Name: זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: למד את טכניקת הפאף לניהול תרופות ברישום פאץ'-קלאמפ של תא שלם במוח פרוסות. שיטה זו מאפשרת עלייה מהירה בריכוז התרופה ומונעת דה-סנסיטיזציה של קולטנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות הארגונים הבאים: הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31171018, 31171355), מדע, טכנולוגיה החלוקה של גואנג-דונג (2013KJCX0054), בסיס מדעי הטבע של בפרובינצית גואנג-דונג ( 2014A030313418, 2014A030313440), ואת גואנגג'ואו מדע, טכנולוגיה הלשכה (201607010320).

דיור חיה ובהמה כל הניסויים נערכו בהתאם לנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים באוניברסיטה רגילה סין דרום, על פי הנחיות חיה אכפת שהוקם על ידי המכון הלאומי של בריאות-
 1. ההכנה של פתרונות <ol><li>להכין 500 מל סטנדרטי מלאכותי השדרתי (כלנית חדד) המכיל את הרכיבים שמתואר שלנו עבודה שפורסמה 7 כמפורט בטבלה 1.
	<ol><li>זכוכית נקי שימוש בקבוקונים עם מים יונים להכין פתרון חנה המבר טריים. יבש לפני השימוש כדי להוסיף NaH NaCl, אשלגן כלורי, ונקי שפכטלים עם מים יונים 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-גלוקוז, ולהוסיף את CaCl 2 לאחר נתקל מבעבע הפתרון עם 95% O 2 / 5% CO 2 התערובת ~ 20 דקות (כמו טבלה מפורטת ב 1) 500 מ של מים יונים. מערבבים עד להתמוססות מלאה.</li>
		<li>ודא חנה המבר אינו לגמרי נקה ללא משקעים כלשהם. ואז להתאים את ה-pH ל 7.2-7.4. בועה עם תערובת גז המורכבת של 95% O 2 ו- 5% CO 2 ~ 20 דק...</li>
	</ol></li> <li>להכין 250 מ של פתרון חיתוך פרוסה המכיל כימיקלים 7 המתוארות בטבלה 2.
	<ol><li>להוסיף אשלגן כלורי, MgCl 2, 2 PO NaH 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-גלוקוז, להוסיף CaCl 2 אחרונה כמצוין ב 1.1.1, 250 מ של מים יונים, להתמוסס כפי שמתואר ב 1.1.1 ו 1.1.2.</li>
		<li>לאחר שמבעבע עם 95% O 2 / 5% CO 2, המקום הפתרון במקפיא למשך 15-20 דקות כך הפתרון חיתוך הופך קר כקרח, קפוא חלקית. 
		הערה: אנו משתמשים פתרון חיתוך זה בעת ביצוע פרוסות מהחודש 1-2-עכברים הישן; הנוסחה עשויים להיות שונים עבור עכברים שגילן עולה על 2 חודשים-</li>
		<li>LPS להכין פתרון על ידי המסת בתוך תמיסת מלח ללא אנדוטוקסין מול סטרילי (0.9% NaCl). LPS הוא מנוהל intraperitoneally (0.5 מ ג/ק ג) ולהתחיל הקלטה שעתיים מאוחר יותר.</li>
	</ol></li></ol> 2. הכנה של פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית <ol><li>הפתרון חיתוך מוציאים מהמקפיא, homogenize כדי להשיג את הרפש. למקם את הפתרון על קרח, בועה כל הזמן עם 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
	<li>באמצעות מספריים גדולים, חדה, במהירות לערוף עכבר כפי שמתואר 9, מיד לשים את הראש לתוך גביע מלא קפואים (0-4 ° C) חיתוך פתרון.</li>
	<li>העליון של הגולגולת לאורך הקו האמצעי בכיוון סימטרית-כדי-אפיים עם מספריים בסדר גזורה להסיר את החלקים הגולגולת לרוחב. מסירים את המוח עם מרית בסדר, ירידה אל תוך קר כקרח חיתוך פתרון. 
	הערה: השלבים 2.2-2.3 חייב להיעשות במהירות (אידיאלי &#60; 1 דקות).</li>
