זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

המטרה הכוללת של טכניקת נשיפה זו היא לבצע את הניהול התרופתי ברישום מהדק טלאי של תא שלם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האלקטרופיזיולוגיה, כגון מתן פרמקולוגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שריכוז התרופה סביב אתר ההקלטה עולה במהירות, ובכך מונע דה-סנסיטיזציה של קולטני הממברנה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכנת פרוסת קליפת המוח הקדם-מצחית החריפה והמיקום של מיקרופיפטה נשיפה הם קשים יחסית. כדי להתחיל בהליך זה, מרסקים את תמיסת החיתוך הקפואה לקבלת רפש. שמור את התמיסה הרפשית על קרח, ובעבע אותה ב-95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני.

לאחר מכן, הניחו את הראש המנותח בכוס מלאה בתמיסת חיתוך קרה כקרח, והוציאו אותו לאחר מספר שניות. חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע בכיוון זנב-רוסטרלי בעזרת מספריים עדינים, ומסירים את חלקי הגולגולת לרוחב. לאחר מכן, הסר את המוח בעזרת מרית דקה, וזרוק אותו לתוך תמיסת החיתוך הקרה כקרח.

לאחר מכן, הניחו את המוח על מכסה של צלחת פטרי בגודל תשעה סנטימטרים מלאה בקרח. שטפו את המוח בתמיסת חיתוך קרה כקרח. לאחר מכן, חתכו את המוח הקטן ואת נורת הריח בעזרת סכין גילוח.

לאחר מכן, יש למרוח דבק ציאנואקרילט על מחזיק דגימת הוויברטום. הניחו בזהירות את גוש המוח על טיפת הדבק, כשהצד הרוסטרלי כלפי מעלה, וטבלו אותו מיד בתמיסת החיתוך הקרה כקרח. כוונן את מחזיק הלהב לזווית של 15 מעלות בהתייחס למישור האופקי.

חתכו את רקמות המוח לפרוסות קורונליות של 350 מיקרון. לאחר מכן, העבירו את המגלשות לתא ההתאוששות המלא ב-ACSF, ודגרו אותן למשך שעה עם בעבוע קבוע של 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני. בניסוי שלנו, הכנת פרוסת קליפת המוח הקדם-מצחית החריפה היא גם קריטית בהליך.

פרוסת מוח בריאה פירושה נוירונים פעילים שניתן לתקן בחוזקה. בהליך זה, הכינו מיקרופיפטות בורוסיליקט מזכוכית לשימוש כאלקטרודות הקלטה או מיקרופיפטות נשיפה. עבור אלקטרודות הקלטה, התנגדות הקצה היא בטווח של ארבעה עד שישה מגה-אוהם, בעוד שלמיקרו-פיפטות נשיפה יש קוטר קצה בטווח של שניים עד חמישה מיקרומטרים.

הוסף חוסם תעלות סודיון ל-ACSF כדי לחסום ערוץ סודיון מהיר ובכך פוטנציאל פעולה, ולשמור על קצב זרימה קבוע של תמיסה זו של שניים עד שלושה מיליליטר לדקה בתא ההקלטה. מבעבעים את ה- ACSF עם 95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני כל הזמן כדי להבטיח את כדאיות הפרוסות. העבירו פרוסת מוח לתא ההקלטה, בעזרת פיפטה של פסטר עם קצה דק שנחתך כך שיתאים לגודל הפרוסה.

לאחר מכן, הניחו עוגן פרוסת פלטינה מעל הפרוסה כדי להחזיק אותה על הרציף. לאחר מכן, מלאו את המיקרו-פיפטות ההקלטה בתמיסה פנימית, ומלאו את המיקרופיפטות הנשיפות ב-GABA ב-10 מיקרו-מולר, 50 מיקרומולר ו-100 מיקרומולר, או ACSF כבקרת רכב. כדי למנוע סתימה עם פסולת, הפעל לחץ חיובי קל באמצעות מזרק של מיליליטר אחד לפני טבילת אלקטרודת ההקלטה ב-ACSF.

תחת מיקרוסקופ, מקם את אלקטרודת ההקלטה ואת המיקרופיפטה כך שהקצות יופיעו במרכז הצג. לאחר מכן, זהו תא עצב מטרה. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ תוך הורדה הדרגתית של המיקרופיפטה, והנח אותו מעל נוירון ההקלטה בזווית של 45 מעלות.

שמור על המרחק בין קצה המיקרופיפטה לנוירון המטרה בטווח של 20 עד 40 מיקרומטר. התקרב לאט ובזהירות לנוירון עם אלקטרודת ההקלטה, ואז שחרר את הלחץ החיובי. הפעל יניקה חלשה וקצרה דרך הצינור המחובר למחזיק האלקטרודה כדי ליצור איטום ג'יגה-אום.

שמור על המתח באפס מילי-וולט. לאחר היווצרות אטם הג'יגה-אום, פצה את הקיבול המהיר והאיטי באופן ידני או אוטומטי. לאחר מכן, הפעל יניקה קצרה וחזקה דרך הצינור כדי לפרוץ למצב של כל התא.

לאחר מכן, רשום זרמי IPSC מעוררים במצב מהדק מתח. ספק נשיפות GABA בודדות או זוגיות דרך המיקרופיפטה הנשלטת על ידי מחולל צעדי מתח Master-8. שנה את משך הנשיפה כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר של זרמי IPSC מעוררים, ומדוד את זרמי ה-IPSC המעוררים במודל הדיכאון המושרה על ידי LPS.

מוצגים כאן, ה-IPSCs לדוגמה המושרים על ידי 10, 50 ו-100 GABA מיקרו-מולרי. והנה עקומות התגובה של משך הנשיפה. הזרמים החוזרים על עצמם שמעורר GABA ב-50 נשיפות מיקרו-מולאריות במרווחי נשיפה של שנייה, שתיים או שלוש שניות מוצגים כאן.

שליטה אחת, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשיג פרוסות מוח בריאות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הניהול הפרמקולוגי לחקור את השפעת התרופה באלקטרופיזיולוגיה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את הניהול התרופתי בהקלטת מהדק תיקון של תא שלם. אל תשכח שעבודה עם TTX עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, בעת ביצוע הליך זה.