Name: שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: למדו שיטה להערכת פעילות אפקטור בתיווך Fc של נוגדנים נגד Hemagglutinin של שפעת. הפרוטוקול משתמש בתאי HEK293 ומאפשר ניתוח ADCC בתוך 24 שעות. שיטה זו תומכת במחקר חיסונים ואימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה יש כבר מומן בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מכוני הבריאות הלאומיים, מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, תחת CEIRS חוזה P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

הניסויים שהופעתם בהם כתב יד זה נעשו מוסדיים קוד של הבאים Icahn לרפואה של אתיקה ותקנות.
1. ביטוי שפעת וירוס Hemagglutinin באמצעות תרביות תאים או זיהום
תרביות תאים:
<ol><li>. תן לזה לנוח במשך 4 שעות בחממה 37 °C (עם 5% CO2), ובא 96-ובכן צלחת צלחת תאים כליה אנושית עובריים (HEK 293T) על צפיפות של 2 x 104 תאים/היטב בתרבות הלבנה רקמות.</li>
	<li>Transfect תאים עם 100 ננוגרם של קידוד גנטי hemagglutinin ויראלי, μL 0.2 של תרביות תאים מגיב לכל באר הנפח הכולל של 50 μL. הערה: שניהם ריאגנט פלסמיד ו- transfectant הם מדולל 1 x Opti-מינימום הכרחי מדיה (מאמ) מופחת סרום בינוני.</li>
	<li>לאחר המקננת הצלחות חממה 37 °C עם 5% CO2 עבור 18 h, להסיר מדיה תרביות תאים.</li>
</ol>2. זיהום
<ol><li>תאי הכליה הכלבים A549 צלחת או מדין דארבי-צפיפות של 2 x 104 תאים/היטב בתרבות הלבנה רקמות טיפול צלחת 96-ובכן ולגדול לפחות 18 h ב- 37 °C חממה עם 5% CO2.</li>
	<li>וירוס שתדללו 1 x MEM להדביק תאים על ריבוי של זיהום של 3, 1 או 0.33 עבור 1 h בחממה 37 °C עם 5% CO2. הנפח הכולל צריך להיות שווה 100 μL. הערה: x 10 MEM מדולל עם מים כדי ליצור 1 x MEM מלאי עבודה עבור וירוס דילול שהוזכרו לעיל.</li>
	<li>לאחר ההדבקה, להסיר את inoculum ולהוסיף μL 100 1 x MEM המשקולת בהיעדרו של טריפסין.</li>
	<li>לגדל תאים נגועים עבור 18 עד 24 h בחממה 37 °C עם 5% CO2.</li>
</ol>3. הערכת הפעלת FcRg/NFAT-מתווכת לוציפראז פעילות על ידי נוגדנים חד-שבטיים או סרה
<ol><li>ראשית, החלף מדיה צמיחה של תאים נגועים או transfected 25 µL assay מדיה (1 x RPMI 1640 בתוספת 4% (vol/כרך) נמוך IgG עובריות שור sera).</li>
	<li>בצלחת נפרדת 96-ובכן, ביצוע דילולים ארבעה קיפולים של הנוגדנים עניין החל מ- 30 μg/mL באמצעות התקשורת וזמינותו. ביצוע דילולים ב- triplicates, פריסה צלחת של דוגמה מאויר באיורים איור 1A. הקפד לכלול פקד שתואמות נוגדנים (אין שליטה נוגדנים) כמו גם פקד רקע (assay מאגר לבד). הערה: עבור שני 'לא הנוגדן' ועל רקע פקדים, להוסיף 25 µL assay מאגר במקום נוגדן.</li>
	<li>העברה μL 25 של נוגדנים באופן סדרתי מדולל-3.2 שלב ולס המתאימות בצלחת של תאים transfected או תאים נגועים.</li>
	<li>דגירה צלחת חממה 37 °C (עם 5% CO2) למשך 15 דקות.</li>
	<li>להוסיף 25 μL של התא Jurkat אפקטור הולם המתוקנת מאתר FcgRIV או FcgRIIIa האנושית (75,000 תאים/הבאר). הנפח הכולל עבור כל אחד צריך להיות 75 µL, הריכוז הסופי ההתחלתי של הנוגדן ב 10 µg/mL (איור 1B). הערה: עבור הפקד רקע, להוסיף 25 µL assay מאגר במקום אפקטור תאים. לבדוק נוגדנים תלויי תאית phagocytosis, תא Jurkat ששונה לבטא את FcgRIIa האנושית יכולה לשמש.</li>
	<li>דגירה צלחת חממה 37 ° C עם 5% CO2 עבור 6-אייץ '.</li>
	<li>הפשרה ומאגר לוציפראז חמים המצע במים 37 °C למשך כ 1 h לפני השימוש. הערה: כדי להפוך את המאגר המצע לוציפראז, לשקם לוציפראז lyophilized assay המצע במאגר assay מסופקים. ניתן לאחסן את המאגר המצע משוקם ב-30 °C עד-10 °C עד שישה שבועות.</li>
	<li>להוסיף μL 75/טוב של מאגר המצע לוציפראז בארות כל פרט רקע הפקד.</li>
	<li>המשך לקרוא luminometer.</li>
