מבוא לספקטרומטריית מסה
מקור: המעבדה של ד"ר ח'ולוד אל-ג'מאל - קינגס קולג' לונדון
ספקטרומטריית מסה היא טכניקה אנליטית בכימיה המאפשרת זיהוי של תרכובות לא ידועות בתוך מדגם, כימו…
1. ניקוי צינורות פוליקרבונט
- השתמש בצינורות פוליקרבונט עמידים בפני פתרונות חומציים לעיכול מדגם. על מנת להסיר כל עקבות מזהמים של ברזל, למלא את כל הצינורות עם 5 מ"ל של 0.1 M HCl.
- מניחים צינורות באמבט מים במשך שעה אחת ב 50 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הצינורות עם 5 מ"ל של מים מילי-Q ולייבש את הצינורות בתנור או מכסה המנוע הכימי.
2. הכנת דגימה ועיכול
- מניחים 200 מיקרול של מדגם ב 1.8 מ"ל של חומצה חנקתית מרוכזת (65%).
- מניחים צינורות באמבט מים למשך הלילה בשעה 50 מעלות צלזיוס. התאם את הפרוטוקול על ידי הגדלת הטמפרטורה אם יש צורך בהפחתה של זמן העיכול הכולל.
- תן לצינורות להתקרר בטמפרטורת החדר.
- לדלל את הדגימות על ידי הוספת 8 מ"ל של מי מילי-Q כדי להשיג ריכוז חומצה חנקתית סופית מפוח 20% (v/ v).
- צינורות צנטריפוגות ב 3,000 x g במשך 10 דקות כדי גלולה כל שאריות מקרוסקופיות הנותרות.
3. הכנת הכלי
- לנקות את לפיד ICP באמצעות ultrasonication ב 5% חומצה חנקתית במשך 15 דקות. לנגב קונוסים עם 5% חומצה חנקתית. לשנות את הצינורות ההפריסטית. תבדוק את רמת שמן המשאבה.
- תדליק את הארגון והצ'ילר, תתחיל פלזמה. התחל זרימה נוזלית לתוך פלזמה ולחכות המכשיר לייצב, כ 20 דקות.
- מטב את מתחי העדשה. הפעל בדיקת ביצועים יומית על-ידי מדידת פתרונות בדיקה המכילים Mg, In ו- שלך כדי לאשר את הרגישות של מכשיר ICP-MS. מדוד Ce ו- Ba שבו טופס תחמוצת ויונים טעונים כפולים צריך להישאר מתחת 3%. בדוק את המסה ב 8 ו 220 Da כדי למדוד את אות הרקע.
- הכלי מוכן כעת לשימוש.
4. בחירת שיטת המשתמש ורשימת דוגמאות
- בחר אלמנט ואיזוטופים של עניין.
- בחר מצב סריקה כקפיצה על שיא.
- בחר זמן התעכבות של 100 אלפיות שני (מינימום 50) עם 40 סריקות (מינימום 15) לקריאה. בחר קריאה אחת לכל שכפול ו- 5 משכפלים (מינימום 3). זמן האינטגרציה הכולל הוא 4,000 ms. אם כמות המדגם מוגבלת, צמצם את זמן ההשתהות, מספר הסריקות והשכפולים תוך שמירה על ערכים גבוהים יותר מערכי המינימום שהוגדרו לעיל.
- השתמש בקצב זרימה של אמוניה (NH3) ב 0.7 מ"ל / דקה כדי למנוע את ההפרעה של 40Ar16O על הקביעה של 56Fe.
- הכן עקומת כיול עבור האלמנטים המועדפים.
- תריץ את הדגימות.
ספקטרומטריית מסה היא טכניקה אנליטית המאפשרת זיהוי וכימות של תרכובות לא ידועות בתוך דגימה, וקביעת המבנה שלהן.
בספקטרומטריית מסה, יוני פאזה גזית נוצרים מהאטומים או המולקולות בדגימה. לאחר מכן מופרדים היונים על סמך יחס המסה למטען שלהם, המסומל על ידי m/z.
