במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות
29 בינואר 2018
בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאמת חלבון מעניין שיכול להיות SUMOylated או שהוא SUMO E3 lygase. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום SUMOylation, כגון זיהוי SUMO E3 lygase. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה לחקירת הספציפיות של SUMO E3 ליגאז כלפי צורות ISO שונות של SUMO.
מי שתדגים את ההליך תהיה וואן-שאן יאנג, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי לטהר את התג K-bZIP, תחילה דגרו 10 מיליליטר של ליזאט סלולרי עם 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מתויגים בנוגדנים בצינור פוליפרופילן של 14 מיליליטר. לאחר מכן סובב את הצינור במהירות של 50 סיבובים לדקה בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות במיקסר מתלה.
לאחר שהחלבון נלכד, צנטריפוגה, הדגימה ב-800 פעמים גרם למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את החרוזים. השליכו את כל המיליליטר מלבד אחד של סופרנטנט כדי לתלות מחדש את החרוזים. והעבירו את החרוזים המומסים לצינור של 1.5 מיליליטר.
כדי לשטוף את החלבונים שנלכדו, הנח את הצינור עם החרוזים על מעמד מגנטי. המתן כשלוש שניות עד שהחרוזים יידבקו לדפנות הצדדיות של הצינור ולאחר מכן הסר את הסופרנטנט. כדי לשטוף את החרוזים, הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה לצינור של 1.5 מיליליטר.
ואז הפוך את הצינור עשר פעמים. לאחר מכן, הנח את הצינור בנפח 1.5 מיליליטר על המעמד המגנטי והסר את הסופרנטנט ברגע שהחרוזים נדבקים לקירות. כדי לשטוף שוב את החרוזים, הוסף מיליליטר אחד של מי מלח פוספט לצינור של 1.5 מיליליטר, והפוך אותו עשר פעמים.
לאחר מכן העבירו את הצינור למעמד המגנטי, והסירו את הסופרנטנט לאחר שהחרוזים נצמדו לדפנות הצדדיות. כדי לסלק את החלבונים המתויגים K-bZIP מהחרוזים המגנטיים המתויגים על ידי נוגדנים, הוסף 100 מיקרוליטר ב-150 מיקרוגרם למיליליטר של אוקטפפטיד מדולל בתמיסת מלח חוצצת פוספט בצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סובב את הצינור על מערבל מתלה במהירות של 50 סיבובים לדקה למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר.
העבר את הצינור למעמד המגנטי. ואז לאסוף את ה-K-bZIP המכיל סופרנטנט. לאחר מכן, כדי לנתח את תג ה-K-bZIP המטוהר, העבירו 1 עד 5 מיקרוליטר של החלבון המטוהר לדף SDS, ואחריו צביעה כחולה של Coomassie.
טען 0.5, 1 ו-2 מיקרוגרם של אלבומין בסרום בקר כסטנדרטים על הג'ל לכימות ריכוז K-bZIP. בזמן עיבוד התמונה ב-Image J.Next, יש לדלל את ה-K-bZIP המטוהר במי מלח עם פוספט. להגיע לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיקרוליטר.
ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס בכמויות קטנות. הוסף שלושה מיקרוליטר של 100 ננוגרם למיקרוליטר של K-bZIP מתויג מטוהר בתגובת תערובת מאסטר SUMOylation במבחנה. לאחר מכן מערבבים בעדינות את תכולת תערובת המאסטר ודוגרים בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.
לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של דף SDS 2X עם מאגר טעינה כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לנטרל את החלבון. לאחר מכן, טען 20 מיקרוליטר מהדגימה על ג'ל דף SDS של 10%.
והפעל את הג'ל ב 80 וולט למשך כ -120 דקות עד שהצבע מגיע לתחתית הג'ל. לאחר סיום השיתוק החשמלי, נתק את מנגנון הג'ל. ומעבירים את הג'ל במאגר העברה חצי יבש למשך חמש דקות.
לאחר מכן יש להשרות את קרום ה- PVDF במיכל אחר מלא במתנול למשך דקה. הסר את קרום ה-PVDF מהמתנול והשרו במאגר העברה חצי יבש. ואז מערבבים בעדינות את הממברנה למשך חמש דקות.
הסר את מכסה הבטיחות של המנגנון האלקטרופורטי היבש למחצה. הרטיבו מראש נייר פילטר. והכינו כריך ג'ל בתחתית אנודת הפלטינה.
