Name: Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: חקור מסלולי מיתרגנות בתאים מופעלים על ידי פפטידים מיטוכונדריאליים באמצעות שיטת Subscale Kersher. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מיקום פוספו-חלבונים בקלות וביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הבתר אליסון/עפר בתוכנית לחקר הזדקנות כדי SJK, פרס גלן וחדר NIH מעניקה למחשב (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). כל המחברים מופיע בסרט.

1. טיפול פפטיד לתאים <ol><li>צלחת שני מיליון SH-SY5Y או HEK293 תאים (2 x 10 6) לתוך 10 ס מ לחלק ואגדל אותם במשך יומיים</li> <li>(אופציונלי) למחרת היום, לשטוף את התאים עם סרום ללא Dulbecco &#39; s השתנה . נשר מדיה בינוני (DMEM) פעם אחת, דגירה עם סרום DMEM חינם למשך הלילה, אם הטיפול צריך להיעשות בתקשורת חינם סרום.</li>
	<li>ביום 3, להמיס פפטידים S14G-humanin 0.2 µm מסונן, מים מזוקקים, להשרות אותן כפתרון מניות 1 מ מ. 
	הערה: פפטידים צריך להיות מומס הממיס המתאים, אשר יכול להיקבע על ידי מאפייני רצף פפטיד (למשל, תשלום הכולל), ייתכן יינתן על ידי היצרן אם פפטידים זמינים מסחרית. לדוגמה, S14G-humanin, SHLP2, SHLP6, ו MOTS-c מתמוססים במים. Aliquot פפטידים אמצעי אחסון המתאים (למשל, 50 μL) כדי למנוע להקפיא הפשרת מחזורים. ברגע הקרת, אל תשתמש בהם שוב.</li>
	<li>Aliquot הנסיוב-המכיל ומחוממת מראש או ללא סרום המדיה 50-mL חרוט צינור ולהוסיף פתרון מניות של 1 מ"מ בטמפרטורת החדר להגיע אל ריכוז העבודה (למשל, 1 מיקרומטר, 10 מיקרומטר).</li>
	<li>להחליף את התקשורת עם פתרון פפטיד 6 מ ל מ שלב 1.4. דגירה התאים עבור משך הזמן המתאים. 
	הערה: בחר את זמן הדגירה בהתאם למצבך המפעילה טיפשה.</li>
</ol> 2. Fractionation subcellular ציטוזול, גרעין <ol><li>לרחוץ את התאים פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, לגרד את התאים מהצלחת ב 5 מ של PBS קר כקרח, ולהעביר את המתלים תא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב 500 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>וארוקן את PBS ו מחדש להשעות בגדר ב 200 µL קר כקרח, מאגר fractionation (10 מ מ HEPES pH = 7.6, 3 מ"מ MgCl 2, 10 מ מ אשלגן כלורי, 5% (v/v) גליצרול, 1% ללא יונית חומרים פעילי שטח (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) n), מעכבי פרוטאז/פוספטאז). 
	הערה: כדי לשמור את החלבונים את מעמדם זרחון, החומר המדכא פוספטאז כמו גם פרוטאז מעכב טרי להוסיף דוגמאות יש לשמור על הקרח בכלל פעמים. חוזרים פריזר ואת הפשרה מחזורים של דגימות להימנע. דוגמאות aliquot לתוך כמות קטנה (למשל 50 μg) לפני הקפאת אותם ב-80 מעלות צלזיוס</li>
	<li>דגירה בגדר תנאי מחדש על קרח למשך 15 דקות, ואז צנטריפוגה ב 250 g x עבור 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע כמו השבר cytoplasmic ולשמור את גלולה עבור השבר הגרעין.</li>
	<li>Centrifuge את תגובת שיקוע כדי להסיר את הלכלוך הסלולר מזהמים אחרים ב 18,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור microcentrifuge. זהו השבר ציטוזול-</li>
	<li>Resuspend בגדר במאגר שטיפת קר כקרח 200 μL (10 מ מ HEPES pH = 7.6, 1.5 מ"מ MgCl 2, 420 מ"מ NaCl, 25% (v/v) גליצרול, EDTA 0.2 מ מ, מעכבי פרוטאז/פוספטאז), צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במאגר החילוץ קר כקרח, גרעיני μL 100 (20 מ מ HEPES pH = 7.6, 1.5 מ"מ MgCl 2, 420 מ"מ NaCl, 25% (v/v) גליצרול, EDTA 0.2 מ מ, מעכבי פרוטאז/פוספטאז) ו sonicate פי 10 (5 s ב, 10 s 30% כח.). על קרח</li>
	<li>צנטריפוגה ב 18,000 g x 10 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge. זהו השבר הגרעין.</li>
	<li>Quantify כמות החלבון שימוש assay BCA</li></ol>
