שיטה כללית לגילוי Nitrosamide היווצרות בחילוף החומרים במבחנה של Nitrosamines מאת ציטוכרום P450s
25 בספטמבר 2017
Α-hydroxylation של nitrosamines מסרטנים מאת ציטוכרום P450s הוא מסלול מטבולי מקובל שמייצר מזיקות-DNA intermediates, לגרום מוטציות. עם זאת, נתונים חדשים מציין עוד חמצון כדי nitrosamides יכול להתרחש. אנו מתארים גנרל שיטה לגילוי nitrosamides המופק במבחנה ציטוכרום P450 מזורז מטבוליזם של nitrosamines.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לקבוע אם ציטוכרום P450s יכול לחמצן באופן תהליכי n ניטרוזאמינים ל-n ניטוסמידים במבחנה. שיטה זו מועילה לתחום הטוקסיקולוגיה על ידי הערכה אם ניטוסאמינים עוברים חילוף חומרים ישירות לניטרוסמידים. מכיוון שניטרוזמידים יציבים יחסית ב-DNA אלקילט, הם יכולים למלא תפקיד בסרטן.
היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא השימוש בספקטרומטר מסה רגיש ביותר המעניק גבולות זיהוי נמוכים יותר ממה שהושג בעבר עבור מבחני חילוף חומרים דומים של ניטרוזאמין במבחנה. כדי להתחיל בהליך זה, הכניסו לתנור בקבוק תחתון עגול בנפח 25 מיליליטר, המכיל מוט ערבוב מגנטי. יבש במשך 16 שעות בחום של 140 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, העבירו את הבקבוק למכסה אדים וקררו אותו תחת זרם גז חנקן. הוסיפו לבקבוק 31.8 מיליגרם נורקוטינין, חמישה מיליליטר אנהידריד אצטי ומיליליטר אחד של חומצה אצטית, והתחילו לערבב. מעבירים את הבקבוק לאמבטיית מי קרח.
הוסף 33.3 מיליגרם נתרן ניטריט. המשיכו לערבב במשך 2.5 שעות, ואז שפכו את התגובה ל -18 מיליליטר מים קרים כקרח כדי להרוות את התגובה. העבירו מיד את התמיסה למשפך הפרדה המכיל 18 מיליליטר DCM, וחלצו את התמיסה המימית.
חלץ את השכבה המימית פעמיים נוספות, תוך שימוש ב-9 מיליליטר DCM בכל פעם. לאחר מכן יבש את האורגנים שנאגרו מעל 100 מיליגרם מגנזיום גופרתי למשך שתי דקות. לאחר הסינון, השתמש במאייד סיבובי כדי לרכז את התמיסה ב-30 מעלות צלזיוס כדי להניב שמן צהוב גולמי.
טהר את התרכובת הגולמית באמצעות כרומטוגרפיה של עמודות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, ממיסים את התרכובת הטהורה במיליליטר אחד של כלורופורם דוטראט. באמצעות תמ"ג, אשר את המבנה והמולריות של הפתרון כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
אחסן תמיסה זו בחושך בטמפרטורה שבין שתיים לשמונה מעלות צלזיוס עד הצורך. לאחר מכן אשר את מסת האב המדויקת וקבע את מסות היונים של תמיסת ה-NNC הטהורה על ידי עירוי ישיר על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, הסר את הריאגנטים הדרושים ממקפיא של 80 מעלות צלזיוס, והפשיר על קרח.
לאחר הפשרה, השתמש במאגר תגובה בעוצמה של 0.5 כדי לדלל את הבקולוזומים במערכת התחדשות NADPH 1-10 ו-1-50 בהתאמה, בצינור של מיליליטר אחד. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטר של תמיסת מלאי NADP לצינור מיליליטר אחד המכיל 97 מיקרוליטר של מאגר תגובה בעוצמה של 0.5. עבור כל דגירה, הכינו צינור של מיליליטר אחד על ידי הוספת 40 מיקרוליטר של תמיסת NNN של ארבעה מיקרו-מולרים העשויה עם מאגר תגובה.
הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת אנזים המכילה חמישה פיקומולים של P450 2A6 לכל צינור. דגירה מוקדמת באמבט מים בחום של 37 מעלות למשך שתי דקות. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת NADP+ מדוללת לכל צינור.
יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת עד 30 דקות. לאחר מכן, הוסף תחילה 10 מיקרוליטר של 3.0 אבץ גופרתי רגיל, ולאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של 3.0 בריום הידרוקסיד רגיל כדי להרוות את התגובה. מערבולת את התמיסה ליצירת משקעים לבנים.
לאחר מכן, צנטריפוגה ב-8,000 G למשך ארבע דקות. אסוף מיד את הסופרנטנט, ונתח שני מיקרוליטר על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, יינון חיובי של ננו-אלקטרוספריי, ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה. במחקר זה, נורקוטינין מועבר ל-NNC בצורה נקייה ובתפוקה גבוהה, מה שמייצר תקן לשימוש בניסוי במבחנה.
הצלחת התגובה מאומתת על ידי ניתוח ספקטרוסקופי, כולל ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה, שאישרה כי מסת ההורה היא בטווח של חמישה חלקים למיליון מהערך התיאורטי. לאחר מכן משתמשים בפיצול ספקטרומטריית מסה טנדם של NNC כדי לקבוע את מסות היונים של המוצר הנפוץ ביותר. כפי שניתן לראות, שני יוני התוצר הנפוצים ביותר הם 134 ו-162, עם זיהוי מסה מדויק עד חמישה מקומות עשרוניים.
לאחר מכן נעשה שימוש ב-NNC המסונתז כסטנדרט לבדיקת חילוף החומרים במבחנה P450. בתנאים בהם נעשה שימוש, NNC סינתטי נפלט בערך 17.5 דקות, עם שיאים שנפתרו היטב הן בתעלת היונים של האב והן בתעלת היונים של המוצר. בהתאם לבקרה החיובית, היווצרות NNC נראית בדגירה של דקה, חמש דקות ו-10 דקות.
אם מבוצע כראוי, ניתן לבצע את הניתוח הספקטרוסקופי של סינתזת הניטרוסאמיד תוך כשש שעות. כמו כן, הבדיקה במבחנה עם דגירה מרובה אמורה להימשך לא יותר משמונה שעות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הערכת הסיכון לסרטן הקשור לטבק, מכיוון שמדידה של סמנים ביולוגיים הקשורים לניטרוזמיד יכולה להיות אינפורמטיבית לגבי הפעלת ניטרוזאמין בודדת.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבד דגירות אנזימים במהירות. ניטרוזמידים עוברים הידרוליזה בתנאים אלה ולא צריכים לשבת זמן רב לפני ניתוח מפרט המסה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין תקני ניטרוזמיד, ולהעריך אם הם נוצרים במבחנה על ידי מערכת ניטרוסאמין ציטוכרום P450 המתאימה.
אל תשכח שעבודה עם NNN, NNC או חומרים מסרטנים קשורים עלולה להיות מסוכנת. יש לטפל תמיד בתרכובות אלה במכסה אדים תוך לבישת חלוק מעבדה, משקפי בטיחות וכפפות. בנוסף, יש לאחסן ולתייג כראוי את כל הפסולת המסרטנת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את נתיב המטבוליזם של ניטרוזמינים על ידי ציטוכרום P450s, תוך התמקדות בחמצון לניטרוזאמידים. המתודולוגיה שואפת לקבוע את הפרוססיביות (processivity) של תגובה זו במערכת in vitro, דבר שעשוי להיות בעל השפעה על הבנת תהליכי קרצינוגנזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- רעלנות
- מחקר סרטן
- ביוכימיה
רקע
- ניטרוסמינים הם חומרים מסרטנים ידועים שעלולים להוביל לנזק ל-DNA.
- ציטוכרום P450s הם אנזימים המטבליים תרכובות שונות, כולל ניטרוסמינים.
- ניטרוסמידים, המיוצרים מניטרוסמינים, הם יציבים ועשויים לתרום לתהליך הקרצינוגנזה.
- שיטות קודמות היו חסרות רגישות בגילוי מטבוליזם של ניטרוסמינים.
מטרת המחקר
- להערכת ההמרה המטבולית של ניטרוסמינים לניטרוסאמידים על ידי ციטוכרום P450s.
