מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3⁺ PD-1⁺ Intratumoral⁺ T תאים

המטרה הכוללת של ניתוח אימונופלואורסצנטי מרובה זה היא לספור תאים באופן אוטומטי על סמך הפנוטיפ שלהם. שיטה זו מאפשרת מולטי-פלואורסצנטי וספירת תאים אוטומטית לנתח את הפנוטיפ והתפקוד של תאי חיסון גידול בתוך מיקרו-סביבת גידול. טכנולוגיה זו אפשרה ליצור שני סוגים של פרוגנוזה מורכבת לחיזוי על ידי הסמנים שלך שמקורם ישירות במיקרו-סביבת הגידול.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהליך הקלדת הפנו ארוך מאוד והנתונים הגולמיים המתקבלים דורשים עיבוד נוסף. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ניסינו לאפיין את הפנוטיפ והאינטראקציות האימונולוגיות של תאי אנהודג'. לאחר ההפשרה, השתמש במגבת נייר כדי לייבש בזהירות את השקופיות סביב חלקי הרקמה ולאחר מכן הקף את הרקמות בעט מחסום הידרופובי.

כאשר המחסום התייבש, תקן את הדגימות ב-100% אצטון למשך חמש דקות, ולאחר מכן שתי דקות של ייבוש באוויר, ולאחר מכן שטוף את השקופיות ב-TBS למשך 10 דקות. טפל מראש בשקופיות עם 3 טיפות של 0.1% Avidin למשך 10 דקות בחושך, ולאחר מכן הקש או החלק את השקופיות כדי לכסות את הרקמה בתמיסת Avidin. הוסף 3 טיפות של 01% ביוטין לכל דגימה, ולאחר מכן הקש או העביר את הביוטין על פני הדגימות ולאחר מכן שטיפה TBS כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן חסום כל קשירה לא ספציפית עם 100 מיקרוליטר של 5% סרום רגיל ב-TBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה, הקש על השקופיות כדי להסיר את עודפי הסרום ודגר את השקופיות ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים העיקרי המעניין למשך שעה אחת בתא לח. שטפו את הנוגדנים המסומנים בשקופיות ב-TBST למשך חמש דקות.

לאחר הייבוש, סמנו את התאים עם 100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים המשני המעניין למשך 30 דקות בתא הלח, ולאחר מכן שטיפה של 10 דקות ב-TBS. דגרו את השקופיות המיובשות עם הנוגדנים המשניים עם 100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים השלישוני המעניין למשך 30 דקות ולאחר מכן 10 דקות של שטיפת TBS. בתום הכביסה יש לייבש את השקופיות ולהרכיב את הרקמות בעזרת מדיום הרכבה בתוספת dapi.

לאחר מכן תלתן כל שקופית עם כיסוי להחליק ותן למדיום ההרכבה להתייצב למשך שעתיים לפחות. כדי לסרוק את השקופיות, פתח את תוכנת המיקרוסקופ וטען את פרוטוקול סריקת התמונות. טען את השקופית הראשונה על שלב המיקרוסקופ.

לאחר מכן, בסרגל הבקרה, לחץ על הגדר חשיפה והתאם את זמן החשיפה עבור כל מסנן עד לקבלת אות מספיק אך לא רווי. לחץ על התחל בחלונית העליונה ופתח את התיקייה LabID. הזן את המזהה של השקופית הראשונה ולחץ על הבא.

כדי לרכוש את הסקירה הכללית של השקופית תחת אור שדה בהיר בהגדלה פי 4, לחץ על הדמיה מונוכרום ומצא דגימה. כדי לבחור את הרקמה לסריקה, לחץ על מקש הבקרה והשתמש בסמן כדי לבחור או לבטל את הבחירה באזורי העניין שיש לסרוק בהגדלה פי 4. כדי לקבל תמונה אדומה/כחולה/ירוקה פלואורסצנטית של כל אזור, לחץ על דמיין בהספק נמוך.

לבחירת שדה בעוצמה גבוהה, לחץ על מקש הבקרה ובחר לפחות חמישה אזורי עניין המתאימים לאזורי הרקמה שייסרקו בהגדלה של פי 20. לאחר מכן, כדי לקבל רכישת תמונה רב-ספקטרלית של כל שדה, לחץ על דמיין בעוצמה גבוהה ולחץ על אחסון נתונים כדי לאחסן את התמונות בתיקיית מזהה המעבדה המתאימה. כדי ליצור פרויקט חדש תחת תפריט הקובץ, בחר פרויקט חדש, תחת תפריט תכונת החיפוש, בחר פילוח תאים, ותחת תפריט הקלדת פנו, בחר הקלדת פנו, ולאחר מכן לחץ על הגדר.