 3. שבר מיטוכונדריאלי גולמי <ol><li>לרחוץ את התאים בכל צלחת 10 ס מ עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, הוסף 5 מ ל PBS קר כקרח, לנתק את התאים באמצעות המגרד של תא. 
	הערה: השתמש שלוש מנות 10 ס מ של תאים כדי להשיג תשואה טובה של המיטוכונדריה המערבי סופג.</li>
	<li>להעביר התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל, ולשלב מתוך שלוש מנות 10 ס מ לתוך שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב 600 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>מחוק לגמרי מגניב והשהה מחדש בגדר ב 1 מ"ל של המיטוכונדריה כקרח בידוד מאגר (10 מ מ טריס-סחבות, 1 מ"מ EGTA/טריס, 200 מ"מ סוכרוז, להתאים את ה-pH = 7.4).</li>
	<li>Homogenize התאים במשיחות 25 של מהמגן 2 מ עם שהעקב מצופה טפלון על קרח 
	הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריאלי ולמקסם את התשואה של השבר מיטוכונדריאלי. צריך להיות מוטבת מספר קווים עבור כל סוג התא. Precool את מהמגן לפני תחילת ההליך.</li>
	<li>להעביר את homogenate צינור microcentrifuge ו- centrifuge זה ב 600 x g 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר גרעינים ותאים רצופה.</li>
	<li>לאסוף את תגובת שיקוע, להעביר אותו צינור microcentrifuge ו centrifuge זה ב g 7,000 x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס 
	הערה: בגדר משוחרר, לאסוף את תגובת שיקוע בזהירות ולנסות שלא להפריע בגדר.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע מחדש להשעות את גלולה עם 200 μL מאגר בידוד המיטוכונדריה קר כקרח, להעביר את הפתרון צינור microcentrifuge. Centrifuge את הצינור ב 7,000 g x 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	חזור על שלב 3.8 לשטוף בגדר <li>. אין צורך להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge בשלב זה.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע בגדר שטף והשהה מחדש את גלולה המכילה המיטוכונדריה עם 50 μL מאגר ריפה.</li>
	<li>Incubate התליה על קרח במשך 10 דקות</li>
	<li>Centrifuge התליה על 16,000 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור microcentrifuge. זהו השבר מיטוכונדריאלי.</li>
	<li>לכמת את כמות חלבון באמצעות וזמינותו של BCA-</li>
</ol> 4. המערבי סופג חלבונים ספציפיים פוספו <ol><li>לבצע על אלקטרופורזה בג'ל מרחביות-לזיהוי (8-16% premade ג'ל) ולהעביר את החלבון ממברנה PVDF 4.</li>
	<li>דגירה הקרום עם 5% BSA ב- TBST (0.1% Polysorbate 20) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לחסום אתרי קישור שאינם ספציפיים רקע. 
	הערה: לצורך זיהוי החלבון phosphorylated, לחסום את הקרום עם BSA. חלב. החלב מכיל קזאין, phosphoprotein שופע, כשהתוצאה היא אות לא ספציפית גבוה.</li>
	<li>דגירה הקרום עם נוגדן ראשוני (anti-פוספו-ERK1/2) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת, לשטוף את הקרום עם TBST (0.1% polysorbate 20) שלוש פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה הקרום עם נוגדנים משניים (אנטי-ארנב HRP) לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לרחוץ את הקרום עם TBST (0.1% polysorbate 20) שלוש פעמים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה הקרום עם פתרון ECL ואת התמונה הקרום במנתח התמונה.</li>
	<li>רצועת הקרום עם בנוכחות אחר מאגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 5 דק.</li>
	<li>חזור על השלבים 4.2 ל 4.7 באמצעות הנוגדן ERK1/2 סה כ אנטי-</li>
	<li>לבדיקת הטוהר של כל שבר, לפעול למען חברה דמוקרטית-דף ולבצע immunoblots באמצעות נוגדנים זיהוי סמנים עבור כל תא (למשל, מיטל B1 עבור גרעין, GAPDH עבור ציטוזול ולאחר TOM20 עבור המיטוכונדריה).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

פנחס כהן הוא בעל מניות, יועץ CohBar, inc. קלווין ין שימש כיועץ של CohBar, inc.

