סינתזה של ליבה-קליפה מסטול לנתניד Upconversion Nanocrystals עבור אפליקציות לסלולר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנתז ננו-גבישי המרה מסוממים במעטפת לנתניד המבוססים על גישת משקעים בטמפרטורה גבוהה ולבצע שינויים במשטח תואמים ביולוגית המאפשרים יישומים תאיים נוספים. בשנים האחרונות, המעבדה שלנו פיתחה המרה ייחודית מאוד של ננו-גבישים מסוממים בלנתניד, שהצביעה על תכונות אופטיות ייחודיות מאוד, כך שיכולה לספוג אור אינפרא אדום באורכי גל ארוכים ובעצם להמיר את האור הזה לפליטות צבעוניות בטווח אורכי גל קצר, כולל UV הנראה אפילו לחלונות האור האינפרא אדום. מבני ננו-גבישים ייחודיים כאלה הצביעו על תכונות מבטיחות מאוד ליישומים ביו-רפואיים.

שיטה זו מספקת גישה אפשרית לסינתזה של ננו-מבנים המרת מעטפת ליבה וטכניקת שינוי פני השטח הביו-תואמת שלהם לוויסות חלבון תעלת קרום שער אור על תאורת אור אינפרא אדום קרוב. כדי להתחיל בהליך, הכינו תמיסות מלאי של מתחמי אצטט אדמה נדירה במתנול. הכן תמיסות של 20 מיליגרם למיליליטר של נתרן הידרוקסיד ואמוניום פלואוריד במתנול.

אחסן את פתרונות המלאי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, פיפטה שלושה מיליליטר של חומצה אולאית ושבעה מיליליטר של 1-אוקטדצן לבקבוק תחתון עגול של 50 מיליליטר, שלושה צווארים. הוסף לכך, 1.089 מיליליטר של תמיסת איטריום אצטט, 0.608 מיליליטר של תמיסת איטרביום אצטט, 83.6 מיקרוליטר של תמיסת תוליום אצטט ו-128.5 מיקרוליטר של תמיסת ניאודימיום אצטט.

ציידו את הבקבוק במוט ערבוב ובמדחום. מחממים את הבקבוק ל-100 מעלות צלזיוס באמבט שמן תוך כדי ערבוב עד שהמתנול מתאדה. לאחר מכן, חבר את הבקבוק לקו שלנק, ושאב את הבקבוק למשך שתיים-שלוש דקות כדי להסיר שאריות מתנול.

לאחר מכן, הניחו את הבקבוק מתחת לאטמוספירה של חנקן. מחממים את תערובת התגובה בחום של 150 מעלות צלזיוס למשך שעה תוך ערבוב בחום של 700 סל"ד. לאחר מכן, הניחו לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הניחו בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר שני מיליליטר מתמיסת מלאי הנתרן הידרוקסיד ו-2.965 מיליליטר מתמיסת מלאי האמוניום פלואוריד. מכסים היטב את הצינור, ומערבלים את תערובת הנתרן הידרוקסיד והאמוניום פלואוריד למשך חמש שניות. במהלך חמש דקות, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף לאט את תערובת הנתרן הידרוקסיד-אמוניום פלואוריד לבקבוק התגובה תוך כדי ערבוב.

לאחר מכן, מחממים את תערובת התגובה ללא יותר מ- 50 מעלות צלזיוס. החזיקו את התערובת בטמפרטורה זו למשך 30 דקות. לאחר מכן, מחממים את התערובת ל-100 מעלות צלזיוס כדי לאדות את המתנול.

חבר את הבקבוק לקו שלנק, והסר שאריות מתנול בוואקום למשך שתיים-שלוש דקות. ממלאים את הבקבוק בגז חנקן, ומחממים את תערובת התגובה ל -290 מעלות צלזיוס בחמש מעלות צלזיוס לדקה. החזיקו את התערובת בטמפרטורה של 290 מעלות צלזיוס או מעט מעל למשך שעה וחצי.

