Name: להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למדו להמחיש מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר תגובות חיסוניות ודלקתיות ברקמות ריאה אנושיות וממושיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי מענקים אוניברסיטת מונש, הבריאות הלאומיים, המועצה למחקר רפואי, ריאות מונש ואת מכון שינה. המחברים רוצה להודות לצוות אימונולוגיה קלינית בבית הבריאות מונש, ג'ודי קלהאן, אלכס פולקו, השולחן שלי Elgass ו קמדן Lo של מונש מיקרו הדמיה (MMI) לעזרה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית הדמיה, ולהכיר המחברים את המתקנים MMI אוניברסיטת מונש. המחברים להכיר את מתקני וסיוע המדעית והטכנית של פלטפורמת היסטולוגיה מונש.

פרוטוקול זה בעקבות ניסויים אושרה: (1) בני אדם לפי האתיקה הוועדה של מונש מרכז רפואי וכן בעלי חיים (2) על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מלבורן.
 1. מקרופאגים Bronchoalveolar שטיפה (BAL) <ol><li>BAL שימוש כדי להשיג מקרופאגים ריאות ב: (1) האדם נושאים על ידי ברונכוסקופיה 6 ו- (2) עכברים באמצעות שאיפה אינטרה-הנשימה 13 . 
	הערה: רכישת המקרופאגים גורמת בדרך כלל יש הפעלה של תאים אלה. מקרופאגים מתקבלים מן חולים הזקוקים ברונכוסקופיה לחקור בעיה רפואית פוטנציאלית ועוד נושאים לא כל יכול להיות מתאים לניתוח של המטס (יהיה צורך לקבוע עבור כל פרוייקט בודדים).
	<ol><li>קח את פתרון BAL ו ספין למטה (500 x g 10 דקות) לטופס גלולה, לשטוף פעמיים עם תרבות בינוני (רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI) עם סרום עגל העוברי 5%, 1%-גלוטמין) בטמפרטורת החדר, ואז לדלל תאים 4 מ של תרבות medi המ.</li>
		<li>במידת הצורך, בקשה רשמית ספירה מבדלת; רוב התאים (בדרך כלל &#62; 80%) יהיה מקרופאגים 6. 
		הערה: זה בדרך כלל יבוצעו על ידי שירות היסטולוגיה קליניים באמצעות המראה מורפולוגיות של סוגי תאים שונים 6.</li>
		<li>בצע תא מקרופאג קיימא לסמוך על הפתרון BAL באמצעות הדרה Trypan blue ו- hemocytometer. 
		הערה: BAL מתקבל פתרון של בני אדם ועכברים כאמור בשלב 1.1.</li>
		<li>הוסף 1-4 x 10 מקרופאגים 5 כדי. ובכן 24 צלחות על coverslips ב 500 µL של תרבות בינוני לכל טוב ולהשאיר לילה ב 37 מעלות צלזיוס; התאים מקנא coverslips. לדוגמאות אנושי, להוסיף אנטיביוטיקה (למשל, פניצילין, סטרפטומיצין, 10 4 U/mL) כדי למנוע זיהום חיידקי.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunofluorescence Labeling/מיקרוסקופיה של מקרופאגים BAL הערה: תאים מתקיימים על coverslips כאמור לעיל-
<ol><li>להסיר את המדיום תרבות ולשטוף את התאים פעם עם פוספט buffered סליין (הציבורי). לתקן תאים לשבועיים paraformaldehyde/periodate/ליזין (פיפ) 2% במשך 10 דקות</li>
	<li>לשטוף את התאים לזמן קצר ב- PBS ולאחר מכן permeabilize ב- 0.2% 20 Tween ב- PBS במשך 20 דקות</li>
	<li>גוש תאים עם 10% עוף sera ב- 5% שור אלבומין (BSA) מדולל ב- PBS במשך 30 דקות</li>
	נוגדנים <li>Incubate עם שליטה ראשי ו isotype לשעה בטמפרטורת החדר בריכוזים בטחונות (פרטים ספציפיים יותר מפורטים בטבלה של חומרים) ב- 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: עבור הדגימות BAL, סמן ספציפי של מקרופאגים נדרש בדרך כלל לא.</li>
	<li>לאחר התוספת של נוגדנים העיקרי, לשטוף את התאים ב- PBS, דגירה נוסף עם נוגדנים משניים המתאימים למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ בסעיפים PBS ו הר דאפי מבוססי הרכבה בינונית להמחשת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (כאמור לעיל) לייזר excitations 647 561, 488, 405 ננומטר, 40 X, נה 1.0 שמן המטרה.</li>
</ol> 3. דגימות רקמה בריאה הערה: ויוו במחקרי של רקמת הריאה, לומדים את הדוגמאות לאחר חשיפת הרלוונטי (למשל, כפי שתואר על ידי O &#39; סאליבן. et al. 7). החשיפה הרלוונטי ביותר עבור ניסוי זה הם אורגניזמים זיהומיות, בעיקר חיידקים. זנים העכבר יכול לשמש עבור שיטה זו הם עכברים C57BL/6 או BALB/c, בן 10-12 שבועות, משקל 25-30 גרם וזכר.
<ol><li>Euthanize עכברים, באמצעות הזרקה בקרום הבטן של קטאמין (400 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (40 מ"ג/ק"ג). פתח את חלל בית החזה, לחשוף את הריאות והלב באמצעות מלקחיים כירורגיים ומספריים.