	<li>לחשב את הקיפול אינדוקציה עם המשוואה הבאה: מקפלים אינדוקציה = (המושרה ערך-רקע ערך) / (אין ערך ערך-רקע mAb).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
<li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li>
<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+cross-reactive+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+toward+2009+pandemic+influenza+A+virus+subtype+H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1.</a> J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScienceDirectAntibody-dependent+cellular+cytotoxicity+and+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus.</a> Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).</li>
<li>Srivastava, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Dominant+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity+Epitopes+on+the+Hemagglutinin+Antigen+of+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus.</a> J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+specificity+plays+a+critical+role+in+regulating+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+against+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus.</a> PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).</li>
<li>Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+activation+of+Fc-mediated+effector+functions+by+influenza+virus+hemagglutinin+antibodies+requires+two+points+of+contact%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact.</a> PNAS. , 201613225(2016).</li>
<li>Benjamin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Broadly+Neutralizing+Human+Monoclonal+Antibody+Directed+against+a+Novel+Conserved+Epitope+on+the+Influenza+Virus+H3+Hemagglutinin+Globular+Head%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head.</a> J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).</li>
<li>Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-neutralization+of+influenza+A+viruses+mediated+by+a+single+antibody+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop.</a> Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies%3A+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610(2015).</li>
<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
<li>Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+cytotoxicity+to+influenza+virus-infected+cells.+II.+Requirement+for+antibody+and+non-T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes.</a> J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).</li>
<li>Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+detecting+virus-specific+antibodies+triggering+activation+of+Fc%CE%B3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors.</a> J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).</li>
<li>de Vries, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus-specific+antibody+dependent+cellular+cytoxicity+induced+by+vaccination+or+natural+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection.</a> Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).</li>
<li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+reporter-based+ADCC+assay+with+frozen%2C+thaw-and-use+cells+to+measure+Fc+effector+function+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Meth%22%5BJournal%5D)">Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies.</a> J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

