להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית
October 19th, 2017
מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להדגים כיצד ניתן לדמיין ולחקור מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדלקת, כגון תגובות לזיהום וגירויים חיסוניים אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שמדובר בשינוי של שיטה מבוססת היטב ששימשה לחקר מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות.
מי שמדגים את ההליך הזה יהיה רולין שארמה. לאחר השגת מקרופאגים ריאתיים מבני אדם ועכברים על ידי שטיפת סימפונות, או BAL, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בטריפן כחול ובהמוציטומטר כדי לבצע ספירת תאים בת קיימא על תמיסת BAL. פיפטה אחת עד ארבע פעמים 10 עד חמישית מקרופאגים ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית על כיסוי מחליק בבארות של צלחות של 24 בארות, ואז דוגר על התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי שהתאים יידבקו.
הסר את מדיום התרבות והשתמש ב- PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת. לאחר מכן הוסיפו 2% פרפורמלדהיד-פריודאט-ליזין, או מקבע PLP, ודגרו את הדגימות למשך 10 דקות. לאחר שימוש ב-PBS כדי לשטוף את התאים לזמן קצר, הוסף 0.2%TWEEN 20 ב-PBS ודגר על התאים למשך 20 דקות.
לאחר מכן, כדי לחסום את התאים, הוסיפו 10% סרום עוף ב-5% BSA, מדולל ב-PBS ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן החלף את תמיסת הבלוק בריכוז של 1 עד 100 של נוגדנים ראשוניים ונוגדנים לבקרת איזוטופים ודגירה על התאים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים לפני הוספת הנוגדנים המשניים המתאימים.
לאחר מכן דגרו את הדגימות למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת התאים ב-PBS, הרכיב את הדגימות עם מדיום הרכבה מבוסס DAPI, ולאחר מכן דמיין את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. כדי לטפל בדגימות FFPE בתמיסת אחזור אנטיגן, יבש את השקופיות בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
לאחר מכן העבירו את השקופיות לתמיסת קסילן למשך 30 דקות לפני העברת הדגימות ל-70% אתנול בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר שימוש במי ברז לשטיפת המגלשות, הניחו אותם בניילון עמיד בחום וחשפו אותם לאחזור אנטיגן גבוה יותר על ידי הנחתם בסיר לחץ ב-Tris-EDTA pH 9.0 למשך 10 דקות. מצננים את הדגימות למשך 20 דקות ומעבירים אותן למי ברז.
לאחר מכן הניחו אותם על נדנדה למשך חמש דקות. חזור על שטיפת מי הברז ולאחר מכן שטוף את המגלשות פעם אחת ב-PBS על הנדנדה. כדי לחסום את הדגימות, הוסיפו 10% סרום עוף ב-5% BSA PBS ודגרו אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
לאחר מכן, כדי להגדיר מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים, או METs במקרופאגים, הוסף דילול של 1 עד 100 של נוגדנים ראשוניים ב-1% BSA PBS ודגר את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים על נדנדה למשך חמש דקות כל אחת. הוסף את הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים המתאימים ב-1%BSA PBS ודגר את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות.
לאחר שטיפות PBS, השתמש ב-DAPI המכיל מדיום הרכבה כדי להכתים את הכרומטין ולהרכיב את הדגימות. באמצעות ראש סריקת לייזר קונפוקלי המחובר למיקרוסקופ הפוך, צלם תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מטרות אוויר 20X 0.1 NA ו-40X 1.0 NA. צלם תמונות של מישור יחיד בגודל 512 על 512 פיקסלים על ידי לחיצה על כפתור פילוס רצף הקו.
השג לפחות 10 שדות תצוגה לכל מקטע לניתוח ונתונים עבור כל תוצאה. כדי לצבוע את החלקים בצינורות מיקרו-צנטריפוגה, הוסף את הנוגדנים הראשוניים הרלוונטיים בנפחים של 200 מיקרוליטר ודגר את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. שטפו את החלקים ב-PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות לפני הוספת הנוגדנים המשניים המתאימים ודגירה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה.
השתמש ב-DAPI כדי לצבוע את חלקי הריאה בתמיסה ולדגור את הדגימות למשך 20 דקות לפני הוספת החלקות כיסוי לחלקים בשקופיות מיקרוסקופ ב-PBS. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך עם אובייקט NA 40X 1.3, המצויד בלייזרים של 405 ננומטר, 440 ננומטר, 473 ננומטר, 543 ננומטר ו-635 ננומטר, כדי לצלם תמונות ולהקליט ערימות Z תלת מימדיות, בעובי 0.54 מיקרון, עם חתך Z אופטימלי. לבסוף, נתח את התמונות לפי פרוטוקול הטקסט.
דוגמה ל-METs בדגימת BAL מוצגת כאן. המאפיין הראשון הניתן לזיהוי הוא תנועת הגרעין לקצה התא, כפי שניתן לראות בשלב מוקדם זה של MET בעל צורה כדורית בערך. לאחר מכן כרומטין חוץ-תאי עם מתווכים אחרים המתבטאים במשותף, כגון H3Cit ופרוטאזות גרגיריות, כפי שניתן לראות ב-MET בוגר יותר.