הפרדה זו מאפשרת לקבוע מידע כמותי ואיכותי על מדגם, כגון המסה והמבנה שלהם.
סרטון זה יציג את המושגים הבסיסיים והמכשור של ספקטרומטריית מסה, וידגים את השימוש בו בכימות יסודות.
ספקטרומטר מסה מורכב ממקור יינון, מנתח מסה וגלאי. במקור היינון, התרכובות מיוננות, בדרך כלל למטען חיובי יחיד.
ניתן ליצור יונים באמצעות טכניקות שונות, כגון פגיעה בקרן אלקטרונים, פלזמה או לייזרים, שכל אחת מהן גורמת למגוון של פיצולים המסייעים בקביעת המבנה המולקולרי. שיטות אלה מקובצות באופן רופף ליינון "קשה" ו"רך ".
טכניקות יינון קשות גורמות לפיצול נרחב, וכתוצאה מכך יותר שברים בעלי מסה נמוכה יותר.
טכניקות יינון רכות מביאות לפחות, או כמעט ללא פיצול, עם טווח מסה מולקולרי גבוה.
אם הפיצול גדול מדי, מידע חשוב על המבנה עלול ללכת לאיבוד. אם זה מעט מדי, מולקולות קטנות לא יהיו מיוננות ביעילות. לפיכך, הבחירה בשיטת יינון תלויה בניתוח העניין ובמידת הפיצול הרצויה.
לאחר מכן היונים מואצים בשדה חשמלי כשהם נכנסים למנתח המסה, שם הם יופרדו.
מנתח המסה הבסיסי ביותר הוא מגזר מגנטי, המורכב ממגנט מעוקל המייצר שדה מגנטי הומוגני. כוח המשיכה של המגנט, בתוספת הכוח הצנטריפוגלי של היונים המאיצים גורם להם לנוע במסלול מעגלי דרך העקומה.
רדיוס הנתיב המעגלי של היונים תלוי במתח המאיץ, בשדה המגנטי המופעל וביחס המסה למטען.
לאחר מכן ניתן לבחור את המתח והשדה המגנטי כדי לאפשר רק מינים מסוימים של יחס מסה למטען דרך הנתיב העקום. יונים אחרים מתנגשים בצידי המסלול המגנטי והולכים לאיבוד. על ידי סריקת עוצמת השדה המגנטי, היונים הרצויים מגיעים לגלאי בזמנים שונים, ובכך מזהים כל מין במדויק.
סוג נוסף של מנתח מסה הוא מסנן המסה המרובע. הקוואדרופול מורכב משני זוגות של מוטות מתכת מקבילים, כאשר כל זוג מוטות מנוגדים מחובר חשמלית.
מתח זרם ישר מופעל על זוגות המוטות, והפוטנציאלים שלהם מתחלפים ברציפות כך שהזוגות תמיד מחוץ לפאזה עם השני.
לאחר מכן קרן היונים מכוונת דרך מרכז ארבעת המוטות. יונים נעים בנתיב דמוי חולץ פקקים, בשל המשיכה והדחייה המתמדת מהמוטות. בהתאם ליחס המסה למטען של היונים, היון יעבור את כל הנתיב של המרובע ויגיע לגלאי, או יתנגש במוטות.
כעת, לאחר שתוארו היסודות של ספקטרומטר המסה, בואו נסתכל על השימוש בו במעבדה.
ספקטרומטר המסה המשמש בניסוי זה הוא פלזמה בצימוד אינדוקטיבי, או ICP, מיינן, עם מסנן מרובע. המכשיר ישמש לאיתור וכימות רכיב מתכת בדגימה.
כדי להתחיל בניסוי, מלאו את כל צינורות הפוליפרופילן ב -5 מ"ל של חומצה הידרוכלורית 0.1 M על מנת להסיר כל זכר מזהם של ברזל. הניחו את הצינורות באמבט מים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, שטפו את הצינורות ב-5 מ"ל מים נטולי יונים, וייבשו את הצינורות בתנור או בקולט אדים כימי.