השיטה המתוארת כאן מאפשר למשתמש למדוד את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים HA ספציפית לעסוק FcγRIV מאתר. אנטיגן מטרה, hemagglutinin וירוס שפעת, מבוטא על פני השטח של התאים לאחר זיהום על-ידי וירוס או תרביות תאים של פלסמיד ה-DNA. וזמינותו היא עוד יותר נוטה באמצעות חלבונים ויראלי הביע משטח שונים בשילוב עם FcγRs אחרים (בני אדם או מאתר). בנוסף, השתמשנו סרה דוגמאות כדי להעריך את היכולת של נוגדנים בהקשר polyclonal לזירוז Fc אפקטור פונקציות (נתונים לא מוצג), אשר עשוי לספק מידע רלוונטי יותר כאשר לומדים את תגובה חיסונית אדפטיבית הנגרמת על...

חסינות המסופקים על ידי חיסון שפעת עונתית באופן מסורתי העריכו את hemagglutination עיכוב (איץ ' אי) assay1, אשר מודד את נוכחותם של נוגדנים יעד האתר איגוד קולטן של hemagglutinin. נוגדנים אלה HI-פעיל יכול מעניקים חסינות לחיטוי, אך צרים בדרך כלל ב שלהם ולרוחבה של הגנה, מתן חסינות רק זנים נבחרים של וירוס שפעת. בידוד ואפיון של נוגדנים חד-שבטיים בהרחבה תגובתי מזהה את hemagglutinin (HA) מציע שהפיתוח של חיסון שפעת אוניברסלי נמצאת בהישג יד2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. אחת המטרות הגדולות של חיסון שפעת אוניברסלי היא כדי לגרום לתגובה חזקה נוגדן לכיוון האזורים שנשמרת שפעת וירוס9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. בהרחבה נוגדנים תגובתי מזהים אלה epitopes שנשמרת, המורכבת של נטרול והן הלא-נטרול נוגדנים17,18, הוכחו דורשים Fc-FcγR אינטראקציות של האופטימלית הגנה ויוו , המדגישות התרומה של חסינות בתיווך Fc התגובה החיסונית הכוללת שפעת וירוס19,20.
ה"מפה הגנה מכריעים בהערכת חסינות לזיהום. מדדים אלה מאפשרים רופאים ומדענים להעריך את היעילות של חיסונים, המשמעות של הנתונים, על מהלך הטיפול. לתאם הוקמה היחידה של הגנה מפני זיהום בנגיף שפעת היא וזמינותו עיכוב hemagglutination. כייל של 1:40 מזוהה עם הפחתה של 50% הסיכון של המחלה1,21 – ומשקף את הנוכחות של נוגדנים המעכבות התלכדות על ידי מיקוד את קולטן איגוד האתר ממוקם על ראש HA הכדוריים. עם זאת, גם יצוין כי תגובות תא T עשוי להיות עדיף לתאם של הגנה מפני זיהום בנגיף שפעת אצל הקשישים. מעניין, לאחרונה דו ח מצביע על כך neuraminidase עיכוב פעילות עשוי להיות מנבא טוב יותר של חסינות שפעת22. למרבה המזל, טיפוסי במבחנה מבחני כגון מבחני עיכוב ניטרול או neuraminidase יכול למדוד נוגדנים ספציפיים גבעול או neuraminidase HA. רוב אלה מבחני קונבנציונאלי במבחנה , עם זאת, רק לקחת בחשבון את הפונקציה של אזור איגוד אנטיגן הנוגדן ומדידת לא התפקיד של אזור Fc. בנוסף, התרומה של נוגדנים נטרול להגן באמצעות Fc קולטן האירוסין ויוו אינם שזוהו17,18. על מנת למדוד את ההגנה המוענקת על ידי נוגדנים זירוז בתיווך Fc חסינות כמו נוגדנים cytotoxicity מהתא מתווכת (ADCC), נדרשת assay חזקים במבחנה .
בשיטה המתוארת להלן מעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים מאתר לזירוז בתיווך Fc פונקציות באמצעות קו תא Jurkat מהונדסים לבטא של הפעלת הקלד מאתר ה-FcR 1, FcγRIV. נוגדן האירוסין של FcγR transduces הזה גורמים מפעילים גרעיני גורם לפעילות לוציפראז T תאים-בתיווך מופעל איתות תאיים. הבדיקה יש כמה יתרונות על פני שיטות מסורתיות הדורשים בידוד ואת התרבות של תאים אפקטור העיקרי ושימוש של cytometry זרימה כדי לזהות הפעלה של אפקטור בתיווך Fc פונקציות19,23,24 25, ,26. ראשית, הפרוטוקול המתואר כאן בקלות ניתן להתאים לשלב מטרות ויראליות שונות, FcγRs ונוגדנים ממינים שונים (מאתר ואנושי). שנית, השימוש תא Jurkat ששונה קו לבטא FcγR עם גנים כתב לוציפראז תחת מקדם הגרעין של תא T מופעל (NFAT) מאפשר assay בפורמט גדול מסוגל בקלות לנתח שימוש בקורא צלחת מדידה הפריה חוץ גופית. כאן, הפעלת המסורתי של תאים אפקטור העיקרי מוחלף על אינדוקציה של NFAT-לוציפראז על נוגדן האירוסין של FcγR על פני השטח של התא Jurkat. Assay תבנית זו צלחת 96-ובכן מאפשר המדידה של עד ארבע דוגמאות שונות triplicates עם שבע דילולים – מספר דוגמאות שיכול להיות מסורבלת בטכניקות מסורתיות. ישנן נקודות נוספות לשקול עם זה וזמינותו שעשויים להשפיע על העיצוב של ניסויים ופרשנות של נתונים. המטרה ויראלי חייב להתבטא על פני התא על מנת ל'זיהוי נוגדן. כדי להמתיק את זה, המטרה אנטיגן (למשל חלבון נגיפי פנימי) עשוי להיות ישירות מצופה על פני השטח של צלחת. עם זאת, זה לא עוד בקפדנות נבדקו. בנוסף, הקו תא Jurkat ששונה מבטא רק סוג אחד של הפעלת FcγR, ואינה מבטאת כל FcγRs מעכבות, ואילו התא הראשי קווי אקספרס קולטנים כל בהקשר פיזיולוגיים.
השתמשנו בעבר assay הזה כדי להדגים ירידה לפרטים epitope בהקשר polyclonal משחקת תפקיד חשוב בוויסות אפקטור בתיווך Fc פונקציות הפעלה מיטבית של תגובה תאית נוגדנים תלויי דורש שתי נקודות צור קשר עם27,28. כאן, אנו מתארים שיטה הבודק את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים גבעול ספציפית לעסוק ולהפעיל מאתר את הפעלת FcγRIV. למרות שיש חריגים29,30, מספר גדול של נוגדנים בהרחבה תגובתי למקד אזור גבעול שנשמרת antigenically hemagglutinin, וכך לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות שפעת אוניברסלי חיסון.