	<ol><li>להשרות PBS חמים באמצעות מחט 21-מד לתוך החדר הימני כדי לשטוף את הדם מכלי הדם ב-30 s, ואז להשרות 10 מ"ל של 2% מקבע פיפ ב-30 (לתוך החדר הימני).</li>
		<li>להשתמש חמים PBS (42 ° C) שטיפת בחלל החזה פתוח. לצנרר קנה הנשימה עם מחט 21-מד וחתיכת אבובים 0.8 מ מ חיתוך לפי מידה, להזריק µL 800 של ומחוממת מראש (עד 42 ° C), התכה נמוכה הצבע 3% agarose פתרון.</li>
		<li>העניבה off קנה הנשימה במשי קלועה (4.0 USP). מניחים את החוט סביב קנה הנשימה, מתחת נקודת הכניסה של הצינורית, ואבטח אותו באמצעות קשר בוהן פשוט. כדי לחזק את agarose, לנהל PBS קר כקרח סביב הריאות. הסר את הריאות והלב כבלוק בחלל בית-החזה בעזרת מספריים והן עמום. להסיר את כל הריאה בנפרד ולתקן אותם ואז עבור 16 h ב- 2% פיפ או פורמלין ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>לאחסן את דגימות PBS ב 4 ° C עד רקמות חלוקתה. אלה שיטות לקבלת רקמת הריאה היה שתואר לעיל 13.</li>
	</ol></li> <li>להכין את רקמת הריאה דגימות השתמש בשלבים הבאים.
	<ol><li>תיקון רקמת הריאה רקמות (resected בשלב 3.1) בפורמלין באגירה טבעי 10% במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. להעביר 75% אתנול ולשים במעבד רקמות על מחזור של 12 שעות, (2.5 h ב- 75% EtOH, 3 h ב- EtOH מוחלטת, 3.5 h ב- 3B הממס, ובמשך 3 h בפרפין).</li>
		<li>הטבע בפרפין סטנדרטי כדי ליצור בלוקים (FFPE) פורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע, אשר מאוחסנים בטמפרטורת החדר. 
		הערה: בשלב זה, זה בדרך כלל נוח לחתוך הסעיפים ריאות עבור שקופיות רגילה.</li>
		<li>לחתוך הסעיפים הריאה FFPE-4-5 מיקרומטר עובי באמצעות מיקרוטום והר טעונה, מצופה שקופיות כאמור מתוארת על ידי O &#39; סאליבן. et al. 7</li> <li>הר שקופיות, לשים 3 טיפות של הרכבה בינונית על coverslips 60 מ"מ x 24 מ"מ (גודל 1.5), היפוך השקופית על coverslip ולדחוף את עודף בינוני. הרמטית לאטום עם לק ולאחסן בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li></ol> 4. הכנה/מיקרוסקופיה של דגימות רקמה בריאה <ol><li>דה-שעווה, נוזלים, pretreat המדגם רקמת הריאה FFPE עם אנטיגן אחזור פתרון.
	<ol><li>התנור יבש FFPE שקופיות עבור 60 דקות ב 60 מעלות צלזיוס. אז לשים את השקופיות בפתרון קסילן במשך 30 דקות והעברת לפתרון אתנול 70% למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף במי ברז.</li>
		<li>המקום חום הוכחה ניילון נצמד ובכפוף חיר-אנטיגן אחזור בסיר לחץ במשך 10 דקות 10 מ'/מול/ליטר טריס, pH 1 mmol/EDTA 9.0. מגניב עבור 20 דק לשטוף פעמיים במי ברז למשך 5 דקות על כיסא נדנדה, אז פעם אחת עם PBS על הנדנדה.</li>
		<li>בלוק עם הנסיוב עוף 10% 5% BSA/PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>מכתים את הרקמה.
	<ol><li>להגדיר המטס מקרופאגים, להוסיף ראשי נוגדנים (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 1% BSA/PBS עבור h 16 ב 4 ° C-דילול 1/100 (פרטים ספציפיים לגבי כמויות נוגדן מוצגים בטבלה של חומרים). תשטוף פעמיים עם PBS למשך 5 דקות על כיסא נדנדה.</li>
		נוגדנים <li>להשיג זיהוי פלורסנט על ידי דגירה עם משני המתאים 1% BSA/PBS למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. נוגדנים הם: (1) עוף אנטי עכבר 488 (ירוק), (2) עוף אנטי-עז 594 (אדום), ועכבר (3) חמור נגד 647 (אדום רחוק).</li>
		<li>לרחוץ בסעיפים PBS ו הר המכילות דאפי הרכבה בינונית עבור צביעת כרומטין.</li>
	</ol></li> <li>להשיג פלורסנט תמונות באמצעות לייזר קונפוקלי סריקת הראש מחובר במיקרוסקופ הפוכה.
	<ol><li>להלהיב ההכנה עם 405, 488, 561 647 ננומטר לייזר. ללכוד תמונות פיקסל 512 x 512 מטוס יחיד על ידי לחיצה על הקו-רציפים, בהחלקה לחצן (בממוצע קו 2) באמצעות 20 X 0.1 והאוויר נה נה 40 X 1.0 שמן מטרות.</li>
		<li>לקבל לפחות 10 שדות ראייה לכל מקטע עבור ניתוח נתונים עבור כל תוצאה (קרי, 10 ובעוצמת שדות ראייה (HFOV) עבור הפקד, 10 עבור מדגם מגורה, וכדומה, עבור כל עכבר). 
		הערה: כדי לקבל במדגם מייצג של כל השדה, מטריצה המערכת יכולים לשמש אשר מחולק השדה לתוך מקטעים שונים עבור כל דגימה שונה המטריקס באותו משמש כדי לבחור שדות ראייה (למשל, השדה יכול להיות מחולק למקטעים 9 ומועברים למרכז, 4 הפינות, שני HFOV).</li>
	</ol></li></ol> 5. תלת-ממדיים (3-D) הדמיה של המטס הערה: כפי. המטס מבנים תלת-ממדיים, על ידי לקיחת z מרובים-מחסנית תמונות, אשר הם מחדש, רשאי למסור מידע בעל ערך.