	<li>במקום את המוח על המכסה של צלחת פטרי 9 ס מ מלא קרח. יש לשטוף את המוח עם פתרון חיתוך קר כקרח. לחתוך את המוח ואת הריח הנורה עם סכין גילוח.</li>
	מחזיק <li>החל הדבק דבק מגע אל הדגימה vibratome. בזהירות המקום הרחוב המוח על המסירה של דבק, rostral לקצה, ואני מיד לטבול בתמיסה קרה כקרח חיתוך.</li>
	<li>להתאים בעל להב vibratome כדי זווית של 15° ביחס במישור האופקי ולהכין 350-מיקרומטר פרוסות המוח הילתית (תדר הרטט להב = 85 הרץ, מהירות = 0.1 מ מ/s).</li>
	<li>משתמש של פיפטה, העברת הפרוסות לחדר התאוששות מלאה כלנית חדד, דגירה עבור 1 h (RT) עם בעבוע מתמדת של 95% O 2 / 5% CO 2.</li>
</ol> 3. הקלטה תיקון שלם-תא micropipettes <ol><li>להפוך זכוכית בורוסיליקט עבור משתמשים כמו הקלטה אלקטרודות או פחזנית micropipettes על פי הנחיות ספציפיות במדריך מבצע פולר. הקלטה אלקטרודות, עצה התנגדויות הן בטווח 4-6 מ' &#8486;, בעוד עלים micropipettes יש עצה קטרים בטווח של 2-5 מיקרומטר.</li>
	<li>להוסיף חוסם ערוץ Na + (TTX, 1 מיקרומטר), רחוב Na + מהיר ערוץ ובכך פוטנציאל פעולה, כדי כלנית חדד, לשמור על קצב זרימה מתמדת של פתרון זה של 2-3 mL/min בתא ההקלטה, על ידי משאבת סחרור לתוך החדר שאיפה מזה. בועה של כלנית חדד עם 95% O 2 / 5% CO 2 כל הזמן כדי להבטיח את הכדאיות של הפרוסות.</li>
	<li>העברת פרוסה המוח אל החדר הקלטה באמצעות פיפטה פסטר ששונה עצה בסדר אשר נחתך כדי להתאים את גודל הפרוסה. לכסות את הפרוסה עם עוגן פרוסה פלטינה עם חוטי ניילון מקבילים במרווחים &#8805; 2 מ מ לגזרים, להחזיק את הפרוסה על הרציף.</li>
	<li>למלא את micropipette הקלטה עם הפתרון הפנימי 7 (טבלה 3), ולמלא את micropipettes עלים עם GABA-10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, ו 100 מיקרומטר (מומס כלנית חדד), או חנה המבר כפקד הרכב.</li>
	<li>כדי למנוע סתימה עם פסולת, החל לחץ חיובי קל באמצעות מזרק 1 מ"ל לפני הטבעית האלקטרודה הקלטה ב חנה המבר. שימוש של micromanipulator תחת מיקרוסקופ (עדשה המטרה x 4), מקם את ההקלטה אלקטרודה ואת פאף micropipette כך הטיפים מופיעים במרכז של תמונת הוידיאו על המסך ( איור 1 א').</li>
	<li>להתאים את המוקד מיקרוסקופ (40 x עדשה המטרה) תוך כדי הנמכת בהדרגה את micropipette עלים ומניחים אותו מעל נוירון הקלטה בזווית של 45°. שמור על המרחק בין קצה micropipette עלים נוירון שנרשם בין 20-40 µm ( איור 1 B). לאט ובזהירות לגשת הנוירון עם האלקטרודה הקלטה ולאחר מכן שחרר את הלחץ. החלת יניקה חלש ולא קצרה דרך הצנרת מחובר למחזיק אלקטרודה ליצירת גושפנקה גיגה אוהם.</li>
	<li>שמור על המתח ב 0 mV. לאחר היווצרות החותם גיגה אוהם, לפצות על מהר ולאט קיבוליות באופן ידני או אוטומטי. לאחר מכן החל יניקה קצר וחזק דרך הצנרת הנ ל כדי להגיע למצב השלם-תא.</li>
	מצב <li>eIPSC רשומה במתח-קלאמפ. חלות לחץ דלק נמוך (חנקן, 4-6 psi) micropipette עלים באמצעות Picospritzer הנשלט על-ידי גנרטור שלב מתח מאסטר 8 כדי לספק יחיד או מזווג גאבא פחזניות ( איור 2).</li>
	<li>לשנות את המשך עלים כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר eIPSC ( איור 3) ולמדוד את eIPSC במודל דיכאון LPS-induced ( איור 4).</li>
</ol>

