שבב מבוסס תלת ממדי נייד תרבות Micro-bioreactors perfused
21 במאי 2008
אנו מתארים פלטפורמת השבבים מבוססי לעיבוד תלת ממדי של תאים מיקרו bioreactors. אחת שבב יכול בית עד 10 Mio. תאים שיכולים להיות מעובדים בתנאים מוגדרים במדויק לגבי זרימת נוזלים, מתח וכו 'חמצן בלולאה, סטרילי במחזור סגור.
שלום, אני אריק גוטוולד ואני מדען מחקר במכון לממשקים ביולוגיים של מכון הטכנולוגיה וור (Ware Institute of Technology). והיום אני מעוניין להציג בפניכם את המערכת המיקרו-ביו-אקטיבית מבוססת השבב עם זרימה רציפה שלנו. לפני שנוכל להשתמש בשבב ביישומים של תרביות תאים, עלינו לבצע הידרוליזה לפולימר ולבצע דגראציה לאזור בעל המבנה המיקרוסקופי.
דבר זה מושג על ידי טבילה של השבב בריכוזים שונים של איזופרופנול, החל מ-100%. אני טובל את השבב למשך מספר שניות בודדות בכל ריכוז, והשלב הסופי הוא מים בלבד. לאחר מכן, השבב מיובש ולבסוף עלינו לצפות את השבב בתמיסת collagen one כדי להקל על היצמדות התאים לפולימר. פעולה זו מבוצעת על ידי טפטוף של מספר טיפות בודדות של תמיסת collagen one על גבי האזור בעל המבנה המיקרוסקופי, ובמצב זה, השבב מדוגר בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה.
לאחר דגירה למשך לילה עם תמיסת הקולגן one, מסירים את התמיסה ושוטפים את השבב עם PBS סטרילי. לאחר מכן, מסירים גם את ה-PBS והשבב מוכן כעת להחדרת התאים. כעת נחדיר לשבב התאים סספנזיה של תאים בודדים, וזאת על ידי הנחת 150 µL של סספנזיית תאים מעל האזור בעל המבנה המיקרוסקופי. לאחר השקיעת התאים, מדגרי את השבב למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור.
לאחר תקופת דגירה של שלוש שעות, מוציאים את השבב מהמדגרה והוא מוכן כעת להכנסה לתוך ה-ector. לשם כך, מוציאים את ה-ector מאריזתו הסטרילית, כאשר הסטריליות הושגה באמצעות הקרנת גמא של רדיד השקיפות. לכן, עלינו רק לפתוח את האריזה ולהוציא את ה-ector.
בשלב הבא, נכניס את חלקו העליון של הבקבוק אל מאגר המדיום, כדי שנוכל לפרק את מעטפת הביוראקטור לצורך הכנסת השבב. לאחר פתיחת מעטפת הביוראקטור, ניתן כעת להכניס את השבב, זאת על ידי הנחתו בתוך החריץ של מעטפת הביוראקטור, ולאחר מכן ניתן להרכיב את הביוראקטור מחדש. לסיום, עלינו לחבר שני מסננים סטריליים למאגר המדיום ופתח דגימה סטרילי אחד.
למדידת מתח החמצן בפועל בלולאת הסירקולציה הסגורה, נכניס שני חיישני חמצן על ידי התקנתם בין שני המחברים הללו. הבקטור מוכן כעת למילוי במצע תרבית. מערכת הבקטור מוכנה כעת למילוי במצע תרבית תאים, ודבר זה מושג פשוט על ידי חיבור לולאת הסירקולציה הסגורה למשאבת הגלילים.
בדרך זו, נוריד בו-זמנית את קצב כל סירקולציית הביאקטור (bactor). כפי שניתן לראות כאן בחלון ה-Ector, ניתן לראות את המדיום עולה מלמטה, עולה ועולה, ועוזב את הביאקטור בחלקו העליון. לפני שנניח את מערכת הביאקטור בתוך האינקובטור, נבצע בקרה למילוי נטול בועות של לולאת הסירקולציה.
כעת המערכת מלאה לחלוטין במצע לתרבית תאים וניתן להעביר את הביוראקטור לאנקובטור. כעת נניח את הביוראקטור לתא הדגירה. לשם כך, ראשית, הביוראקטור מחובר למשאבה הגלילית, כפי שראיתם לפני זמן קצר, וכעת הביוראקטור עובר פרפוזיה פעילה של המצע מהבקבוק.