<ol><li>סעיף דגימות ריאות מבלוקים פרפין, על שימוש vibratome בבית משרעת שוכן בגובה 1.8 מ"מ ומהירות של 0.1-0.5 מיקרומטר 200 מ"מ/ס</li>
	<li>לחסום את רקמת הריאה עם 20% של הסרום המתאים (10% עגל עוברית סרום ו- 10% עוף סרום) ולאחר מכן permeabilize PBS שיושלם ו- 3.75% טריטון-X 100 עבור 7 שעות בטמפרטורת החדר תחת עצבנות עדין.</li>
	<li>כתם הסעיפים עבור h 16 ב 4 ° C עם נוגדנים העיקרי הרלוונטי (MMP-9, H3Cit ו- F4/80) 200 כרכים µL צינורות microcentrifuge (נוגדן ריכוזים מוצגים בטבלה של חומרים).</li>
	<li>לשטוף את הסעיפים ב- PBS, 3 פעמים במשך 10 דקות לפני המקננת עם נוגדנים משניים הרלוונטיים בטמפרטורת החדר במשך ה 1</li>
	<li>כתם הסעיפים ריאות עבור דאפי (1:5, 000) בתמיסה למשך 20 דקות, לפני הוספת את שער גולשת המיקרוסקופ שקופיות ב- PBS.</li>
	<li>להשיג תמונות פלורסצנטיות באמצעות הפוכה קונאפוקלית במיקרוסקופ (40 x 1.3 NA) מצוידים עם 405 ננומטר, 440 ננומטר, 473 nm, 543 ננומטר, 635 ננומטר לייזר.</li>
	<li>להקליט z-במחסן תלת-ממדי של 0.54 עובי מיקרומטר עם אופטימלית חלוקתה z עבור המטרה שמן 40 x 1.3 נה. 
	הערה: התוכנה ששימשה משתנה בהתאם המיקרוסקופ בודדים. דוגמה של איך התוכנה יכול לשמש עבור מיקרוסקופ אחד מסופק 1 הקבצים המשלימים.</li>
</ol> 6. ניתוח תמונה הערה: הניתוח של דגימות מחייב שימוש תוכנה ספציפית ניתוח ההדמיה, דוגמאות מפורטים בטבלה של חומרים. בזמן הניתוח של התוצאות תלויות התוכנית ספציפיים השתמשו, הנקודות המפורטות להלן חשובים.
<ol><li>ניתוח של בל דגימות <ol><li>הגדר המספר של מקרופאגים על-ידי בחירת ערוץ הצבע הכחול על דאפי הקצאת בגודל מינימלי עבור התאים (למשל, &#62; 18 מיקרומטר בקוטר). באמצעות התוכנות הרלוונטיות, למדוד את המספר הכולל של מקרופאגים לכל שדה.</li>
		<li>לספור את מספר תאי יש את התכונות של המטרופוליטן על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית שזיהה דאפי עם ביטוי משותף של סמנים אחרים (למשל, MMP12, PAD2 ו- H3Cit). 
		הערה: מספר סמנים ניתן לנתח תלויה במספר של לייזרים זמינים, אך באופן אידיאלי בנוסף דאפי, לפחות שני סמנים אחרים צריך להיות כלול. השני פחות פרמטרים ספציפיים עבור ביטוי MET (למשל, מספר תאים עם כרומטין חוץ-תאית, של גרעין מוגדלת) יכול לשמש.</li>
		<li>כדי להשוות את הביטוי MET ב BAL לנתח דגימות (בין הבקרה, עשן, עשן/DNase התייחסו לקבוצות), מינימום של 100 מקרופאגים BAL לדגימה.</li>
		<li>למדוד נוגדנים משניים, isotype לשלוט רמות קרינה פלואורסצנטית; למדוד מינימום של 100 תאים בכל מדגם עבור קרינה פלואורסצנטית שלהם. למדוד את הרמה הממוצעת של רקע זריחה עבור כל סמן (למשל, H3Cit) באמצעות תוכנה סטנדרטית.</li>
		<li>להגדיר ביטוי MET, לספור את התאים עם פנוטיפ אופייני (למשל, חוץ-תאית כרומטין עם שותף ביטוי H3Cit MMP9), עבור כל MET, למדוד את רמת קרינה פלואורסצנטית סמנים (למשל, H3Cit, MMP9). לא לכלול תאים בהפקת המטס אם צביעת שלהם לא היה מעל רקע ושליטה isotype.</li>
		<li>לדוגמאות BAL אנושי, לנתח מינימום של 100 תאים עבור כל דגימה עבור האחוז של מקרופאגים שהופכים הגרורות. לקבלת דוגמאות מאתר, התאים הם קטנים יותר, המטס קשה להגדיר, לנתח מספר גדול יותר של תאים עבור כל דגימה (למשל, מקרופאגים 200).</li>
	</ol></li> <li>ניתוח של דגימות רקמה בריאה <ol><li>כדי לקבוע הנוכחות של המטס ברקמת הריאה, השתמש הסמן מקרופאג ספציפיים כגון F4/80-</li>
		<li>להגדיר את הנוכחות של המטס ברקמת הריאה באמצעות שיתוף הלוקליזציה של F4/80 בתאים המבטאים כרומטין חוץ-תאית עם פרמטרים אחרים, כמפורט בסעיף 6.1.</li>
		<li>לקבוע את רמות קרינה פלואורסצנטית רקע בדגימות עם נוגדנים משניים, הפקדים isotype. אל תכלול המטס ניתוח שאינם מעל הרקע.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+immunol%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1(2013).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371(2015).</li>
<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PAD4+in+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360(2012).</li>
<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li>
<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים לעשות ביחס לזה לעבוד.

