פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות ולכמת במדויק למעלה מ-10,000 חלבונים מליזאט תאים או רקמות על פני טיפולים תרופתיים שונים, מסלולי זמן או תנאים ביולוגיים שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה או הביולוגיה כגון אילו חלבונים משתנים בתגובה לתרופה או לגירוי ביולוגי אחר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לה את היכולת לכמת במדויק למעלה מ-70% מהפרוטאום המבוטא על פני 10 תנאי ניסוי שונים.

ניתן להרחיב את ההשלכות של טכנולוגיה זו לאבחון מחלות אנושיות באמצעות גילוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שליזיס תאים אופטימלי והערכת נוזלים ממלאים תפקיד מפתח בהליכי עיכול, תיוג והפרדה. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, השג תאים מתורבתים מעניינים.

שטפו את התאים פעמיים בעזרת 10 מיליליטר PBS לכל שטיפה. מגרדים ואוספים את התאים השטופים בצינור של 1.5 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של PBS. צנטריפוגה בטמפרטורה של 600 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט ואחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לליזה של התאים. אוספים ושוקלים את הרקמות הרצויות במהירות לאחר הדיסקציה. לאחר מכן, יש לאחסן אותם מיד בחנקן נוזלי ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.

הכן את מאגר הליזיס ביום הניסוי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף מאגר ליזה לדגימה הקפואה כך שיחס המאגר לדגימה הוא 10 לאחד וריכוז החלבון הסופי הוא בין חמישה ל-10 מיליגרם למיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו חרוזי זכוכית והשתמשו בבלנדר כדי לבזבז את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס ולהאיץ שמונה על ידי ערבוב למשך 30 שניות ולאחר מכן מנוחה של חמש שניות, חזור על כך חמש פעמים או עד שהדגימות הומוגניות.

מדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת כימות חלבון סטנדרטית או ג'ל פוליאקרילאמיד SDS צבוע בקומאסי, עם BSA כסטנדרט. לאחר מכן, הוסף 100% אצטוניטריל כך שהריכוז הסופי הוא 10% ופרוטאז Lys-C נמצא ביחס אנזים לסובסטרט של אחד ל-100. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר לעיכול חלבון.

לאחר מכן הוסף DTT כך שהריכוז הסופי יהיה מילימולר אחד. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, הוסף 50 מילי-מולרי HEPES עד שריכוז האוריאה בדגימות מדולל לשתי טוחנות.

הוסף טריפסין לכל דגימה ביחס טריפסין לחלבון של 1 עד 50. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שלוש שעות לפחות. לאחר מכן, מוסיפים DTT עד שריכוזו שוב מילימולר אחד ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

הוסף יודואצטמיד כך שריכוזו הסופי יהיה 10 מילימולר. דוגרים בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש להרוות כל יודואצטמיד שלא הגיב על ידי הוספת DTT כך שהריכוז הסופי שלו יהיה 30 מילימולר.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בדוק את יעילות עיכול הטריפסין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הוסף TFA לכל דגימה כך שהריכוז הסופי יהיה 1%באמצעות רצועת pH, מדוד את ה-pH של כל דגימה כדי לוודא שהוא בין שתיים לשלוש.

הוסף ירידה נוספת ב-TFA במידת הצורך כדי להגיע ל-pH לא מקובל. צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 20, 000 פעמים גרם וטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. אספו את הסופרנטנט וטענו את הדגימות על עמודי ספין מוכנים.

צנטריפוגה ב-100 פעמים גרם למשך שלוש דקות או עד שהדגימה עברה לחלוטין דרך העמודה כדי לקשור את הדגימות. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיליליטר של 0.1% TFA לכל עמודה. צנטריפוגה בטמפרטורה של 500 פעמים גרם למשך 30 שניות.

לאחר מכן, הוסף 125 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 60% אצטוניטריל ו- 0.1 TFA לכל עמודה. צנטריפוגה ב-100 פעמים גרם למשך שלוש דקות כדי להוציא את הפפטידים מהעמוד. הרכיבו מחדש כל דגימת פפטיד מומלח ב-50 מיקרוליטר של HEPES של 50 מילי-מולרי.

באמצעות רצועת pH, ודא שה-pH של כל דגימה הוא בין שבע לשמונה. לאחר מכן, ממיסים את ריאגנטים TMT באצטוניטריל נטול מים, מוסיפים אותם לדגימות ואז מדגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, השתמש ב-10 קצות פיפטה מיקרוליטר משובצים במדיה כרומטוגרפית כדי להפיל מיקרוגרם אחד מכל דגימה ולנתח את יעילות התיוג כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

בדוק שישה עד 10 פפטידים נפרדים כדי לוודא שפפטידים ללא תווית לא מזוהים בדגימות המסומנות לאחר מכן, מערבבים כשני מיקרוליטר מכל דגימה יחד. השתמש ב-10 קצות פיפטה מיקרוליטר משובצות במדיה כרומטוגרפית כדי להפיל את התערובת הזו.