<table><tbody><tr><td>תאי A549&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>תאי אפיתל בסיסיים אדנוקרצינומיים אנושיים מכתשית</td></tr><tr><td>HEK 293T תאי</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>תאי כליה עובריים אנושיים</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11668019</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM סרום מופחת בינוני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>תרבית רקמה לבנה מטופלת 96 בארות</td><td>צלחת Corning, Inc.&nbsp;</td><td>3917</td><td>לוחות בדיקה</td></tr><tr><td>10X</td><td>MEM Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>תאי ג'ורקט המבטאים עכברים ערכת FcgRIV</td><td>Promega</td><td>M1201</td><td>מספקת כולל תאים, מערכת בדיקת Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI ותאי Jurkat בסרום IgG נמוך</td></tr><tr><td>המבטאים תאי FcgRIIIa</td><td>Promega</td><td>G7010</td> אנושיים <td>מספקת כולל תאים, מערכת בדיקת Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI וסרום</td></tr> <tr><td>IgG נמוךערכת תאי ג'ורקט המבטאת אנושית FcgRIIa</td><td>Promega</td><td>G9901</td><td>מספקת תאים, מערכת בדיקת לוציפראז Bio-Glo, 1X RPMI וסרום IgG נמוך</td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 קורא רב-מצבי</td><td>קורא צלחת זוהר</td></tr><tr><td>מערכת בדיקת לוציפראז Bio-Glo</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>מכיל מאגר בדיקת לוציפראז ומצע בדיקת לוציפראז</td></tr><tr><td>תאי כליה כלבים</td> <td>Madin DarbyATCC</td><td>CCL-34</td><td>תאי כליה של כלבים</td></tr></tbody></table>

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך fc המושרה על ידי שפעת hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

נוגדנים לשחק תפקיד מכריע צימוד את תגובות מערכת החיסון מולדים, גמישים נגד פתוגנים ויראליים דרך שלהם אנטיגן מחייב תחומים ואזורים Fc. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את ההפעלה של Fc אפקטור פונקציות לפי פילוח של hemagglutinin וירוס שפעת עם השימוש של קו תא Jurkat מהונדס גנטית לבטא של הפעלת נוגדנים חד-שבטיים הקלד 1 Fc-FcγR-בשיטה זו, התרומה של אינטראקציות Fc-FcγR ספציפיים שהוענקו immunoglobulins יכול להיקבע תוך שימוש assay במבחנה .

להדגים זאת mAb גבעול ספציפי, 6F12, אבל לא ספציפית ראש בראש-ספציפי mAb, PY102, היה מסוגל להפעיל תאים הרוצח הטבעי העיקרי על-ידי upregulating קולטני γ של CD107a ואינטרפרון-19. כדי לעצב את היכולת של נוגדנים ספציפיים גבעול כדי להפעיל את תאי NK אדם ראשי, אנו מראים mAb גבעול ספציפי, 6F12, robustly יכול להפעיל את התא Jurkat ששונה לבטא את FcγRIV מאתר על ידי ~ 14-fold. מצד שני, mAb הראש ספציפי, PY102, הפקד IgG לעשות לא (איור 2)28.
<p class="jove_cont...

אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להעריך את היכולת של נוגדן או דגימת סרום להפעיל תפקוד אפקטורי המתווך על ידי Fc. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והוואקסינולוגיה על ידי מדידת ההפעלה של חסינות המתווכת Fc ותלוית נוגדנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע את הניסוי תוך 24 שעות, מהכנת החומרים ועד לניתוח הנתונים.מי שידגים פרוצדורה זו הוא מארק ביילי, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה של פיטר פאלס. כדי להשריץ ביטוי של המגלוטינין של נגיף השפעת באמצעות טרנספקציה, ראשית יש לזרוע תאי כליה עובריים אנושיים 293 בריכוז של 2x10⁴ תאים לבאר, בתוך פלטת 96 בארות לבנה שעברה טיפול לתרבית רקמות. לאחר ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, בצעו טרנספקציה לתאים עם 100 ng של DNA המקודד להמגלוטינין ויראלי ו-0.2 µL של ריאגנט טרנספקציה לכל באר, בנפח כולל של 50 µL של מצע 1X optimum-reduced serum medium.הוסיפו קומפלקסים של DNA וליפוזומים לכל באר לצורך טרנספקציה והחזירו את הפלטה לאינקובטור למשך 18 שעות נוספות. כדי להשרות ביטוי של המגלוטינין של נגיף השפעת באמצעות הדבקה, זרעו תאי A549 בריכוז של 2×10⁴ תאים לבאר בפלטה לבנה בעלת 96 בארות שעברה טיפול לתרבית רקמה, לדגירה של 18 שעות לפחות ב-37 °C ו-5% CO2. בסיום הדגירה, דללו את נגיף השפעת לריבוי הדבקה (MOI) של 3 ב-100 µL של מצע 1X MEM לבאר, והדביקו את תאי A459 למשך שעה אחת באינקובטור לתרבית תאים.בסיום הדגירה, החליפו את התוסיף ב-100 µL של מצע 1X MEM טרי ללא נגיף והחזירו את התאים לאינקובטור ל-18 עד 24 שעות נוספות. כדי להעריך את יכולתם של נוגדנים ספציפיים נבחרים להתמקד בתאים המבטאים המגלוטינין, החליפו את העלייה (supernatant) של תרביות התאים שנפגעו מהנגיף ב-25 µL של מצע לבדיקת ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity או ADCC). לאחר מכן, בלוח 96 בארות נפרד, בצעו ארבעה דילולים מלאים של הנוגדנים הנבחרים בשלוש חזרות במצע ADCC טרי, החל מ-10 µg/mL, בהתאם לסכימה, תוך הקפדה על הכללת ביקורת רקע וביקורת ללא נוגדנים.לאחר שכל הנוגדן דולל, העבירו 25 µL מהנוגדן המדולל לבארי המתאימים בלוחית התאים הניסיונית והניחו את הלוחית באינקובטור לתרביות תאים. לאחר 15 דקות, הוסיפו לכל באר 7.5 × 10⁴ תאי Jurkat אפקטורים משופרים המבטאים את קולטן ה-Fc המתאים, בנפח של 25 µL של מצע ADCC, כך שנפח הסופי יהיה 75 µL של מצע ADCC לבאר. החזירו את הלוחית לאינקובטור לתרביות תאים למשך שש שעות, תוך הפשרת באפר של סובסטרט לוסיפראז במסבך מים בטמפרטורה של 37 °C במהלך השעה האחרונה של האינקובציה.כאשר התמיסה מוכנה, הוסיפו 75 µL של תמיסת סובסטרט ללוסיפראז לכל הבארים למעט באר בקרת הרקע, וקראו את הפלטה במכשיר לומינומטר. לאחר מכן ניתן לחשב את פי ההשראה של ציטוטוקסיות תאית התלויה בנוגדנים בתרביתי התאים שהועברו להם גנים (transfected) או שהודבקו. בניסוי זה, נוגדן מונוקלונלי ספציפי לגזע הפעיל ושינה באופן חזק תאי Jurkat המבטאים Fc gamma receptor four עכברי בערך פי 14 בהשוואה לנוגדנים מונוקלונליים ספציפיים לראש ולנוגדני IgG של בקרה.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להקים ניסוי להערכת היכולת של נוגדנים ספציפיים הנבדקים להפעיל חיסון המתווך על ידי Fc.

a-method-to-assess-fc-mediated-effector-functions-induced-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

שיטה זו מתארת ​​את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש &lt;10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

הסרטון מדגים בדיקת עיכוב hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגנים ספציפיים. אישור של עיכוב המגלוטיציה בבאר הבדיקה והמגלוטינציה בבאר הבקרה מושג באמצעות דפוסים חזותיים ברורים. בדיקה זו ממלאת תפקיד מכריע בהערכת התגובה החיסונית, יעילות החיסון וחקר זיהומים נגיפיים בווירולוגיה ובאימונולוגיה.

