Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול
25 בספטמבר 2017
פרוטוקול זה מתאר כיצד לעורר תאים עם פפטידים מיטוכונדריאלי נגזר ולהעריך את המפל ואת לוקליזציה של פוספו-חלבונים איתות.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות את מפל האיתות במורד הזרם המעורב בתאים המגורים עם פפטידים שמקורם במיטוכונדריה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הפפטידים שמקורם במיטוכונדריה, כגון אילו מסלולי איתות מעורבים, והיכן זה קורה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישרה קדימה וקלה יחסית לביצוע.
הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר בחנו איתות ERK בתיווך אנושי שנתן לנו מידע מוגבל על העובדות במורד הזרם. שיטת Subscale Kersher נתנה לנו מושג טוב יותר על תפקידו של איתות בתיווך אנושי. ביום השלישי לאחר ציפוי ושטיפה פעמיים עשר עד השישי, תאי SH-SY5Y או HEK293 לפי פרוטוקול הטקסט.
ממיסים פפטידים של הומנין S14G במים מזוקקים מסוננים בנקודת אפס, שני מיקרון. ולהרכיב אותם מחדש כפתרון מלאי של מילי-מולרית אחת. יש לשים את המדיום המכיל סרום או נטול סרום מחומם מראש בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ולהוסיף תמיסת מלאי פפטיד אנושי בטמפרטורת החדר כדי ליצור ריכוז עובד.
החלף מיד את המדיום בתאים בשישה מיליליטר מתמיסת הפפטיד. ולדגור על התאים למשך פרק הזמן המתאים. השתמש ב -10 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים פעמיים.
לאחר מכן מגרדים את התאים מהצלחת בחמישה מיליליטר PBS קר כקרח. והעבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר פיצול קר כקרח ודגרו על קרח למשך 15 דקות. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 250 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן אסוף את הסופרנטנט כשבר הציטופלזמי ושמור את הגלולה עבור השבר הגרעיני.
צנטריפוגה הסופרנטנט להסרת פסולת תאית ומזהמים אחרים ב-18000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך עשר דקות. ואז להעביר את הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. זהו שבר הציטיזול.
השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר כביסה קר כקרח וצנטריפוגה את התמיסה ב-250 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר את ה-supernatant והשתמש ב-100 מיקרוליטר של מאגר מיצוי גרעיני קר כקרח כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר מכן סוניקציה של הדגימה על קרח 10 פעמים.
צנטריפוגה שוב את הדגימה. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. כדי לבודד את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי, השתמש ב-10 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים בכל צלחת של 10 סנטימטרים.
לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר PBS קר כקרח והשתמשו במגרד תאים כדי לנתק את התאים. העבירו את מתלי התאים לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 600 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
שאפו את ה-PBS והשתמשו במיליליטר אחד של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי קר כקרח כדי להשעות מחדש את הגלולה. ואז עם עלי מצופה פוליטטרפלואורואתילן על קרח, הומוגניזציה של התאים עם 25 משיכות של הומוגנייזר של שני מיליליטר. העבירו את ההומוגנאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 600 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר את הגרעינים והתאים הבלתי שבורים.
לאחר מכן אספו את הסופרנטנט, העבירו אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש וצנטריפוגה את התמיסה בטמפרטורה של 7000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה עם 200 מיקרוליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה קר כקרח והעבירו את התמיסה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 7000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר חזרה על הכביסה, השתמש ב-15 מיקרוליטר של מאגר RIPA כדי להשעות מחדש את הגלולה ולדגור את התרחיף על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-16000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העבירו את הסופרנטנט, שהוא החלק המיטוכונדריאלי, לתוך צינור חדש.
לכמת ולבצע כתמים מערביים על פי פרוטוקול הטקסט. באמצעות ההליך המודגם בסרטון זה, תאי HEK293 ו-SH-SY5Y נסוגו עם אדם אחד ו-100 מיקרו-מולרי S14 G, אנלוגי אנושי חזק. ונותחו הצורה הכוללת והזרחנית של ERK12 בתיאנין 202, טירוזין 204 מכלל תמציות החלבון.