בצינורות הנקיים מוסיפים 1.8 מ"ל חומצה חנקתית מרוכזת ו -200 ? L של דגימה המכילה את האיזוטופ המעניין.
יש להקפיד על אמצעי זהירות בעת שימוש בחומצה מרוכזת.
מניחים את הצינורות באמבט מים למשך הלילה. ניתן להעלות את הטמפרטורה כדי לקצר את זמן העיכול, במידת הצורך.
לאחר עיכול הדגימה, הניחו לצינורות להתקרר לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הוסף 8 מ"ל מים נטולי יונים כדי לדלל את הדגימות, ולקבל ריכוז חומצה חנקתית מתחת ל-20%. הדילול הסופי של המדגם הוא 1/50. הריכוז האידיאלי עבור ICP הוא בטווח של חלקים למיליארד. צנטריפוגה את הצינורות כדי לגלול את כל השאריות המקרוסקופיות שנותרו.
ICP היא שיטה ליינון קשה המשתמשת בפלזמת ארגון מצומדת בכ-10,000 ? C המוליך חשמלית ליינון מולקולות הדגימה.
התחל את הגדרת המכשיר על ידי בדיקת לפיד ה-ICP כדי לוודא שהוא נקי.
לאחר מכן, בדוק את הדגימה ואת הקונוסים של הרחפן כדי לוודא שהם גם נקיים. קונוסים אלה מאפשרים דגימה של החלק הפנימי בלבד של אלומת היונים שנוצרת על ידי לפיד ה-ICP ופועלים כמחסום לוואקום הגבוה של ספקטרומטר המסה.
בדוק את לחץ הארגון והפעל את הצ'ילר. התחל את זרימת הפלזמה והנוזל למערכת. המתן 20 דקות עד שהמערכת תתחמם במלואה.
לאחר מכן, שאפו תמיסת בדיקה סטנדרטית, המכילה תקני יסודות ידועים שונים. יש לבחור את פתרון הבדיקה כך שיכסה את טווח המסה הצפוי של תמיסת האנליט.
לאחר יצירת זרימת התמיסה, אתחל ובדוק את המכשיר בהתאם להנחיות היצרן.
כדי להפעיל את המכשיר, בחר תחילה את היסודות והאיזוטופים המעניינים. לאחר מכן הגדר את מצב הסריקה לדילוג שיא.
בחר חמישה שכפולים לכל מדידה. הגדר כל שכפול כך שיכיל 40 סריקות מדידה, כל טאטא עם זמן שהייה של 50 אלפיות השנייה. זמן האינטגרציה הכולל הוא 2,000 אלפיות השנייה לכל שכפול.
הכן עקומת כיול לאלמנטים לבחירה על ידי מדידת פתרונות סטנדרטיים שהוכנו מראש.
לבסוף, הפעל את הדגימה, במקרה זה, ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל. קבע את ריכוז הברזל באמצעות עקומת כיול הברזל.
ספקטרומטריית מסה משמשת במגוון רחב של יישומים תוך שימוש בטכניקות יינון וניתוח מסה שונות.
בדוגמה זו, נעשה שימוש בסוג של ספקטרומטריית מסה של יינון יינון יינון בסיוע מטריצה, או MALDI-TOF, לניתוח חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה. עם MALDI, מולקולות מיוצבות עם מטריצה, כדי להפחית את הפיצול כאשר המולקולות הגדולות מיוננות.
תמיסת החלבון והמטריצה זוהו שניהם על צלחת ה-MALDI הנקייה, ויובשו. לוחית ה-MALDI הוכנסה למכשיר, והדגימה נותחה.
הניתוח של תרכובות נדיפות ורגישות לחמצון נמדד באמצעות יינון אלקטרונים, ספקטרומטריית מסה, טכניקת יינון קשה.
ראשית, תוכננה מערכת צינורות הניתנת לנעילה על מנת לאפשר פינוי מלא של הצינור, ולאחר מכן העמסת הדגימה בקירור על ידי חנקן נוזלי.