לאחר מכן, הניחו לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב. העבירו את תערובת המוצר לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. שוטפים את השאריות לתוך הצינור עם 30 מיליליטר אתנול.

צנטריפוגה את התערובת בחום של 4, 000 פעמים גרם למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט, ופזרו את המוצקים ב-10 מיליליטר הקסנים על ידי סוניקציה למשך שתי דקות. הוסף 30 מיליליטר אתנול לפיזור, צנטריפוגה את התערובת שוב באותם תנאים והשליך את הסופרנטנט.

פזרו את המוצקים בחמישה מיליליטר הקסנים, ואחסנו את הפיזור בארבע מעלות צלזיוס. בדוק את הפליטה המומרת של תמיסת UCNs במעטפת הליבה בהקרנת לייזר של 808 ננומטר בחושך. כדי להתחיל בהכנת UCNs שעברו שינוי DBCO, שטפו את הננו-גבישים המוכנים במעטפת הליבה ב-30 מיליליטר אתנול על ידי צנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 10 מיליליטר של תמיסה מימית של חומצה הידרוכלורית. סוניקציה של התערובת למשך 30 דקות כדי להמיס את המוצקים. מעבירים את התערובת לבקבוקון זכוכית, ומערבבים במרץ במשך שעתיים.

לאחר מכן, שטפו את התערובת בארבע מנות של 30 מיליליטר של אתר דיאתיל. שלב את שברי האתר, והניח בצד את השכבה המימית השטופה. שחזר UCNs נטולי עקבות ליגנד משכבות האתר עם 10 מיליליטר מים נטולי יונים, ושלב את השכבות המימיות.

מוסיפים 20 מיליליטר אצטון לשכבות המימיות המשולבות, ומערבלים את התערובת למשך חמש שניות. צנטריפוגה את התערובת בחום של 35, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט, והמיסו את המשקעים בשני מיליליטר של מים נטולי יונים כדי לקבל תמיסה של UCNs נטולי ליגנד.

לאחר מכן, ממיסים 200 מיליגרם של חומצה פוליאקרילית ב -20 מיליליטר מים נטולי יונים על ידי סוניקציה למשך 20 דקות. הוסף לכך את הפתרון של UCNs נטולי ליגנד תוך ערבוב נמרץ. התאם את התערובת pH ל-7.4 עם תמיסה מולרית אחת של נתרן הידרוקסיד.

סוניקציה של התערובת למשך 30 דקות, וערבבו את התערובת במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת ב 35, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות. שוטפים את המוצקים על ידי צנטריפוגה ב -10 מיליליטר מים נטולי יונים ארבע פעמים.

פזרו את המוצקים השטופים בשמונה מיליליטר של מים נטולי יונים כדי לקבל תמיסה של 10 מיליגרם למיליליטר של UCNs שעברו שינוי פולימרי. צנטריפוגה מיליגרם אחד של UCNs שעברו שינוי פולימרי ב-35,000 פעמים גרם למשך 10 דקות. אחסן את התמיסה הנותרת בארבע מעלות צלזיוס.

שטפו את המוצקים על ידי צנטריפוגה במנות של מיליליטר אחד של DMF יבש שלוש פעמים. לאחר מכן, ממיסים את המשקעים ב -200 מיקרוליטר של DMF יבש. הוסף לתמיסה זו 12.2 מיליגרם של HOBT, 14 מיליגרם של EDC, חמישה מיליגרם של DBCO-אמין ו-16 מיקרוליטר של DIPEA.

מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה את התערובת למשך 10 דקות בחום של 35, 000 פעמים גרם. שטפו את המוצקים ארבע פעמים על ידי צנטריפוגה במנות של מיליליטר אחד של DMSO.