לאחר אבטחת לוחית הקתודה במכסה הבטיחות, הפעל את הכתם בזרם קבוע של 15 וולט למשך 90 דקות. לאחר מכן כבה את אספקת החשמל והוציא את קרום ה- PVDF לאחר ניתוק המנגנון היבש למחצה. כעת חסום את קרום ה- PVDF עם מאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי ב -30 סיבובים לדקה.
לאחר מכן, הכלאה של קרום ה-PVDF עם נוגדן נגד p53 וחוצץ חוסם למשך 12 עד 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס על מערבל מתלה ב-30 סיבובים לדקה. לאחר מכן הוציאו את קרום ה-PVDF והעבירו במיכל מלא בתמיסת מלח חוצצת Tris-tween 20. לאחר מכן, יש להשרות את קרום ה-PVDF בתמיסת מלח 20 עם חוצץ Tris למשך 30 דקות על שייקר המסלול ב-45 סיבובים לדקה.
לאחר מכן הכלאה של קרום ה-PVDF עם נוגדן נגד ארנב מצומד עם חזרת פרוקסידאז מדולל במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר על מערבל ההשעיה ב-30 סיבובים לדקה. לאחר מכן, שטפו את קרום ה-PVDF עם תמיסת מלח עם טריס 20 שלוש פעמים. לאחר הכביסה, יש להשרות את קרום ה-PVDF במי מלח עם Tris-buffered tween 20 למשך 30 דקות על מערבל ההשעיה ב-45 סיבובים לדקה.
לאחר מכן החלף את תמיסת המלח Tween 20 עם חוצץ Tris בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט. לשימור קרום ה- PVDF בארבע מעלות צלזיוס עד 12 שעות. לאחר מכן, מערבבים את ריאגנטים המצע הכימילומינסנט המשופר אחד ושניים ביחס של אחד לאחד.
לאחר מכן הסר את קרום ה-PVDF ממי המלח המאגרים בפוספט וכתם לזמן קצר עם כיסי האגרוף כדי לספוג את עודף הלחות. הוסף מיד 400 מיקרוליטר של המגיב הכימילומינסנט למשטח הממברנה והמתן שלוש עד חמש דקות. כתם בקצרה כדי לנקז את עודף המגיב הכימילומינסנט ומונע מהקרום להתייבש לחלוטין.
השתמש במערכת ההדמיה של Luminescent כדי לחשוף את הכתם. כאן בוצע ניתוח כתמים חיסוניים כדי להראות את ריכוז האנזים Ubc9 הנדרש כדי לסיים את מטרות ה-p53. זה מראה ש-1/2 ו-1/5 ריכוז האנזים Ubc9 יכול מספיק SUMOylate אנזים p53 בבדיקת SUMOylation במבחנה באמצעות פפטידים SUMO 1 ו-SUMO 2.
כדי לנתח את ה-SUMOylated p53 הממברנה נבדקה עם נוגדן נגד p53. ניתוח דומה של כתמים חיסוניים נעשה כדי להראות שמחצית מריכוזי E1 ו-1/10 של אנזימי Ubc9 נדרשים כדי לבצע את המטרה p53 בבדיקת SUMOylation במבחנה באמצעות פפטידים SUMO 1, SUMO 2 ו-SUMO 3. כאן הממברנה הוכתמה בקומאסי כדי להראות את חלבון ה-K-bZIP המטוהר.
נעשה שימוש במערכת הביטוי של Baculovirus כדי לבטא את ה-K-bZIP המטוהר אשר נותח בדף SDS עם אלבומין סרום בקר כסטנדרט להשוואה. כמו כן בוצע ניתוח נוסף של כתמים חיסוניים שהראה כי בהגדלת ריכוז ה-K-bZIP הוא מזרז את ה-SUMOylation של p53 בנוכחות מחצית מכמות ה-E1, ו-1/10 מכמות אנזימי Ubc9, בהתאמה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לשמור את כל המגיב לבדיקת SUMOylation במבחנה על קרח, ולבצע את דילול הסדרה ולא בדילול ענק אחד. מצא הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ביטוי יתר SUMOlygase על מנת לאמת את ה- SUMOylation in vitro. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום SUMOylation לחקור יותר SUMOlygase ולאמת את כוח הספציפיות שלהם.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות ליגאז SUMO e3 באמצעות בדיקת סימולציה במבחנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול SUMOylation ששונה עבור in vitro, שנועד לזהות ליגזות SUMO E3 חדשות. השיטה מאפשרת לבחון את הספציפיות של ליגזות SUMO E3 כלפי איזופורמים שונים של SUMO.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- מודיפיקציה של חלבונים
רקע
- SUMOylation הוא תהליך של מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית.