שלב מוקדם יותר MET נמצא בפינה השמאלית העליונה ושלב מאוחר יותר MET נמצא מתחת לזה לכיוון המרכז. METs של רקמת ריאה מוצגים באיור זה. כאשר הריאות מנופחות בנוזל כדי להגדיר את ארכיטקטורת הריאות, ה-METs יידחפו אל דפנות המכתשית.
המורפולוגיה של ה-METs תשתנה גם בהתאם למישור שבו נחתכה הרקמה. החלקים הסטנדרטיים המשמשים לדגימות רקמת ריאה הם בעובי של ארבעה עד חמישה מיקרון. קטעי רקמה עבים יותר מאפשרים לצלם תמונות מרובות ולאחר מכן ניתן לצפות ב-METs בתלת מימד.
דוגמה לתמונה תלת מימדית מרקמת ריאה של עכבר שנחתכה בקטעים של 25 עד 35 מיקרון מוצגת כאן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים של צביעה בתוספת הדמיה אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עדין עם השטיפות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זימוגרפיה כדי לענות על שאלות נוספות כמו ביטוי פרוטאז. לאחר פיתוחה, טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך לחקר תגובות מקרופאגים דלקתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין METs באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
אל תשכח שעבודה עם PLP עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות והגנה על העיניים בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מתמקד בהדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הוא דן בשיטות in vitro וב-vivo המיושמות על דגימות ריאות.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה תאית
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים הן ישות שתוארה לאחרונה.
- הבנת תפקידן בדלקת חיונית למחקר תגובות חיסוניות.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית היא כלי רב עוצמה להדמיית מבנים אלו.
- שיטה זו מבוססת על טכניקות מבוססות המשמשות למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.
מטרת המחקר
- להדגים את הדמיית מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים.
- לחקור תגובות לזיהום וגירויים חיסוניים.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד מקרופאגים מהריאות של בני אדם ועכברים באמצעות שטיפה ברונכואלוולארית (BAL).
- ספירת תאים חיים באמצעות trypan blue והמוציטומטר.
- גידול תאים על רצועות מכסה בצלחות 24-בארות.
- דגירה של תאים ב-37 מעלות צלזיוס לצורך הידבקות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים.
- הוכחת יעילות השיטה בחקר תגובות חיסוניות.
- חידוד הפרוטוקול לבהירות ויכולת שחזור משופרות.
- תרומה להבנת תפקידי המקרופאגים בדלקת.
מסקנות
- שיטת המיקרוסקופיה הקונפוקלית יעילה לחקר מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים.
- טכניקה זו יכולה לקדם מחקר בתחום הדלקת והתגובות החיסוניות.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את המתודולוגיה הזו לחקר השלכות נוספות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Visualizing macrophage extracellular traps (METs) provides a mechanistic readout of innate immune activation relevant to inflammatory disease modeling. This confocal microscopy approach enables target de-risking by linking stimulus exposure to quantifiable chromatin release and protease co-expression. The method supports early discovery workflows where understanding macrophage-driven pathology informs target validation and phenotypic screening strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage activation states through direct visualization of extracellular chromatin and co-expressed mediators like citrullinated histones and granule proteases.
- Operational Value: Provides a reproducible imaging-based assay to compare stimulated versus unstimulated conditions for target pathway modulation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing in inflammation models by correlating MET formation with functional immune responses to infection or stimuli.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs (e.g., chromatin release, H3Cit, protease co-localization) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Includes built-in controls (background, isotype, unstimulated) to ensure assay specificity and reduce false-positive signals in compound evaluation.
- Scalability: Compatible with both in vitro cell culture and ex vivo lung tissue sections, enabling cross-model consistency in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models macrophage-driven processes in lung inflammation, aligning with preclinical studies of fibrotic, infectious, or autoimmune lung conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo lung tissue analysis, supporting biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective assessment of macrophage extracellular trap formation as a functional readout for go/no-go criteria in immunomodulator screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where MET visualization serves as a functional immune response assay in inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing chromatin extrusion and protease release as downstream consequences of target modulation in macrophages.
- Screening: Enables quantitative imaging readouts that can be automated via image analysis software to assess compound effects on MET formation across dose ranges.
- Analytics: Delivers multiparametric data (chromatin, citrullinated histones, protease co-expression) enabling statistical comparison of experimental groups for target prioritization.
- Translational Research: Facilitates cross-species comparison (human and mouse lung macrophages) and ex vivo tissue validation, strengthening preclinical-to-clinical translatability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple inflammatory targets and disease models beyond initial validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in macrophage activation studies by providing direct, visual evidence of extracellular trap formation and molecular co-expression.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, staining, and imaging workflows, improving inter-lab reproducibility and data consistency in immune profiling.
- Strategic Value: Informs early portfolio decisions by linking target inhibition to measurable reductions in pathogenic MET formation, decreasing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of immunomodulatory candidates based on functional macrophage phenotype modulation rather than binding affinity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy operation, and image analysis for accurate MET detection and quantification.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate objectives (e.g., 20X air, 40X oil) and laser lines for multichannel fluorescence detection.
- Necessitates standardized antibody panels and titration protocols to ensure specific detection of chromatin, citrullinated histones, and granule proteases across sample types.
- Involves optimization steps for antigen retrieval in FFPE lung tissue, including pressure-based retrieval in Tris-EDTA pH 9.0, to maintain epitope accessibility.
- Limited by the need for careful wash steps to preserve delicate extracellular trap structures during staining, as aggressive handling may disrupt NET/MET morphology.