. הנה, הפגנו כי humanin בתיווך פפטיד ERK1/2 הפעלת מתרחשת בשני סוגי תאים שונים, לוקליזציה subcellular של מופעל ERK1/2 יכולה להיות שונה בהתאם לתנאים (למשל, מנה של פפטיד, נקודת זמן תא סוג). הוכח כי humanin אותות דרך שני קולטנים שונים22,23, אשר עשוי להסביר את ההבדלים איתות בין הקווים שני תאים, כמו גם הדרישה מינונים שונים של humanin. ההשלכות הפיזיולוגיות של זה לא מלא נחקרו אך זה יכול להציע מנגנון אפשרי אחד עבור התגובות HN תלויות רקמות.
<p class="jove_cont...

המתעוררים מחקרים מראים כי מיטוכונדריאלי נגזר פפטידים (MDPs) תפקיד חשוב cytoprotection ואת חילוף החומרים1,2,3. הבנת מסלול התמרה חושית אות בנוכחות MDPs נותן לנו תובנה המנגנון שבאמצעותו MDPs לווסת פונקציות שונות. MDP מזוהה הראשון, humanin, הוכח להגדיל חוץ-תאית מוסדר אות קינאז 1/2 (ERK1/2) זרחון באמצעות הקולטן שלו מחייב4,5. עם זאת, השפעת הזרם הפעלה ERK1/2 הוא עדיין כשתפסעו.
המפל ERK1/2 משמש מתווך חיוני במגוון תהליכים תאיים כולל התפשטות, נדידת תאים, חילוף החומרים הסלולר, הישרדות של אפופטוזיס-6,-7,-8. שננהל את כל אלה תהליכים תאיים שונים, פעילות subcellular לוקליזציה של ERK1/2 מוסדרים בחוזקה על ידי phosphatases ולגרדום חלבונים9,10. בנוסף השינוי post-translational, ונעים דינמי של ERK1/2 גם מסדיר את איתות פונקציה, פעילות וספציפיות11,12. ERK1/2 הוא בעיקר מקומי ציטוזול13. קבוצה של חלבונים עיגון, לגרדום לסייע לשמור על ERK1/2 אלמנטים cytoskeletal, על פני שטח של organelles, או כשמאירים הציטופלסמה13. על גירוי, ERK1/2 הוא phosphorylated, הופך בלתי משויך לזהויות חלבונים עגינת שלה, המאפשר רוברטסונית של ERK1/2 כדי מדורים subcellular אחרים, לרבות גרעין, מיטוכונדריה, גולג'י, lysosomes14, 15 , 16.
למרות humanin ידוע כדי להפעיל את איתות ERK1/2, הפעלת ERK1/2 נצפית רק ב lysates התא סך הכל. כפי שתואר לעיל, מאז לוקליזציה subcellular ERK1/2 ממלא תפקיד מכריע השפעתו במורד הזרם, הניתוח של הן ההתאמה subcellular ואת רמות סך של phosphorylated ERK1/2 יש צורך לספק הבנה מקיפה של הפעלת ERK1/2 humanin-induced והפעלה של מטרות במורד הזרם.
כדי להבין את organelles המטרה של הפעלת ERK1/2, בוצעה fractionation subcellular ואחריו סופג המערבי ERK1 phosphorylated/2. בשיטה זו ניתן ליישם בקלות כפי הוא מנצל ריאגנטים וציוד מעבדה סטנדרטיים. התאים subcellular מבודדים הן טוהר גבוהה, ומאפשר את התוצאות יפורשו אבר המין הגברי. Immunostaining של ERK1/2 עשויה לייצר תוצאות דומות. עם זאת, תאים subcellular מסוימים קשים יחסית להמחיש ויידרש קיבוע מיוחד ושיטות permeabilization. ERK1/2 רמות משתנות של תאים subcellular, וריאציה זו עלולה לגרום אותות שלילי כוזב חיובי ו- false כאשר מסתכלים על כל התא lysates. לכן, immunoblot באמצעות תאים מבודדים subcellular נותן לנו הבנה טובה יותר של לוקליזציה ERK1/2.
צדדיות של השיטה מאפשרת שינויים בפרוטוקול כדי לחקור את ההשפעות של ממריצים אחרים כולל טרנסלוקציה של מולקולות איתות אחרות כגון STAT3 או MDPs אחרים. לאחרונה התגלה קטן humanin דמויי פפטידים (SHLPs) מקודדים מאזור rRNA 16 שבו humanin מקודד, יש להם מאפיינים דומים אך ברורים בהשוואה ל ח נ17. לדוגמה, SHLP2 ו- SHLP3 להפעיל ERK1/2 לאחר 8 שעות למרות humanin מפעילה ERK1/2 תוך 5 דק Examining subcellular לוקליזציה של ERK1/2 בתגובה פפטידים שונים ייתן לנו הבנה טובה יותר של הביולוגיה של פפטידים אלה. מתעוררים הראיות הראה לוקליזציה subcellular של מולקולות איתות ממלא תפקיד מכריע שלהם אפקטים במורד הזרם. למשל, STAT3 באופן מסורתי ידוע להיות מותאם