פזרו את ה-UCNs שעברו שינוי DBCO ב-0.2 מיליליטר של DMSO, ואחסנו את הפיזור בארבע מעלות צלזיוס. ראשית, זרעו פעם אחת 10 את תאי ה-HEK293 החמישיים בצלחת של 12 בארות, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, בצינור מיקרוצנטריפוגה, שלב מיקרוגרם אחד של הפלסמיד הנבחר עם שני מיקרוליטר של חומר טרנספקציה P3000 ב -100 מיקרוליטר של MEM.

בצינור מיקרו-צנטריפוגה אחר, שלב 1.5 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה עם 100 מיקרוליטר MEM. דוגרים על שתי התערובות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, שלבו את התערובות, והוסיפו 400 מיקרוליטר של MEM דל סרום.

לאחר מכן, שטפו את התאים המודגרים פעמיים במנות של מיליליטר אחד של DMEM ללא סרום. מחלקים את תערובת הטרנספקציה של 600 מיקרוליטר לבארות של צלחת 12 הבארות. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

לאחר מכן, הסר את המדיום ושטוף את התאים פעמיים במנות של מיליליטר אחד של DMEM. לחלק בין הבארות מיליליטר אחד של תמיסת N-azidoacetyl-mannosamine עם טטרה-אצטילציה ב-DMEM. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים.

לאחר מכן, שטפו, טריפסינים ותרבו מחדש את התאים בכלי קונפוקלי למשך הלילה. לאחר מכן, החלף את המדיום במיליליטר אחד של DMEM טרי המכיל שני מיקרוליטר של תמיסה של 50 מיליגרם למיליליטר של DBCO-UCNs. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ושטפו את התאים פעמיים עם DMEM.

כבה את האור של מכסה האדים והוסף את תמיסות חיץ הדיאן המתאימות לתאים להדמיית סידן, ודגר על התאים למשך 30 דקות בחושך. שטפו את התאים עם DMEM ללא סרום. הקרינו את התאים באור אינפרא אדום קרוב של 808 ננומטר המספק 0.8 וואט לסנטימטר רבוע.

לסירוגין חמש דקות של הקרנה עם הפסקות של חמש דקות עד שהתאים יוקרנו למשך 20 דקות. דמיין את התאים במיקרוסקופ קונפוקלי. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור של UCNs הליבה ומעטפת הליבה הראה מבנים כדוריים בעובי מעטפת של כחמישה ננומטרים.

TEM ברזולוציה גבוהה הראה ריווח d התואם לננו-מבנים מגובשים מאוד. לאחר שינוי פני השטח, ה-UCNs התפזרו בקלות לתמיסת חיץ. פיזור אור דינמי הצביע על כך שהקוטר ההידרודינמי של DBCO-UCNs בתמיסה מימית הוא כ-96 ננומטר.

פוטנציאל הזטה של ה-PAA וה-UCNs ששונו על ידי DBCO מצביעים על משטחים טעונים שלילית, מה שעולה בקנה אחד עם מסיסות ויציבות בתמיסות חיץ מימיות. בדיקות פליטה שהומרו הראו כי ל-UCNs ששונו על ידי PAA ו-DBCO היו דפוסי פליטה זהים ל-UCNs של מעטפת הליבה הבסיסית כאשר הם מוקרנים באור של 808 ננומטר. תאי HEK293 מתויגים אזיד המבטאים חלבוני תעלה מגודרים שימשו לבדיקת היישומים הביולוגיים של DBCO-UCNs.

לוקליזציה של ה-UCNs בתגי האזיד יוחסה לקבוצות DBCO שהוכתמו בצבע המכיל אזיד. כאשר תאים אלה נחשפו לאור קרוב ל-IR, ה-DBCO-UCNs הקלו על זרימת יוני הסידן על פני קרום התא, כפי שמוצג על ידי הדמיה קונפוקלית וזרימה ציטומטרית עם אינדיקטור סידן פלואורסצנטי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את ננו-גבישי ההמרה של מעטפת הליבה עם שינוי משטח תואם ביולוגית ויישומיהם הביולוגיים הנוספים להפעלת תעלת היונים המגודרת בתאים חיים על ידי ביצוע הליך זה.