וכדי לשמור על ריכוז החמצן בסביבה, נחבר את מאגר המצע לאספקת הגז. ולסיום, נחבר שני חיישני חמצן למערכת הסירקולציה כדי לנטר באופן מקוון (online) את מתח החמצן במערכת. כעת ההתקנה הושלמה והיא יכולה לפעול למשך הזמן שתוכנן עבור הניסוי.
אחד הכלים העוצמתיים ביותר במהלך ניתוח הפונקציות האורגנוטיפיות של התאים בתוך מכלי ה-MicroCon הוא מיקרוסקופ הסריקה הלייזרי, שניתן לראות כאן. מיקרוסקופ הסריקה הלייזרי מעניק לנו את ההזדמנות לבחון כל מכל MicroCon בודד ללא הרס. ומכיוון שניתן להשתמש במכלי ה-MicroCon או בצ'יפ לשיטות צביעה אימונולוגית קונבנציונליות ושיטות אימונופלואורסצנציה, אנו יכולים לזהות סוגים שונים של מרקרים ופונקציות אורגנוטיפיות בתוך המיקרו-מכלים.
כפי שניתן לראות כאן, באנימציה של שבב זה, התחתית מלאה לחלוטין בתאים, כמו גם דפנות מיכל ה-MicroCon. יש לנו שפע של תאים החיים למדי, ומספר מועט מאוד של תאים מתים. התמונה הבאה מראה שניתן לזהות את כל סוגי התפקודים האורגנוטיפיים בתוך מיכל ה-MicroCon.
לדוגמה, עבור הפטוציטים, ניתן לראות כאן בצורה ברורה בחפיפה את ייצור האלבומין או את הביטוי של E-cadherin בתאים. הגרעין צבוע בכחול, ה-E-cadherin צבוע בירוק, והאלבומין מבוטא או צבוע באדום.
וכפי שניתן לראות כאן בבירור, כל הפונקציות האורגנוטיפיות המצופות מהפטוציטים באות לידי ביטוי בצורה טובה בסוג זה של תרבית תלת-ממדית (3D). בנוסף, בחנו מרקר הפטוציטים נוסף, והוא cytokeratin 18, ותמונה זו מראה שגם Cytokeratin 18 מובע היטב בסוגי תרביות אלו. אני מקווה שזה משכנע אתכם שפונקציות אורגנוטיפיות מסוג זה עשויות להיות מועילות גם עבור תרביות אורגנוטיפיות אחרות.
לאחר סיום ניסוי ה-Biore, ניתן להשתמש בשבב לבידוד של סוגים שונים של רכיבים תאיים, כגון total RNA. כפי שניתן לראות כאן, אנו מציגים את ה-total RNA שהבודד ממערכת הביוריאקטור. ניתן להשתמש ב-total RNA זה ליישומים המשכיים, כגון realtime PCR, או כפי שניתן לראות כאן, ניתוח microarray.
יתרה מכך, ניתן לבודד תאים שלמים מהמערכת ולהשתמש בתאים אלו להמשך אנליזה בשיטת flow cytometry קונבנציונלית. כפי שניתן לראות כאן, אני מקווה שהצלחנו להראות שהמערכת עשויה להועיל למגוון רחב של יישומים הדורשים תגובות אורגנוטיפיות, וכן שהמערכת עשויה להועיל לכל אותם סוגי יישומים שטרם שקלנו עד כה, כגון יישומים בתחום תאי הגזע.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פלטפורמה מבוססת שבב שנועדה לגידול תלת-ממדי של תאים במיקרו-ביוראקטורים. המערכת מאפשרת גידול של עד 10 מיליון תאים בתנאים מבוקרים בתוך לולאת סירקולציה סגורה וסטרילית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרבית תאים
- טכנולוגיית מיקרו-ביוראקטור
- ביוטכנולוגיה
רקע
- מיקרו-ביוראקטורים מאפשרים בקרה מדויקת על סביבות תרבית תאים.
- תרביות תאים תלת-ממדיות יכולות לדמות טוב יותר תנאים in vivo.
- הידרוליזה של פולימרים חיונית להכנת השבב.
- ציפוי קולגןן משפר את היצמדות התאים לאזור בעל המבנה המיקרוסקופי.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת מבוססת שבב לגידול תאים יעיל.
- אספקת פלטפורמה למחקר תגובות תאיות בסביבה מבוקרת.
- סיוע לגידול תאים בצפיפות גבוהה בפורמט קומפקטי.