בעיקר ציטוזול בתאים resting ולאחר מכן זה translocates לתוך הגרעין להפעלת גנים בתגובה ציטוקינים18. STAT3 גם translocates את המיטוכונדריה, מסדיר את המחזור TCA ו- ATP ייצור19. מנשר autophagy, לוקליזציה subcellular שונים של STAT3 ממיקרו autophagy דרכים שונות20. לדוגמה, STAT3 גרעיני transcriptionally מסדיר גנים הקשורים autophagy, משמש אפנן autophagy. Cytoplasmic STAT3 מעכב צורונים autophagy על ידי אינטראקציה עם autophagy מולקולות איתות. STAT3 מיטוכונדריאלי מעכב ומונע mitophagy על-ידי דיכוי autophagy סטרס חמצוני המושרה. לכן, בשיטה זו בידוד תא subcellular חיוני להבנת תפקידם של אחרים איתות מולקולות כמו גם ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44/42 MAPK (ERK1/2)</td><td>איתות תאים</td><td>9102</td><td>דילול 1:1,000</td></tr><tr><td>פוספו-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)</td><td>איתות תאים</td><td>4370</td><td>דילול 1:1,000</td></tr><tr><td>למין B1</td><td>איתות תאים</td><td>12586</td><td>סמן גרעיני, דילול 1:1,000</td></tr><tr><td>איתות תאי</td><td>GAPDH</td><td>5174</td><td>סמן ציטופלזמי, דילול 1:2,000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-17764</td><td>סמן מיטוכונדריה, דילול 1:2,000</td></tr><tr><td>אנטי-ארנב-HRP</td><td>איתות תאים</td> מצומד <td>7074</td><td>דילול 1:30,000</td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה ומיצוי</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת תרבית</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>HNG פפטיד</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 מ"מ מסנן sylinge</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Halt&Trade; קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>מכלולי מטחנת רקמות תומאס פסטל עם עליים חלקים</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% Mini-PROTEAN TGX ג'לי חלבון טרומיים</td><td>BIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>מיני מודול טרנס-בלוט</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>מערכת העברת טורבו טרנס-כתם</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>טרנס-בלוט טורבו RTA מיני PVDF ערכת העברת</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL מצעי ספיגה</td><td>BIO RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>שחזור מאגר</td> <td>הפשטת כתמים מערבייםThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator, Medel: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

פפטידים, נגזר מיטוכונדריאלי (MDPs) הם סוג חדש של פפטידים מקודדים על ידי קריאה פתוחה קטנה מסגרות אחרות הגנים הידועים של הגנום מיטוכונדריאלי. MDPs יש מגוון רחב של השפעות ביולוגיות כגון הגנה על הנוירונים מפני אפופטוזיס, שיפור סמנים מטבוליים, הגנה על תאים מכימותרפיה. Humanin היה MDP הראשון להתגלות, פפטיד הכי נחקרות בקרב משפחת MDP. קולטני ממברנה ואת הזרם איתות המסלולים של humanin יש בקפידה מלווה. MDPs נוספים כגון MOTS-c ו- SHLP1-6 התגלו לאחרונה, מנגנוני איתות שעדיין לא להיות הובהר. כאן נתאר שיטת תרבות המבוססת תא כדי לקבוע את הפונקציה של פפטידים אלה. בפרט, מאפשרים תא טכניקות fractionation בשילוב עם סופג המערבי הקביעה כמותית של ההפעלה, טרנסלוקציה של מולקולת איתות חשוב. אמנם יש שיטות אחרות של תא fractionation, המתואר כאן היא שיטה פשוטה וקלה. שיטות אלה ניתן להבהיר עוד יותר את מנגנון הפעולה של פפטידים אלה וסוכנים טיפוליים אחרים.