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+used+for+studying+synaptic+transmission+in+slices+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain.</a> Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).</li>
<li>Eyo, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+hyperactivity+recruits+microglial+processes+via+neuronal+NMDA+receptors+and+microglial+P2Y12+receptors+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus.</a> J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).</li>
<li>Dickinson, G. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+determining+the+recruitment+of+inositol+trisphosphate+receptor+channels+during+calcium+puffs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs.</a> Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Columnar+distribution+of+activity+dependent+gabaergic+depolarization+in+sensorimotor+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons.</a> Mol Brain. 5, 33(2012).</li>
<li>Glykys, J., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+main+source+of+ambient+GABA+responsible+for+tonic+inhibition+in+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus.</a> J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+modulates+KCC2+expression+and+function+in+hippocampal+GABAergic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+interleukin-1+and+endotoxin+in+the+forced+swim+and+tail+suspension+tests+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice.</a> Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).</li>
<li>Engel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Patch-clamp+Recordings+from+the+Somatodendritic+Domain+of+Nigral+Dopamine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Wondolowski, J., Frerking, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-dependent+postsynaptic+expression+of+kainate+receptors+on+hippocampal+interneurons+in+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1.</a> J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).</li>
<li>Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+regulates+Cav1.2+L-type+calcium+channel+levels+and+function+to+influence+GABAergic+short-term+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity.</a> J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).</li>
<li>Huo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Cortical+GABAergic+Dysfunction+Contributes+to+Aberrant+UP-State+Duration+in+APP+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice.</a> Cereb Cortex. , (2016).</li>
<li>Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+Acts+through+Nicotinic+Receptors+to+Enhance+the+Firing+Rate+of+a+Subset+of+Hypocretin+Neurons+in+the+Mouse+Hypothalamus+through+Distinct+Presynaptic+and+Postsynaptic+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms.</a> eNeuro. 2 (1), (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עלים היישום נעשה שימוש נרחב כדי להעריך את קולטן postsynaptic פונקציה3,4,7, אך דורש שליטה מדויקת ניסוי. נתאר כאן הליך לערב שלם-תא תיקון מחבר חובק למעקה, אשר מדגים ש-GABA-פאף המושרה IPSCs (קרי eIPSCs) פרוסות המוח הקדם חזיתית בקליפת המוח. התנגדותם של האלקטרודה הקלטה MΩ כ-5, בעוד הקוטר עצה של עלים micropipettes היא על 2-5 מיקרומטר. פאף לחץ הוא בין 4-6 psi: טווח זה הוא קריטי, כמו לחץ גבוה עלול לגרום נזקים עצביים, בזמן לחץ נמוך יכול ל...

הטכניקה תיקון-קלאמפ, כלי ראשי עבור חוקרים אותות חשמליים בנוירונים, פותחה בשנות ה-701,2. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ידע על טיפולים כמה ספציפית (למשל, תרופתי) רשאית לשנות פונקציות עצביים או ערוצים בזמן אמת3. תרופתי הערכה של תפקוד במהלך הקלטת בפרוסה במוח תאים כל דורש היישום של תרופות, כגון אגוניסטים או היריבים של רצפטורים ספציפיים, כדי הנוירונים מוקלטת. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים עצביים להתרחש בעקבות בקשה של תרופה ספציפית, ובכך מוביל הבנה טובה יותר של מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים4. למרות ניהול תרופתי יכול להתבצע באמצעות גם זלוף5 או עלים6, האחרון הוא טכניקה מעולה. בפרט: (i) פחזנית יישומים במהירות מגביר סמים ריכוז סביב מוקלטת הנוירון לרמה כזאת הפחתת רגישות של קולטני ממברנה נמנעת; (ii) את עוצמת הקול של סמים נשענתי הוא נמוך ביותר, כך שקיימת השפעה מועטה על הפתרון אמבט, ולפיכך מפחית תופעות בלתי רצויות של הכימיקלים מנוהלת על פרוסות המוח; (iii) פרוטוקול עלים ניתן להגדיר ונשמר, ביצוע הניסוי ברמת דיוק גבוהה ביותר לשחזור; (iv) עלים יישום מייצג שימוש חסכוני אגוניסטים/antagonists, במיוחד כאלה ריאגנטים איפה יקר או קשה להשיג.
כאן, אנו נתמקד להקליט זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאבא פרוסות המוח בחריפות מוכן, הכנה זה יש את היתרון של מעגלים המוח יחסית שמור היטב. התנהלותינו פאף-induced זרמי מעכבות7 שמתואר במאמר זה. באמצעות צסיום (Cs+)-מבוסס פתרונות פנימי, והחזקת הנוירונים ב 0 mV, תציג לנו גאבא. פאף עורר זרמי postsynaptic מעכבות (eIPSCs) עם הפרטים הטכניים המתאימים. באמצעות מודל של העכבר של דיכאון הנגרם על ידי הזרקת ליפופוליסכריד (LPS)8, אנו מראים את eIPSC משרעת עורר על ידי שאיפה גאבא פוחת באופן משמעותי בפרוסות של הזרקת LPS עכברים לעומת הרכב שולט. הכוונה שלנו היא כי מאמר זה צריך להראות איך הטכניקה עלים ישימה באופן נרחב על מחקרים שמטרתם הערכת ההשפעה של כימיקלים, תרכובות או סמים על הפעילות העצבית במוח פרוסות.