שיטות שהשתמשו בהן
- הידרוליזה של שבב הפולימר באמצעות ריכוזים משתנים של איזופרופנול.
- ייבוש וציפוי של השבב בתמיסת קולגן.
- אינקובציה של השבב המצופה בטמפרטורות נמוכות כדי לקדם היצמדות תאים.
- שימוש בלולאת סירקולציה סגורה לצורך שמירה על תנאים סטריליים.
תוצאות עיקריות
- השבב תומך בהצלחה בגידול של עד 10 מיליון תאים.
- תנאים מבוקרים נשמרו לאורך כל תהליך הגידול.
- היצמדות התאים השתפרה באופן משמעותי באמצעות ציפוי קולגן.
- המערכת הדגימה פוטנציאל ליישומים שונים של תרביות תאים.
מסקנות
- הפלטפורמה המבוססת על שבב שפותחה יעילה לתרבית תאים תלת-ממדית.
- היא מציעה כלי רב-גמיש לחוקרים בביולוגיה של התא ובביוטכנולוגיה.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בדיקות תרופות והנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרבית תאים תלת-ממדית מבוססת שבב בביוראקטורים זעירים עם פרפוזיה מאפשרת צמיחת תאים בצפיפות גבוהה ובאופי אורגנוטי תחת תנאים מבוקרים ורלוונטיים פיזיולוגית. פלטפורמה זו נותנת מענה לצורך במודלים חיזויים in vitro המגשרים על הפער בין תרביות חד-שכבתיות מסורתיות למערכות in vivo, ותומכת בגילוי מוקדם ובמחקר תרגומי. המודולריות שלה והתאימות לאנליטיקה מתקדמת ממצבות אותה כנכס רב-פעמי עבור יוזמות מו"פ ברוחב הפורטפוליו.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- תומך בבדיקה של היפותזות טיפוליות בסביבה תלת-ממדית (3D) אורגנוטיפית.
- מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות שימור ומדידה של סמנים ספציפיים לאיבר.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שמירה על חיוניות ותפקוד התאים לאורך תקופות ממושכות.
- מספק פלטפורמה להערכת שינויים בביטוי גנים הרלוונטיים למודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביולוגיות תלת-ממדיות (3D) שעברו תיקוף לצורך תהליכי סריקת תרכובות המשך.
- מאפשר קריאות כמותיות הניתנות לשחזור באמצעות אימונופלורסצנציה ובדיקות מולקולריות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובמדרגיות עבור אנליזה בעלת תוכן גבוה (high-content analysis).
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות בהקשרים רלוונטיים פיזיולוגית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי שימור תפקודי איברים (organotypic), כגון ייצור albumin וביטוי סמנים.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה בתרביות תאים ארוכות טווח ובאנליזות המשך.
- מסייע בקבלת החלטאות קידום מותאמות סיכון באמצעות נתונים in vitro חזקים וניבויים.
- תומך בעבודה חקרנית בדיפרנציאציה של תאי גזע ובמידול איברי (organotypic).
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
מערכת תרבית תלת-ממדית מבוססת שבב זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת בדיקת היפותזות, תיקוף מטרות ומחקר תרגומי בתוך פלטפורמה אחת.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת סביבה מבוקרת לבחינת היפותזות ביולוגיות ולהבהרת תפקודי מסלולים.
- סריקה: מספקת תרביות תלת-ממדיות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה לצורך הערכה כמותית של תרכובות.
- אנליטיקה: תומכת בדימות בעל תוכן גבוה, בפרופיל מולקולרי ובציטומטריית זרימה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: שומרת על תפקודים אורגנוטיפיים וביטוי של סמנים ביולוגיים לצורך מידול רלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה מערכת מודולרית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה למספר תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החוזאי ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי מחקר מוקדמים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה בתרביות תלת-ממדיות ושיפור השחזוריות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות להמשך או הפסקה (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים חסונים in vitro.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של מועמדים בהתבסס על ראיות רלוונטיות פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים תלת-ממדיות ובתפעול מערכות מיקרופלואידיות.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית סריקה בלייזר ולתשתיות לניתוח מולקולרי.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנת השבבים ולפרוטוקולים אנליטיים.
- ניתן להתאים לסוגי תאים שונים, כולל תאים ראשוניים ותאי גזע, באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מוגבל בשל הצורך ברכיבי ביו-ריאקטור ייעודיים ובניהול תהליכי עבודה סטריליים.