באמצעות ההליך המובאת כאן, התייחסנו תאים HEK293 ו- SH-SY5Y עם 1 μM, 100 μM S14G-humanin, עוצמה humanin אנלוגית21, בהתאמה, ב להשלים מדיה עבור פרקי זמן המצוין (איור 1א' ו איור 1 B). אז בדקנו הכולל, phosphorylated בצורת ERK1/2-חמישי202/Tyr204 מ תמציות חלבונים הכולל. הטיפול S14G-humanin הראו עלייה זירחון של ERK1/2 ב שלה תקינה חמישי202/Tyr2...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לעורר תאים עם פפטידים מיטוכונדריאלי נגזר ולהעריך את המפל ואת לוקליזציה של פוספו-חלבונים איתות.

Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות את מפל האיתות במורד הזרם המעורב בתאים המגורים עם פפטידים שמקורם במיטוכונדריה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הפפטידים שמקורם במיטוכונדריה, כגון אילו מסלולי איתות מעורבים, והיכן זה קורה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישרה קדימה וקלה יחסית לביצוע.הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר בחנו איתות ERK בתיווך אנושי שנתן לנו מידע מוגבל על העובדות במורד הזרם. שיטת Subscale Kersher נתנה לנו מושג טוב יותר על תפקידו של איתות בתיווך אנושי. ביום השלישי לאחר ציפוי ושטיפה פעמיים עשר עד השישי, תאי SH-SY5Y או HEK293 לפי פרוטוקול הטקסט.ממיסים פפטידים של הומנין S14G במים מזוקקים מסוננים בנקודת אפס, שני מיקרון. ולהרכיב אותם מחדש כפתרון מלאי של מילי-מולרית אחת. יש לשים את המדיום המכיל סרום או נטול סרום מחומם מראש בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ולהוסיף תמיסת מלאי פפטיד אנושי בטמפרטורת החדר כדי ליצור ריכוז עובד.החלף מיד את המדיום בתאים בשישה מיליליטר מתמיסת הפפטיד. ולדגור על התאים למשך פרק הזמן המתאים. השתמש ב -10 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים פעמיים.לאחר מכן מגרדים את התאים מהצלחת בחמישה מיליליטר PBS קר כקרח. והעבירו את מתלה התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר פיצול קר כקרח ודגרו על קרח למשך 15 דקות. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 250 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן אסוף את הסופרנטנט כשבר הציטופלזמי ושמור את הגלולה עבור השבר הגרעיני.צנטריפוגה הסופרנטנט להסרת פסולת תאית ומזהמים אחרים ב-18000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך עשר דקות. ואז להעביר את הסופרנטנט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. זהו שבר הציטיזול.השעו מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר כביסה קר כקרח וצנטריפוגה את התמיסה ב-250 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הסר את ה-supernatant והשתמש ב-100 מיקרוליטר של מאגר מיצוי גרעיני קר כקרח כדי להשעות מחדש את הגלולה. לאחר מכן סוניקציה של הדגימה על קרח 10 פעמים.צנטריפוגה שוב את הדגימה. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. כדי לבודד את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי, השתמש ב-10 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים בכל צלחת של 10 סנטימטרים.לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר PBS קר כקרח והשתמשו במגרד תאים כדי לנתק את התאים. העבירו את מתלי התאים לצינור חרוטי יחיד של 15 מיליליטר. לאחר מכן צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 600 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.שאפו את ה-PBS והשתמשו במיליליטר אחד של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי קר כקרח כדי להשעות מחדש את הגלולה. ואז עם עלי מצופה פוליטטרפלואורואתילן על קרח, הומוגניזציה של התאים עם 25 משיכות של הומוגנייזר של שני מיליליטר. העבירו את ההומוגנאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה וצנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 600 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר את הגרעינים והתאים הבלתי שבורים.לאחר מכן אספו את הסופרנטנט, העבירו אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש וצנטריפוגה את התמיסה בטמפרטורה של 7000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הסרת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה עם 200 מיקרוליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה קר כקרח והעבירו את התמיסה לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. צנטריפוגה את הצינור בטמפרטורה של 7000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר חזרה על הכביסה, השתמש ב-15 מיקרוליטר של מאגר RIPA כדי להשעות מחדש את הגלולה ולדגור את התרחיף על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב-16000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העבירו את הסופרנטנט, שהוא החלק המיטוכונדריאלי, לתוך צינור חדש.לכמת ולבצע כתמים מערביים על פי פרוטוקול הטקסט. באמצעות ההליך המודגם בסרטון זה, תאי HEK293 ו-SH-SY5Y נסוגו עם אדם אחד ו-100 מיקרו-מולרי S14 G, אנלוגי אנושי חזק. ונותחו הצורה הכוללת והזרחנית של ERK12 בתיאנין 202, טירוזין 204 מכלל תמציות החלבון.כפי שניתן לראות כאן, טיפול בהומנין S14G הראה עלייה בזרחון של ERK12 ואתר הרגולציה שלו תיאנין-202, טירוזין-204. כדי להבין את היעד של הפעלת ERK12 בתיווך אנושי S14G, נותח הלוקליזציה התת-תאית של ERK12 הכולל והזרחני לאחר טיפול בהומנין S14G. כפי שמוצג בכתמים המערביים הללו, בתאי HEK293, ה-ERK הזרחני גדל הן בציטופלזמה והן בגרעין, אך לא במיטוכונדריה.בתאי SH-SY5Y לעומת זאת, ERK זרחני ירד בגרעין הציטופלזמה ובמיטוכונדריה. מה שמצביע על כך שזרחון ERK בתיווך אנושי S14G עשוי למלא תפקיד שונה בסוגי תאים שונים ובתנאים שונים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הפיצול הגרעיני של התא תוך שעה אחת ואת הפיצול המיטוכונדריאלי תוך שעה ו-30 דקות, אם הוא מבוצע כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות על קרח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כולל משקעים קו-אימונליים וספקטרומטריית מסה על מנת להבין את המטרות במורד הזרם של מולקולות האיתות.