נתח את הדגימות לפי LC-MS/MS כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, יש להמיס את דגימת הפפטיד המאוחסנת ב-TMT ב-65 מיקרוליטר של מאגר A. השתמש ברצועת pH כדי לוודא שה-pH הוא כ-8.0. אם הדגימה עדיין חומצית, השתמש באמוניום הידרוקסיד כדי להתאים את ה-pH לפי הצורך.

לאחר מכן, חלקו את הדגימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגדר את אספן השברים לאסוף שברים כל שתי דקות כולל זמן טעינה. הגדר את קצב הזרימה ל-0.4 מיליליטר לדקה.

אסוף בסך הכל 80 שברים. לאחר מכן, השתמש ברכז ואקום כדי לייבש לחלוטין כל דגימה שנייה. באמצעות LC-MS/MS, נתח את כל 80 השברים כדי להשיג כיסוי פרוטאום עמוק במיוחד.

ראשית, ארוז שרף C18 של 1.9 מיקרומטר לעמודים ריקים בקוטר פנימי של 75 מיקרומטר המגיעים לנפח מיטה של כ-1.3 מיקרוליטר. סליל את העמוד פעמיים עד שלוש בתוך תנור תיק פרפרים כדי להבטיח שכל אורכו מחומם. הדביקו את העמוד לחלק הפנימי של המחמם והקפידו לא להדביק על חיישן הטמפרטורה של המחמם.

לאחר מכן, מחממים את העמוד ל 65 מעלות צלזיוס. הפעל 100 ננוגרם של פפטידים ממוח חולדות דרך מערכת LC-MS/MS כדי להעריך את איכות המערכת. חזור על הערכה זו פעם נוספת.

לאחר מכן, טען כ-0.2 מיקרוגרם של פפטידים משוחזרים על העמודה תוך כדי זרימה של 5% מאגר A.הוצא את הפפטידים מהעמודה ונתח עם ספקטרומטר המסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה מתוארת שיטת תפוקה גבוהה לכימות חלבונים עם אסטרטגיית תיוג איזוברית של 10 plex. יעילות התיוג של TMT נבדקת באמצעות LC-MS/MS כדי לנתח דגימות עם תווית TMT ודגימות תואמות ללא תווית.

כפי שניתן לראות, שיא הפפטיד הלא מסומן נמצא רק בדגימה הלא מסומנת בעוד ששיא הפפטיד המסומן ב-TMT נמצא רק בדגימה המסומנת בתווית. לאחר מכן, מעריכים את ההשפעה של חלון הבידוד MS2 על הפרעות. כל סריקות MS2 מוגדרות כסריקה נקייה או רועשת.

בעוד שהסריקות הנקיות מציגות יוני y1 של ליזין בלבד, הסריקות הרועשות מציגות אותם גם בליזין וגם בארגינין. הסרת הפרעות מייצגות באמצעות פפטידי E.coli המסומנים בנפרד עם שלושה ריאגנטים שונים של TMT מוצגת כאן. העוצמות היחסיות המסוכמות מגלות כי תיקון מבוסס יונים y1 מדויק יותר עבור כימות מבוסס TMT.

לאחר שליטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה תוך ארבעה עד חמישה שבועות אם נעשה כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לוודא שכל שלבי בקרת האיכות נעשים במלואם כדי להבטיח שמערך הנתונים הסופי מדויק ככל האפשר. התאמת הליך זה להתמקדות בשינויים לאחר תרגום יכולה לענות על שאלות אחרות כגון כיצד ubiquitination, זרחון או אצטילציה משתנים בתגובה להתקדמות המחלה או לטיפול תרופתי.

לאחר פיתוחה, הטכנולוגיה סללה את הדרך לחוקרים בתחום המוצר לחקור את השינויים החלבונים בתאים וברקמות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לזהות ולכמת במדויק יותר מ-10,000 חלבונים מתא או רקמה של יונקים. אל תשכח שעבודה עם UPLC בלחץ גבוה ומעט עמודי סיליקה עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הרכבת משקפי בטיחות בעת ביצוע הליך זה.

הרעיון של שיטה זו עלה לנו לראשונה כשהתחלנו לטפל בבעיה הידועה של דחיסת יחס המתרחשת בתיוג איזוברי. הבנו שפיצול נרחב הוא דרך מצוינת לא רק להקל על בעיה זו, אלא גם להגביר את הזיהוי של חלבונים ופפטידים שיכולים להגדיל עוד יותר ולהתאים את ניתוח הפרוטאום.