- לבחינת ההשלכות של יציבות הניטרוסאמיד באלקילציה של DNA.
- לשיפור שיטות הגילוי של מטבוליזם של ניטרוסמינים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בספקטרומטר מסות בעל רגישות גבוהה לצורך זיהוי.
- בדיקות in vitro לחקר המסלול המטבולי.
- הכנת תערובות תגובה בסביבה מבוקרת.
- ניטור תוצרי תגובה לזיהוי ניטרוסאמידים.
תוצאות עיקריות
- הוכיח כי cytochrome P450s יכולים לחמצן ניטרוסאמינים לניטרוסאמידים.
- ביסס שיטה עם גבולי גילוי נמוכים יותר עבור מטבוליזם של ניטרוסאמינים.
- סיפק ראיות לתפקידם הפוטנציאלי של ניטרוסאמידים בקרצינוגנזה.
- הדגיש את חשיבותו של נתיב מטבולי זה בטוקסיקולוגיה.
מסקנות
- המחקר מאשר את ההמרה המטבולית של ניטרוזאמינים לניטרוזאמידים.
- הממצאים מצביעים על צורך במחקר נוסף לגבי ההשלכות על הסיכון לסרטן.
- המתודולוגיה שפותחה יכולה לשפר הערכות טוקסיקולוגיות עתידיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי היווצרות ניטרוסאמיד במהלך מטבוליזם של ניטרוסאמינים המתווך על ידי ציטוכרום P450 נותן מענה לפער קריטי בהערכת סיכונים טוקסיקולוגית ובצמצום סיכונים מכניסטי עבור מסרטניות. ספקטרומטריית מסות ברגישות גבוהה מאפשרת כימות מדויק של מטבוליטים מינוריים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מוקדם של סיכונים. סבב עבודה זה מספק מידע לקבלת החלטות ברמת הפורטפוליו לגבי קידום תרכובות ואפיון בטיחות בקווי פיתוח בשלב הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מסלולי הפעלה מטבוליים עבור קרצינוגנים נגזרים מניטרוזאמינים.
- תומך בהסרת סיכונים מכנית על ידי הבהרה של תפקידם של ניטרוזאמידים באלקילציה של DNA.
- מספק ראיות פונקציונליות לתיקוף מטרה במיון תרכובות מונחה-טוקסיקולוגיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכונן מערכות in vitro מאושרות לזיהוי הדיר שחזר של מטבוליטים של ניטרוסאמיד.
- מספק תוצאות כמותיות ברגישות גבוהה עבור תהליכי סינון המשכיים.
- מסייע בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור שילובים שונים של nitrosamine-P450.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- מתאימ תגליות של סמנים ביולוגיים מטבוליים להערכת סיכון תרגומית עבור קרצינוגניות.
- מאפשר רצף משלב הגילוי in vitro ועד למחקרי רעילות פרה-קליניים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על ראיות מכניסטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף המוקדם שבין השלב של הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין פהורו של מסלולים מטבוליים לבין פיתוח של ביומרקרים תרגומיים.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת בדיקה חזקה של היפותזות להפעלה מטבולית ולהבהרה של מסלולים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לזיהוי והשוואה של מטבוליטים.
- אנליטיקה: עושה שימוש בספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה למדידה רגישה ומדויקת של מטבוליטים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים פרה-קליניים לסיכון קרצינוגני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה הניתנת להכללה להערכות מגוונות של ניטרוסמינים ומערכות P450.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בהערכת קרצינוגניות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זיהוי מטבוליטים באמצעות פרוטוקולים ניתנים לשכפול וניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go ומשפר את יעילות ההון באמצעות זיהוי מוקדם של סיכונים.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של תרכובות מועמדות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באנזימולוגיה, כימיה אנליטית ומספקטרומטריית מסות.
- נדרשת גישה למכשור LC-MS/MS ברזולוציה גבוהה ולסטנדרטים שעברו תיקוף.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות של הבדיקה ויכולת השוואה של הנתונים.
- יש להתאים את הפרוטוקולים עבור סובסטראטים שונים של ניטרוסמינים ואיזופורמים שונים של P450.
- טיפול זהיר ועיבוד מהיר חיוניים בשל חוסר היציבות של הניטרוסאמיד.