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנו יראה לכם כיצד שרשרת הנשימה במיטוכונדריה קומפלקסים של בתאי גזע עובריים אנושיים יכולים להיות נותחו באמצעות מבחני פעילות ג'ל.

גשוש עבור פעילות קומפלקס מיטוכונדריאלי של בתאי גזע עובריים אנושיים

את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

הליך זה מדגים כיצד לבודד מהמוח המבוגר עכבר קרומי המיטוכונדריה או MAMs הקשורים ER וmicrodomain המועשרים glycosphingolipid השברים מMAMs ותכשירי המיטוכונדריה.

ממברנות המיטוכונדריה הקשורים ER (MAMs) וMicrodomains Glycosphingolipid המועשר (אובניים חן): בידוד ממוח עכבר

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

כאן, אנו מתארים כיצד לחקור לוקליזציה מיטוכונדריאלית של קינאז (מחזור התא), וכיצד לקבוע את מיקומו התת-מיטוכונדריאלי כמו גם מצעים/מטרות מיטוכונדריאליות פוטנציאליות. ביטוי מאולץ של חלבונים למיטוכונדריה מספק כלי שימושי לחקר ההשלכות התפקודיות של לוקליזציה מיטוכונדריאלית של חלבון מעניין.

גישות ניסוייות לחקר מיטוכונדריאלי לוקליזציה ותפקוד של מחזור התא הגרעיני קינאז, Cdk1

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש את היישום של טכניקת כתם מערבית כדי לחקור את הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2. הפרוטוקול מתאר את חקירת הזרחון KCC2 באתרים רגולטוריים של קינאז Thr906/1007 באמצעות כתם מערבי. כמו כן, שיטות נוספות לאישור פעילות KCC2 מודגשות בקצרה בטקסט זה.

חקר הפונקציות והפעילויות של קו-טרנספורטר K-Cl עצבי KCC2 באמצעות כתם מערבי

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

חקור מסלולי מיתרגנות בתאים מופעלים על ידי פפטידים מיטוכונדריאליים באמצעות שיטת Subscale Kersher. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי מיקום פוספו-חלבונים בקלות וביעילות.

Fractionation subcellular להפעלה טיפשה על פפטיד מיטוכונדריאלי נגזר הטיפול

גלה סרטונים נוספים