צינור הדגימה היה מחובר ליציאת הכניסה, והדגימה נטענה לתוך המכשיר. לאחר מכן נותח ספקטרום המסה של הדגימה במקרה זה tris(trifluoromethyl) phosphate.
ספקטרומטר מסה של קרן מולקולרית יחד עם קרינת סינכרוטרון שימש לחקר המבנה האלקטרוני של מולקולות וצבירי פאזה גזית.
הקרן המולקולרית, המשולבת עם קרינת סינכרוטרון, סיפקה שיטת יינון סלקטיבית לבדיקת מולקולות בשלב הגז.
הדגימה הוטענה לתוך הזרבובית, הזרבובית נטענה מחדש לתוך המכשיר, וקרן הפוטון הורשתה להיכנס לתא.
לאחר מכן נאסף ספקטרום המסה והושווה לנתוני יעילות פוטוניזציה על מנת לקבוע את המבנה האלקטרוני של מולקולות.
זה עתה צפיתם בהקדמה של JoVE לספקטרומטריית מסה. כעת עליך להבין את המכשור הבסיסי של ספקטרומטריית מסה, וכיצד להריץ ניתוח בסיסי המבוסס על ספקטרומטריית מסה.
תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the three main components of a mass spectrometer?
A mass spectrometer consists of an ionization source, a mass analyzer, and a detector. The ionization source converts sample compounds into gas phase ions, usually with a single positive charge. The mass analyzer separates ions based on their mass-to-charge ratio, and the detector measures the relative abundance of each ion type to generate the mass spectrum.
Q2: How do hard and soft ionization techniques differ in mass spectrometry?
Hard ionization techniques cause extensive fragmentation, producing many fragments of lower mass that aid in determining molecular structure. Soft ionization techniques result in little or almost no fragmentation, preserving high molecular mass ions. The choice depends on the analyte and desired fragmentation level, as excessive fragmentation can lose structural information while insufficient ionization may fail to detect small molecules.
Q3: What is the function of a magnetic sector in a mass analyzer?
A magnetic sector uses a curved magnet to produce a homogeneous magnetic field that separates ions based on their mass-to-charge ratio. Ions travel in a circular path determined by accelerating voltage, magnetic field strength, and m/z ratio. By scanning the magnetic field, specific ions reach the detector at different times, enabling precise identification of each species.
Q4: How does a quadrupole mass filter separate ions?
A quadrupole consists of two pairs of parallel metal rods with alternating direct current voltages that keep the rod pairs out of phase. Ions travel through the center in a corkscrew-like path due to constant attraction and repulsion from the rods. Depending on mass-to-charge ratio, ions either traverse the full path to reach the detector or crash into the rods and are lost.
Q5: What role does inductively coupled plasma play in mass spectrometry analysis?
Inductively coupled plasma (ICP) is a hard ionization method using argon plasma at approximately 10,000°C to ionize sample molecules. The plasma dries aerosol droplets, dissociates molecules, and removes electrons from components for detection. ICP-MS is commonly used to detect and quantify metal elements in samples, such as iron in nanoparticles, with calibration curves principles and applications guiding quantitative analysis.
Q6: Why is sample preparation important before ICP-MS analysis?
Sample preparation removes contaminating trace elements and ensures proper sample digestion. Samples are treated with hydrochloric acid to remove iron contamination, then digested in concentrated nitric acid overnight. The digested sample is diluted to achieve ideal parts-per-billion concentration range and centrifuged to remove residues, ensuring accurate detection and quantification of target elements.
Q7: What are common applications of different mass spectrometry ionization methods?
Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) is a soft ionization technique used to analyze high molecular weight proteins by stabilizing molecules with a matrix. Electron ionization is a hard ionization technique for analyzing volatile and oxidation-sensitive compounds. Synchrotron radiation coupled with molecular beam mass spectrometry selectively ionizes gas phase molecules to explore their electronic structure.