לחקר פילוח תרופות כלי דם תחת זרימה

חקור את תכונות הנוגדות קרישה של תאי אנדותל באמצעות דם שלם ללא מניעי קרישה. שיטה זו מאפשרת ניתוח מהיר של דינמיקת קרישת הדם במחקרים קרדיווסקולריים וכירורגיים.

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

גלה סרטונים נוספים