השיטה המתוארת בסקירה זו מבוססת בשימוש עבור הגדרת הנוכחות של רשתות14. מקרופאגים עד כה סוג התא דומיננטי בדגימות BAL, שיטה זו של אוסף זה מתאים במיוחד ללמוד הגרורות. אם תאי דם אדומים נוכח הכדור, תאים אלה צריך להיות lysed על-ידי שימוש אמוניום כלוריד. ההליך BAL יהיה בדרך כלל להפעיל את המקרופאגים, לכן הוא צפוי כי יהיו המטס נוכח דגימות לא מגורה. המקרופאגים BAL הם בדרך כלל מאוד חסיד. המקרופאגים BAL בדרך כלל לא יזדקקו סמן ספציפיים כמו תאים אלה הם הסוג תא דומיננטי, ניתן להבחין גם על ידי המורפולוגיה שלהם. בדר...

מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), שתוארו לראשונה על-ידי. Brinkmann et al. 1 הם מיוצרים בעיקר בתגובה לזיהום (במיוחד לחיידקים) ויש להם תפקיד חשוב ב מארח ההגנה1,2. הם גם תוארו להתרחש בתגובה מחלות שאינן זיהומיות, כולל דלקת בכלי הדם, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן); ו mitogen phorbol 12-myrisate 13-אצטט (PMA)2,3. זה לאחרונה הוכר כי סוגי תאים אחרים אולי גם לייצר מלכודות חוץ-תאית, כולל מקרופאגים. מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות) עדיין אינם ישות מוגדרים היטב הספרות4,5. לאחרונה הקמנו שיטות כדי לזהות הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו6,7. במאמר זה, המדידה של המטס שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית יתוארו.
תכונות עיקריות של NETosis אשר להבחינו מסלולים סלולר אחרים (כגון אפופטוזיס8) הם ההבלטה של כרומטין בשיתוף עם: (1) citrullination של שינויים היסטוניים (H3Cit)9, (2) ביטוי משותף של פרוטאזות גרגר10 , (3) מעורבות של peptidyl deiminase ארגינין (PAD) 411,12. מקרופאגים אקספרס גם H3Cit, גרגר פרוטאזות, PAD, ניתן להשתמש בתכונות אלה כדי להגדיר את הנוכחות של המטס.
המטס ייתכן תפקיד חשוב במיוחד בריאה, כפי מקרופאג התא דומיננטי נוכח alveoli ואת דרכי הנשימה של הריאות, יש את התפקיד הראשוני של בימוי התגובה החיסונית הסלולר זיהום/דלקת. בנוסף, בעוד הרבה של הריאות הוא חלל ריק (למשל, בתוך alveoli), הגרורות מסוגלים פוטנציאלי להרחיב השטח הזמין, בניגוד לאיברים מוצקים.
השיטה הנפוצה ביותר מגדירים את הנוכחות של רשתות היא על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יש עדיין אינה דרך ברורה כדי למדוד את המטס. הטכניקה לשקילת רשתות כבר מותאם כדי למדוד את הנוכחות של המטס ב פרוטוקול זה. הדרישות העיקריות של שיטה זו הם גישה מיקרוסקופיה קונפוקלית ותוכנת הדמיה המתאים לניתוח.