כפי שניתן לראות כאן, טיפול בהומנין S14G הראה עלייה בזרחון של ERK12 ואתר הרגולציה שלו תיאנין-202, טירוזין-204. כדי להבין את היעד של הפעלת ERK12 בתיווך אנושי S14G, נותח הלוקליזציה התת-תאית של ERK12 הכולל והזרחני לאחר טיפול בהומנין S14G. כפי שמוצג בכתמים המערביים הללו, בתאי HEK293, ה-ERK הזרחני גדל הן בציטופלזמה והן בגרעין, אך לא במיטוכונדריה.
בתאי SH-SY5Y לעומת זאת, ERK זרחני ירד בגרעין הציטופלזמה ובמיטוכונדריה. מה שמצביע על כך שזרחון ERK בתיווך אנושי S14G עשוי למלא תפקיד שונה בסוגי תאים שונים ובתנאים שונים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הפיצול הגרעיני של התא תוך שעה אחת ואת הפיצול המיטוכונדריאלי תוך שעה ו-30 דקות, אם הוא מבוצע כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות על קרח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כולל משקעים קו-אימונליים וספקטרומטריית מסה על מנת להבין את המטרות במורד הזרם של מולקולות האיתות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרות תאים באמצעות פפטידים שמקורם במיטוכונדריה ולהעריך את שרשרת השליחויות ואת הלוקליזציה של חלבונים זופספוריליים. המטרה הכללית היא לזהות את שרשרת השליחויות במורד המסלול המעורבת בתאים שגורו באמצעות פפטידים אלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- סיגנל תאי
- ביולוגיה של מיטוכונדריה
- פוספורילציה של חלבונים
רקע
- פפטידים ממקור מיטוכונדרי ממלאים תפקיד באיתות תאי.
- הבנת מסלולים אלו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד תאי.
- שיטות קודמות סיפקו מידע מוגבל על השפעות במורד המסלול (downstream).
- שיטת Subscale Kersher משפרת את ההבנה של איתות המתווך על ידי humanin.
מטרת המחקר
- לחקור את מסלולי השליחויות המופעלים על ידי פפטידים ממקור מיטוכונדריאלי.
- לקבוע את מיקום הפוספו-פרוטאינים בתגובה לגירוי.
- לספק שיטה פשוטה לבחינת השפעות אלו.
שיטות שהושתמשו
- גירוי של תאי SH-SY5Y או HEK293 באמצעות פפטידים ממקור מיטוכונדריאלי.
- הערכה של רשרארי סיגנלינג במורד הזרם.
- לימודי לוקליזציה של חלבונים זרחופים (phospho-proteins).
- שימוש בשיטת Subscale Kersher לצורך ניתוח משופר.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מסלולי איתות מרכזיים המעורבים בתגובה לפפטידים ממקור מיטוכונדריאלי.
- תובנות לגבי הלוקליזציה של חלבונים זרחניים במהלך האיתות.
- תיקוף של שיטת Subscale Kersher לחקר איתות המתווך על ידי humanin.
- ביסוס של פרוטוקול ניסויי פשוט וישיר.
מסקנות
- המחקר מספק שיטה ברורה לחקירת סיגנלינג של פפטידים ממקור מיטוכונדריאלי.
- הממצאים תורמים להבנת הביולוגיה של המיטוכונדריה.