בתבנית תמונה, בחר רב ספקטרלי. בפורמט לדוגמה, בחר פלואורסצנטי. כדי לשלב את התמונות המייצגות בפרויקט, תחת תפריט הקובץ לחץ על פתח תמונה ובחר 10-30 תמונות מייצגות של כל הסדרה.

כדי להסיר את התפרחת האוטומטית, פתח את השקופית הלא מוכתמת ובחר את מקור הספרייה ואת הפלואורופורים המתאימים. לחץ על תפרחת אוטומטית ובחר את אזור התפרחת האוטומטית בשקופית הריקה. כדי ליצור תמונה מורכבת, בחר הכן הכל כדי לשלב את ספריית הקרינה ואת ספקטרום הפלואורסצנט האוטומטי.

לחץ על סמל העין כדי לפתוח את חלונית עורך התצוגה ובטל את הבחירה באפשרות autoflourescence כדי לחתוך את אות ה-autofluorescence. בחרו צבע מתאים לכל סמן. כדי לפלח את התאים, בתפריט התא, בחר גרעינים וממברנה.

תחת תפריט הגרעין, הגדר את DAPI ככתם הנגד הגרעיני. לחץ על תאים מקטעים ובדוק את פילוח הגרעינים בקרומי התאים. כדי לפנוטיפ של התאים, תחת תפריט הפנוטיפ, לחץ על הוסף.

ליצירת קטגוריות פנוטיפ תאים, בחר יותר מחמישה מייצגים לשילוב פלואורופור ופלואורופור ולחץ על מסווג הרכבת. המסווג יוצר אלגוריתם המייחס פנוטיפ לכל תא עם מרווח ביטחון. הגדל ובדוק את הפנוטיפים של התאים.

לאחר מכן לחץ על פנוטיפ הכל כדי לשמור את אלגוריתם הפנוטיפ ואת פרויקט התמונה, תחת תפריט קובץ בחר שמור פרויקט. לאחר מכן תן שם לפרויקט ושמור אותו. לביצוע ניתוח אצווה של הסדרה, בחר ניתוח אמבטיה ובחר את הפרויקט השמור.

בחר תיקייה לאחסון הנתונים באצווה. הוסף את התמונות לניתוח ולאחר מכן לחץ על הפעל. בסיום הניתוח בדוק את איכות התמונה המרוכבת וודא את הקלדת הפנו של כל התמונות בסדרה.

ניתוח הגידול החודר לתאי T חיוביים CD8, על דגימת קרצינומה של תאי כליה ברורים על ידי הדמיה רב-ספקטרלית פלואורסצנטית מגלה שכמחצית מתאי ה-T החיוביים ל-CD8 הם חיוביים יחידים ל-PD-1 וכ-1/3 חיוביים כפולים ל-PD-1 ו-Tim-3. לאחר שילוב אותות התאים השונים הללו בחתך רקמה, מדידת עוצמת התפרחת של PD-1 על תאי Tim-3 חיוביים ל-PD-1 לעומת תאי T חיוביים ל-PD-1, Tim-3 שליליים CD8, מגלה כי ה-PD-1 MFI גבוה יותר כאשר Tim-3 מתבטא במקביל, מה שמחזק את הרלוונטיות התפקודית של ביטוי Tim-3. בניסוי מייצג זה, 66% מחולי הגידול בכליה היו חיוביים גם לביטוי ליגנד PD-1 ו-100% היו חיוביים לליגנד Tim-3 גלקטין-9.

ניקוד קליני של רקמות הגידול מחולי קרצינומה של תאי כליה, הראה גם את המתאם החיובי בין מספר ואחוז הגידול החודרים לתאי T חיוביים CD-8 המבטאים PD-1 ו-Tim-3 לבין פרמטרי הניקוד הפרוגנוסטיים אך לא CD-8 חיובי ל-PD-1 שאינם מבטאים Tim-3. מעניין לציין כי חולי קרצינומה של תאי כליה עם תאי T חיוביים ל-CD-8 המבטאים PD1 עם ו-Tim 3 מעל האחוז החציוני היו בעלי סיכוי גבוה יותר להישנות בעוד שביטוי PD-1 ללא ביטוי Tim-3 נמצא בקורלציה עם הישנות החולה. בזמן שניסיתי את ההליך הזה, חשוב לזכור לסקור את הפנוטיפ של התאים עם שני חוקרים נפרדים, כולל פתולוג במידת האפשר.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע עניינים אחרים כמו ציטומטריה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי ההשפעה התפקודית של פנוטיפ עצמי לאחר גירוי x-vivo. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסרטן לחקור תגובות חיסוניות באיברים מושפעים.