<table><tbody><tr><td><דגימות חזקות>אנושיות: נוגדנים ראשוניים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-אנושי H3Cit (ציטרולין R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-אנושי MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>ריכוז 1:100 לא ניתן לכימות</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-אנושי MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 מיימת, ללא ריכוז נתון</td></tr><tr><td>ארנב אנטי אנושי PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td></td><td>AB16478 7 ug/ml</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>כבשים אנטי-אנושי NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>דגימות עכבר: נוגדנים ראשוניים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>ארנב נגד עכבר H3Cit (ציטרולין R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר F4/80</td><td>בבית (היברידומה)</td><td>בבית</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>כבשים אנטי-אנושי אנטי-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי וביישן; וביישן; וביישן; וביישן; PADI4 / PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10.1 ug/ml</td></tr><tr><td>סופר-פרוסט פלוס שקופיות</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong זהב</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק> חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עוף נגד ארנב AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>עוף נגד ארנב AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>עוף נגד עזים AF 594</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>A-21468</td><td></td></tr><tr><td>תרנגולת נגד עכבר AF488</td><td>Life technologies</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד כבשים AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>עוף נגד עכבר AF 647</td><td>Life technologies</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד כבשים AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>בקרת</td><td></td><td></td> איזוטיפ<td></td></tr><tr><td>ארנב IgG</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארנב IgG</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>ארנב IgG</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עכבר IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>כבשים IgG</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software Programs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לעוצמה ממוצעת של פלואורפורים ניתן להשתמש ביישום משרדי סטנדרטי כמו Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tissue Sources</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL samples מחבילת הברונכוסקופיה במרכז הרפואי</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מונאשדגימות BAL של עכבר ורקמת ריאה מהמחלקה לפרמקולוגיה, אוניברסיטת מלבורן.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>ריאגנטים אחרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סודאן שחור</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד/פריודיאט/ליזין (PLP) מקבע</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>קטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>פורמלין טבעי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>ממס 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 12 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 60 x 24 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>עכברים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 שחור 6</td><td>פלטפורמת מחקר בעלי חיים מונאש (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