- ניתן להשתמש בפרוטוקול למחקרים נוספים בתחום.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת לצוותי מו"פ בביופארמה להעריך באופן כמותי את השפעתו של ERK ואת הלוקליזציה התת-תאית שלו בתגובה לפפטידים שמקורם במיטוכונדריה, ובכך היא תומכת בתיקוף המטרה (target validation) ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. על ידי אספקת תהליך הפרדה (fractionation) פשוט התואם לניתוח western blot, היא מקלה על בדיקת היפותזות לגבי רשראות סיגנלינג המתווכות על ידי פפטידים הרלוונטיות לנוירופרוטקציה ולהתוויות של מחלות מטבוליות. גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי בחקירת המסלולים לפני מאמצי זיהוי המולקולה המובילה (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזה טיפולית של מעורבות פפטיד ממקור מיטוכונדרי עם מסלולי איתות של ERK.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרה באמצעות מדידה כמותית של phospho-ERK במנות ציטופלזמיות, גרעיניות ומיטוכונדריאליות.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי חשיפת תגובות איתות ספציפיות לסוג התא, המסייעות בהפחתת סיכונים מכניסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות לבדיקה: מייצר פראקציות תת-תאיות סטנדרטיות המתאימות לניתוח western blot של אירועי פוספורילציה בשלבים הבאים.
- שחזוריות: מספק פרוטוקול פשוט המתוחזק על קרח, המבטיח בידוד עקבי של פראקציות ציטופלזמיות, גרעיניות ומיטוכונדריאליות.
- אפשרות לסריקה: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכה אמינה של תרכובות בשרשראות סריקה פנוטיפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך בחקירת פפטידים מ nguồn מיטוכונדריאליים במודלים של נוירופרוטקציה ועקה מטבולית התואמים לרלוונטיות למחלה בשלב הפרה-קליני.
- המשכיות תרגומית: מקשר תצפיות של אותות בשלב הגילוי לאישור פרה-קליני באמצעות נתונים כמותיים של לוקליזציה של חלבונים זפוספוריליים.
- קידום מותאם סיכון: מסייע בקבלת החלטות go/no-go על ידי הבהרה אם הפעלת ERK שנצפתה מתרחשת במדורים תת-תאיים הרלוונטיים למחלה.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מהערכת מעורבות המטרה ועד להבהרת המסלול, ובכך היא מאפשרת מעבר מפגיעות פנוטיפיות להבנה מכניסטית לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבחינת היפותזות על מנגנוני פפטידים המופקים ממיטוכונדריה באמצעות רזולוציה תת-תאית של אירועי הפעלת ERK.
- סריקה: מספק פראקציות מוכנות לבדיקה עם קריאות כמותיות של פוספורילציה להשוואת השפעות של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות של phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) המאפשרות לצוותים להשוות תנאי גרייה והשפעות של מעכבים.
- מחקר תרגומי: מקשר דפוסי לוקליזציה של ERK להמשכיות פרה-קלינית על ידי זיהוי דומיננטיות של איתות גרעיני לעומת ציטופלזמיים במודלים תאיים רלוונטיים.
- שימוש חוזר בארגון: מבסס פלטפורמת פראקציונציה לשימוש חוזר, הישמימה על פפטידים מגוונים המופקים ממיטוכונדריה וסוכנים טיפוליים מעבר לאנלוגים של humanin.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף נתיבים מטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באותות המתווכים על ידי פפטידים.
- ערך תפעולי: מספק פרקציונציה סטנדרטית וניתנת לשחזור התואמת לניתוחי western blot בקרב צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות מיטוכונדריאליות לפני השקעה משמעותית ביצירת מועמדים מובילים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע לתיעדוף מותאם סיכונים על ידי הבחנה בין הפעלת אותות פורה לבין רעש מלאכותי או רעש ספציפי למדור.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של פרקציונציה תת-תאית ובגילוי phospho-epitopes באמצעות western blot.
- תלוי בגישה לציוד צנטריפוגה המסוגל לשליטה מדויקת בכוח G ובטמפרטורה לצורך בידוד הפרקציות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי תזמון הפרקציונציה והשימוש במעכבי פרוטאז/פוספטאז כדי להבטיח תוצאות עקביות.
- שיקולי התאמה כוללים אופטימיזציה לסוגי תאים שונים ולריכוזי פפטידים בהתבסס על פרופילי מסיסות ויציבות.
- מגבלות מעשיות כוללות אפשרות לזיהום צולב בין פרקציות אם שלבי השטיפה אינם מבוצעים בקפידה, כפי שצוין בפרוטוקול.