<table><tbody><tr><td>מכשירי תריס</td> <td>מיקרופיפטות בורוסיליקט מזכוכית</td><td>BF150-86-10</td><td>קוטר חיצוני 1.50 מ"מ; 0.86 מ"מ קוטר פנימי</td></tr><tr><td>מכשירי תריס</td><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>דגם P-97&nbsp;</td><td>חולץ מיקרופיפטה בוער/גבות</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטורים</td><td>מכשירי תריס</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>מגבר נשלט על ידי מחשב&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>מערכת רכישה דיגיטלית&nbsp;</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת הדמיה</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>2115001</td><td>מכשור פיקוח</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה&nbsp;</td><td>ניקון&nbsp;</td><td>ליקוי חמה FN1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מאסטר 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8 ממריץ</td><td></td>דופק</tr><tr><td>ויברטום פורס</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>ג'ילט</td><td>74-S</td><td>פליינג איגל</td></tr><tr><td>צג וידאו</td><td>Panasonic</td><td>WV-BM 1410</td><td></td></tr><tr><td>502 דבק</td><td>מעדנייה</td><td>7146</td><td>ציאנואקרילט דבק</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>שנחאי JIA PENG Corporation</td><td>BT100-1F</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת וידאו</td><td>אולימפוס אמריקה רפואית</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>פיפטס העברה</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr></tbody></table>

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של gaba במוח פרוסות

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

ניהול תרופתי הוא נפוץ בעת עריכת תיקון שלם-תא-הקלטה לפרוסות המוח קלאמפ. אחת השיטות הטובות ביותר של יישום סמים במהלך ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות היא הטכניקה פאף, אשר יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של ריאגנטים תרופתי על הפעילות העצבית במוח פרוסות. היתרון הגדול ביותר של יישום פאף הוא כי ריכוז התרופה סביב האתר הקלטה מגביר במהירות, ובכך למנוע הפחתת רגישות של קולטני ממברנה. שימוש מוצלח של יישום עלים כרוך תשומת-לב רבה הרכיבים הבאים: ריכוז התרופה, הפרמטרים של micropipette עלים, המרחק בין הקצה של micropipette עלים, נוירון מוקלט, וכן את משך הזמן ואת הלחץ נהיגה אצלם (פאונד לאינץ ' מרובע, psi). מאמר זה מתאר הליך שלב אחר שלב עבור הקלטה זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאמא אמינו בוטירית (GABA) אל נוירון פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית. ראוי לציין, ניתן להחיל את ההליך עם שינויים מזעריים באזורים אחרים במוח כגון ההיפוקמפוס סטריאטום את, תכשירים שונים, כגון תרביות תאים.

הטכניקה עלים מאפשר לחוקרים לחקור את השפעת הסמים על קולטנים מסוימים על פני השטח של נוירון מסוים. במאמר זה, אנו מתמקדים זרמי מתווך על ידי קולטני GABA. איור 1 מציג את micropipettes הקלטה של עלים. כדי למנוע השפעה על נוירונים מוקלטות של הלחץ הפיזי שנוצר על ידי והגראס, חנה המבר ומשמשים פחזניות סוכרוז (איור 2א) כפקדים. התגובה המושרה על ידי שאיפה גאבא (שחור) יכול להיחסם על ידי מעכב קולטן GABA, כגון picrotoxin כמו שדווח<s...

אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

המטרה הכוללת של טכניקת נשיפה זו היא לבצע את הניהול התרופתי ברישום מהדק טלאי של תא שלם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האלקטרופיזיולוגיה, כגון מתן פרמקולוגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שריכוז התרופה סביב אתר ההקלטה עולה במהירות, ובכך מונע דה-סנסיטיזציה של קולטני הממברנה.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת פרוסת קליפת המוח הקדם-מצחית החריפה והמיקום של מיקרופיפטה נשיפה הם קשים יחסית. כדי להתחיל בהליך זה, מרסקים את תמיסת החיתוך הקפואה לקבלת רפש. שמור את התמיסה הרפשית על קרח, ובעבע אותה ב-95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן, הניחו את הראש המנותח בכוס מלאה בתמיסת חיתוך קרה כקרח, והוציאו אותו לאחר מספר שניות. חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע בכיוון זנב-רוסטרלי בעזרת מספריים עדינים, ומסירים את חלקי הגולגולת לרוחב. לאחר מכן, הסר את המוח בעזרת מרית דקה, וזרוק אותו לתוך תמיסת החיתוך הקרה כקרח.לאחר מכן, הניחו את המוח על מכסה של צלחת פטרי בגודל תשעה סנטימטרים מלאה בקרח. שטפו את המוח בתמיסת חיתוך קרה כקרח. לאחר מכן, חתכו את המוח הקטן ואת נורת הריח בעזרת סכין גילוח.לאחר מכן, יש למרוח דבק ציאנואקרילט על מחזיק דגימת הוויברטום. הניחו בזהירות את גוש המוח על טיפת הדבק, כשהצד הרוסטרלי כלפי מעלה, וטבלו אותו מיד בתמיסת החיתוך הקרה כקרח. כוונן את מחזיק הלהב לזווית של 15 מעלות בהתייחס למישור האופקי.חתכו את רקמות המוח לפרוסות קורונליות של 350 מיקרון. לאחר מכן, העבירו את המגלשות לתא ההתאוששות המלא ב-ACSF, ודגרו אותן למשך שעה עם בעבוע קבוע של 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני. בניסוי שלנו, הכנת פרוסת קליפת המוח הקדם-מצחית החריפה היא גם קריטית בהליך.פרוסת מוח בריאה פירושה נוירונים פעילים שניתן לתקן בחוזקה. בהליך זה, הכינו מיקרופיפטות בורוסיליקט מזכוכית לשימוש כאלקטרודות הקלטה או מיקרופיפטות נשיפה. עבור אלקטרודות הקלטה, התנגדות הקצה היא בטווח של ארבעה עד שישה מגה-אוהם, בעוד שלמיקרו-פיפטות נשיפה יש קוטר קצה בטווח של שניים עד חמישה מיקרומטרים.הוסף חוסם תעלות סודיון ל-ACSF כדי לחסום ערוץ סודיון מהיר ובכך פוטנציאל פעולה, ולשמור על קצב זרימה קבוע של תמיסה זו של שניים עד שלושה מיליליטר לדקה בתא ההקלטה. מבעבעים את ה- ACSF עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני כל הזמן כדי להבטיח את כדאיות הפרוסות. העבירו פרוסת מוח לתא ההקלטה, בעזרת פיפטה של פסטר עם קצה דק שנחתך כך שיתאים לגודל הפרוסה.לאחר מכן, הניחו עוגן פרוסת פלטינה מעל הפרוסה כדי להחזיק אותה על הרציף. לאחר מכן, מלאו את המיקרו-פיפטות ההקלטה בתמיסה פנימית, ומלאו את המיקרופיפטות הנשיפות ב-GABA ב-10 מיקרו-מולר, 50 מיקרומולר ו-100 מיקרומולר, או ACSF כבקרת רכב. כדי למנוע סתימה עם פסולת, הפעל לחץ חיובי קל באמצעות מזרק של מיליליטר אחד לפני טבילת אלקטרודת ההקלטה ב-ACSF.תחת מיקרוסקופ, מקם את אלקטרודת ההקלטה ואת המיקרופיפטה כך שהקצות יופיעו במרכז הצג. לאחר מכן, זהו תא עצב מטרה. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ תוך הורדה הדרגתית של המיקרופיפטה, והנח אותו מעל נוירון ההקלטה בזווית של 45 מעלות.שמור על המרחק בין קצה המיקרופיפטה לנוירון המטרה בטווח של 20 עד 40 מיקרומטר. התקרב לאט ובזהירות לנוירון עם אלקטרודת ההקלטה, ואז שחרר את הלחץ החיובי. הפעל יניקה חלשה וקצרה דרך הצינור המחובר למחזיק האלקטרודה כדי ליצור איטום ג'יגה-אום.שמור על המתח באפס מילי-וולט. לאחר היווצרות אטם הג'יגה-אום, פצה את הקיבול המהיר והאיטי באופן ידני או אוטומטי. לאחר מכן, הפעל יניקה קצרה וחזקה דרך הצינור כדי לפרוץ למצב של כל התא.לאחר מכן, רשום זרמי IPSC מעוררים במצב מהדק מתח. ספק נשיפות GABA בודדות או זוגיות דרך המיקרופיפטה הנשלטת על ידי מחולל צעדי מתח Master-8. שנה את משך הנשיפה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר של זרמי IPSC מעוררים, ומדוד את זרמי ה-IPSC המעוררים במודל הדיכאון המושרה על ידי LPS.מוצגים כאן, ה-IPSCs לדוגמה המושרים על ידי 10, 50 ו-100 GABA מיקרו-מולרי. והנה עקומות התגובה של משך הנשיפה. הזרמים החוזרים על עצמם שמעורר GABA ב-50 נשיפות מיקרו-מולאריות במרווחי נשיפה של שנייה, שתיים או שלוש שניות מוצגים כאן.שליטה אחת, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשיג פרוסות מוח בריאות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הניהול הפרמקולוגי לחקור את השפעת התרופה באלקטרופיזיולוגיה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את הניהול התרופתי בהקלטת מהדק תיקון של תא שלם. אל תשכח שעבודה עם TTX עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.