שיטה העיקרי המשמש להגדרת הנוכחות של מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא מיקרוסקופיה קונפוקלית. אנחנו ששינית מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות כדי להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג (גרורות). אלה מלכודות חוץ-תאית מוגדרים על ידי הנוכחות של כרומטין חוץ-תאית עם ביטוי משותף של רכיבים אחרים כמו גרגר פרוטאזות, שינויים היסטוניים citrullinated peptidyl arginase deiminase (מקלדת). הביטוי של המטס בדרך כלל נמדד לאחר חשיפה לגירוי, לעומת דגימות לא מגורה. דוגמאות כלולים גם על רקע ושליטה isotype. התאים הם ניתחו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה מוגדרים היטב. מיקרוסקופיה קונפוקלית עשוי לשמש כדי להגדיר את הנוכחות של המטס גם במבחנה וגם ויוו ברקמת הריאה.

מטס, ניתן לאבחן מדגימות BAL, רקמת הריאה, בסעיפים ריאות עבה יותר עם תמונות תלת-ממדיות. דוגמה של המטס דמיינו במדגם BAL מוצג באיור1. המורפולוגיה של הגרורות ישתנה בהתאם שלהם שלב של התבגרות. התכונה הראשונה לזיהוי על מיקרוסקופ הוא התנועה של הגרעין לקצה של התא. זה מלווה כרומטין חוץ-תאית עם המגשרים ביטוי שיתוף אחרים, כגון H3Cit, גרגר פרוטאזות. בשלבים מוקדמים יותר, התא עדיין יש בערך עגול עם המלכודת חוץ-תאי ביטא. בשלבים מאוחרים יותר, היווצרות MET מאופיין על ידי התארכות...

מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להדגים כיצד ניתן לדמיין ולחקור מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הדלקת, כגון תגובות לזיהום וגירויים חיסוניים אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שמדובר בשינוי של שיטה מבוססת היטב ששימשה לחקר מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות.מי שמדגים את ההליך הזה יהיה רולין שארמה. לאחר השגת מקרופאגים ריאתיים מבני אדם ועכברים על ידי שטיפת סימפונות, או BAL, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בטריפן כחול ובהמוציטומטר כדי לבצע ספירת תאים בת קיימא על תמיסת BAL. פיפטה אחת עד ארבע פעמים 10 עד חמישית מקרופאגים ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית על כיסוי מחליק בבארות של צלחות של 24 בארות, ואז דוגר על התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי שהתאים יידבקו.הסר את מדיום התרבות והשתמש ב- PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת. לאחר מכן הוסיפו 2% פרפורמלדהיד-פריודאט-ליזין, או מקבע PLP, ודגרו את הדגימות למשך 10 דקות. לאחר שימוש ב-PBS כדי לשטוף את התאים לזמן קצר, הוסף 0.2%TWEEN 20 ב-PBS ודגר על התאים למשך 20 דקות.לאחר מכן, כדי לחסום את התאים, הוסיפו 10% סרום עוף ב-5% BSA, מדולל ב-PBS ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן החלף את תמיסת הבלוק בריכוז של 1 עד 100 של נוגדנים ראשוניים ונוגדנים לבקרת איזוטופים ודגירה על

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

השיטה מתוארת בנפרד לבחור, לתפעל, ומזיקים התמונה לחיות באמצעות מלכודת אופטי מצמידים את מיקרוסקופ דיסק מסתובב. מלכודת אופטי מספק שליטה במרחב ובזמן של אורגניזמים ומקומות אותם סמוך לתאי המארח. מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוכדת אינטראקציות אינטר דינמי עם הפרעה מינימלית תאים.

השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול להדמיה מבוססת מיקרוסקופ חיסוני וקונפוקלי של מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים (METs) ברקמת הריאה של מורין. מקרופאגים שוכני רקמות מאופיינים בביטוי של סמן הגליקופרוטאין הספציפי למקרופאגים F4/80, בעוד METs מאופיינים על ידי סימון סמני MET metalloproteinase 9, היסטון ציטרולינאט H3 וכרומטין.

אפיון מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים בדגימות רקמת ריאה של עכבר

סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של מלכודות מקרופאגים חוץ-תאיים, METs, במקרופאגים ברונכואלבאולריים מנוזל שטיפה ברונכואלבאולרי, והדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות במקרופאגים מנוזלי שטיפה ברונכואלבאולריים אנושיים

סרטון זה מדגים גירוי חוץ גופי של מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים (METs) במקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים באמצעות גירויים דלקתיים שונים כגון TNF-alpha, PMA ו-HOCL. הסרטון גם מדגים את השיטה של צביעת צבע SYTOX של METs להדמיה.

גירוי חוץ גופי והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים

אנו מתארים מערך ניסיוני להמחשה עם היווצרות וסגירה חסרת תקדים של פגוזומים ברזולוציה גבוהה בתלת מימד במקרופאגים חיים, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת. הוא מאפשר ניטור של בסיס הכוס הפגוציטית, הפסאודופודים המתרחבים, כמו גם המיקום המדויק של החתך הפגוזומי.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

מלכודות מוכילות (רשתות) הן מבנים תלת-מימדיים שנוצרו על-ידי ממריצים נויטרופילים גרנולוציטים. זה הפך ברור בשנים האחרונות כי רשתות מעורבות במגוון רחב של מחלות. זיהוי רשתות ברקמות עשויות להיות בעלת רלוונטיות אבחונית, ולכן נדרשות פרוטוקולים מתוקננת לתיוג רכיבי NET.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

הציג כאן הוא פרוטוקול כדי לזהות מלכודת מקרופאג מסחטות (MET) ייצור בתרבות התא החי באמצעות מיקרוסקופ וכתמים פלואורסצנטית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב עוד יותר כדי לבחון סמנים מסוימים של החלבון נפגשו על-ידי כתמים immunofluorescence.

בגירוי חוץ-גופית והדמיה של שחרור מלכודת השמנה ב הבדיל מונוקרוציט האדם הנגזר

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

למדו להמחיש מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת חקר תגובות חיסוניות ודלקתיות ברקמות ריאה אנושיות וממושיות.

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

גלה סרטונים נוספים