בדיקת עיכוב Hemagglutination לאיתור נוגדנים בסרום כנגד אנטיגן מטרה

סרטון זה מדגים בדיקה המודדת את ההפעלה בתיווך נוגדנים של פונקציות השפעה של תאי T. הוספת נוגדן חד-שבטי ספציפי לנגיף השפעת המגלוטינין (HA) לתאי יונקים נגועים המבטאים חומצה היאלורונית גורמת להיווצרות קומפלקסים חיסוניים עם חומצה היאלורונית (HA). עם החדרת תאי T מהונדסים המבטאים קולטני Fc וכתב לוציפראז, תאי T מופעלים על ידי קומפלקסים נוגדנים-HA, והפעלה זו מזוהה על ידי הוספת מצע לוציפראז ומדידת הביולומינסנציה המיוצרת.

מדידת ההפעלה של פונקציות אפקט בתיווך Fc על ידי נוגדנים HA

סרטון זה מדגים בדיקה המודדת שפעת נוירמינידז (NA) המעכבת טיטרים נוגדנים בדגימת סרום. דגימת סרום המכילה נוגדנים נגד NA מתווספת לצלחת מיקרווול מצופה פטואין. עם הוספת הנגיף, הנוגדנים מונעים מ-NA נגיפי לנתק את הפטואין ולחשוף את הגלקטוז שלו. לאחר מכן מוסיפים לקטין מצומד פרוקסידז, שנקשר לגלקטוז החשוף. טיטר נוגדנים מעכבי NA נקבע באמצעות בדיקה קולורימטרית, שבה מצע פרוקסידאז נבקע על ידי פרוקסידאז מצומד לקטין משותק כדי לייצר צבע.

בדיקה למדידת נוגדנים מעכבי שפעת Neuraminidase Inhibition Titers

באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

אנו מתארים את בדיקת הלקטין המקושרת לאנזים (ELLA) למדידת טיטר נוגדנים לעיכוב שפעת נויראמינידאז (NA) ב-sera. הבדיקה משתמשת באגלוטינין בוטנים כדי לכמת שאריות גלקטוז שהופכות לנגישות כאשר NA מסיר חומצה סיאלית מצלחות מצופות פטואין, 96 בארות.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

הפרוטוקולים הציג מתארים כיצד לבצע וזמינותו עיכוב hemagglutination לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers מן הדוגמאות סרום מקבלי החיסון נגד שפעת. הבדיקה הראשונה קובע ריכוזים מיטביים אנטיגן ויראלי על-ידי hemagglutination. הבדיקה השניה מכמתת נוגדן ספציפי שפעת titers על ידי עיכוב hemagglutination.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

וירוסים שפעת A (IAVs) הם חשובים פתוגנים הנשימה האנושית. כדי להבין את פתוגניות של IAVs וכדי לבצע בדיקות פרה גישות חיסון הרומן, חייתיים מחקה פיזיולוגיה אנושית נדרשים. כאן, אנו מתארים שיטות להערכת iav ב פתוגנזה, התגובות ההורמונאלית, יעילות החיסון באמצעות מודל של העכבר של זיהום.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש מיקרוarray חלבון שנבנה על ידי הדפסת אנטיגנים שפעת על ניטרוצלולוזה מצופה שקופיות בו סרום בדיקה עבור נוגדנים מרובים isotypes נגד מעל 250 אנטיגנים מפני זנים וירוסים שונים, ובכך המאפשר מדידה של רוחב של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס.

שימוש של מיקרוarray אנטיגן שפעת כדי למדוד את היקף של נוגדנים סרום ברחבי תת וירוס

מאמר זה מתאר פרוטוקולים של הערכת תגובת Tfh ו- GC B במודל העכבר של זיהום וירוס שפעת.

הערכה של תאי עוזר T זקיקים ותגובת מרכז חיידקים במהלך שפעת זיהום וירוס בעכברים

למדו שיטה להערכת פעילות אפקטור בתיווך Fc של נוגדנים נגד Hemagglutinin של שפעת. הפרוטוקול משתמש בתאי HEK293 ומאפשר ניתוח ADCC בתוך 24 שעות. שיטה זו תומכת במחקר חיסונים ואימונולוגיה.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

גלה סרטונים נוספים