whole-cell-currents-induced-puff-application-gaba-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו משתמשים בטכניקה תיקון-clamp למדוד GABA המופעל יחיד ערוץ זרמים (GABAA ערוצים, קולטנים GABAA) לבין זרמים סינפטיים טוניק שהם מייצרים בנוירונים. הפעלת ערוצי פוחתת רגישות עצבית בבריאות...

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

סרטון זה מדגים את ההקלטה של זרמים שלמים בתאים המושרים על ידי חומצה גמא-אמינובוטירית, או GABA, בפרוסת מוח קליפת המוח הקדם-מצחית של עכבר. העברה מבוקרת של GABA פותחת תעלות כלוריד בנוירון פוסט-סינפטי, ויוצרת זרמים פוסט-סינפטיים מעכבים, או IPSCs. IPSCs אלה גדלים עם ריכוזי GABA גבוהים יותר, המשקפים את הפעילות המעכבת של GABA על שידור סינפטי.

הקלטת זרמים של תאים שלמים עם התנשפות GABA בפרוסת מוח של עכבר

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

תנודות הן מאפייני רשת בסיסיים והם מווסתים על ידי מחלה ותרופות. לומד תנודות המוח פרוסה מאפשר אפיון של רשתות מבודדות בתנאים מבוקרים. פרוטוקולים ניתנים להכנת פרוסות מוח חריפות ללעורר תנודות γ CA1.

דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic

פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

מודלים התקף אקוטי חשובים ללמוד המנגנונים אפילפטית אירועים. יתר על כן, היכולת להפיק אפילפטית אירועים לפי-דרישה מספק שיטה יעילה במיוחד ללמוד רצף האירועים שבבסיס בהכנסתם המדויק. כאן, אנו מתארים את הדגמים פרכוס קורטיקלית פמפרידין חריפה נוסדה בשנת רקמה אנושית של עכבר.

חניכה הדור, על פי דרישה חריפה פעילות התקפי. מכרסם, רקמה אנושית

כאן, אנו מתארים את השלבים החיוניים להקלטות תאים כל תיקון-קלאמפ זני הסובסטנציה gelatinosa (SG) נוירונים בתוך הפרוסה חוט שדרה במבחנה . שיטה זו מאפשרת את מאפייני קרום פנימי, הסינאפסית ואפיון מורפולוגי של ס ג נוירונים שילמדו.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

הפרוטוקול המוצג מתאר את ההובלה וההכנה של רקמת היפוקמפוס אנושית חתוכה במטרה האולטימטיבית להשתמש פרוסות מוח חיוניות ככלי הערכה פרה-קרטילי עבור חומרים אנטי אפילפטיים פוטנציאליים.

הכנת פרוסות היפוקמפוס אנושיות חריפות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

למד את טכניקת הפאף לניהול תרופות ברישום פאץ'-קלאמפ של תא שלם במוח פרוסות. שיטה זו מאפשרת עלייה מהירה בריכוז התרופה ומונעת דה-סנסיטיזציה של קולטנים.

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

גלה סרטונים נוספים