- זוהו מעט ליגאזות SUMO E3 בהשוואה לליגאזות יוביקוויטין.
- זיהוי ליגאזות SUMO E3 הוא חיוני להבנת תפקידיהן הביולוגיים.
- מחקר זה נועד לשפר את שיטות הזיהוי של ליגאזות אלו.
מטרת המחקר
- לאימות חלבונים שיכולים לעבור סומויליציה (SUMOylation) או לשמש כליגזות SUMO E3.
- למענה על שאלות מרכזיות בתחום הסומויליציה.
- לפיתוח שיטה לזיהוי ליגזות SUMO E3.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת שחזור in vitro עבור SUMOylation.
- טיהור של התג K-bZIP באמצעות חרוזי מגנט עם נוגדנים.
- דגירה של ליזאט תאי עם חרוזי מגנט.
- סיבוב המבחנה במערבל תליה בטמפרטורה נמוכה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של ליגזים חדשים מסוג SUMO E3.
- הדגמת יעילות הפרוטוקול בסביבת מעבדה.
- תובנות לגבי הספציפיות של ליגזים מסוג SUMO E3 כלפי איזופורמים של SUMO.
- יישומים פוטנציאליים במחקרי SUMOylation נוספים.
מסקנות
- הפרוטוקול המשופר מהווה כלי בעל ערך לזיהוי של SUMO E3 ligase.
- הוא פותח נתיבים למחקר עתידי במנגנוני SUMOylation.
- מחקרים נוספים יוכלו להרחיב את הידע לגבי הספציפיות של SUMO E3 ligases.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי ליגזות SUMO E3 והספציפיות של האיזופורמים שלהן הוא קריטי להפחתת סיכונים באימות מטרה בשלבי הגילוי המוקדמים. בדיקת שחזור זו in vitro מאפשרת בחינה מכניסטית של מסלולי איתות תלויי-SUMO, ובכך תומכת בביטחון חזוי בבדיקת השערות טיפוליות. השיטה מספקת גישה סטנדרטית וניתנת להרחבה להערכת פעילות של ליגזות E3, המנחה באופן ישיר החלטות של זיהוי מועמדים מובילים (lead identification) ותיעדוף תיקי פיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תפקוד SUMO E3 ligase ושל סגוליות המצע (substrate specificity) כדי להבהיר מנגנוני איתות הרלווננטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מספק מערכת משוחזרת (reconstituted system) לאימות של E3 ligases משוערים באמצעות רכיבים מבודדים, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות הנובעות ממורכבות תאית.
- ערך חזוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות (target de-risking) על ידי הדגמת פעילות אנזימטית ישירה על מצעים ידועים, כגון p53, תחת תנאים מוגדרים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות של צימוד SUMO על פני פאראלוגים של SUMO (SUMO1/2/3) כדי לאפיין את העדפת האיסופורם של הליגאז.
- ערך תפעולי: משתמש בתנאי תגובה ובביקורות סטנדרטיים (טיטרציה של E1 ו-Ubc9) כדי להבטיח הדירות בין מעבדות ובמסעות סריקה.
- ערך של יכולת הרחבה: תואם לפורמטים של 96 בארות להערכה בעלת תפוקה בינונית של ספריות ליגאז או וריאנטים מוטנטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר את הפעילות של SUMO E3 ligase לתוצאות תפקודיות במודלים של מחלות על ידי תיקוף של מודיפיקציה של סובסטראטים פתופיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר ניתוח מבנה-תפקוד של דומייני ליגאז באמצעות מוטגנזה מונחית-מבנה בשילוב עם קריאת פעילות.
- ערך תרגומי: תומך בפיתוח סממנים ביולוגיים על ידי אישור סטטוס ה-SUMOylation של מטרות במערכות פרה-קליניות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, ומספקת אישור ביוכימי אורתוגונלי למנגנון לפני ביצוע סריקה תאית או פנוטיפית.
- ביולוגיה של התגליות: בודק היפותזות טיפוליות על ידי אישור מודולציה ישירה של SUMOylation על מטרות אונקוגניות או נוירודגנרטיביות.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות תלויות-אנזים המתאימות לאישור פגיעות (hit confirmation) בסריקות של מודולטורים של E3 ligase.
- אנליטיקה: מודד היווצרות של SUMO conjugate באמצעות immunoblot, מה שמאפשר השוואה של עוצמת הליגאז וסלקטיביות של איזופורמים.
- מחקר תרגומי: מתקף מעורבות של מטרה (target engagement) בהקשרים הרלוונטיים למחלה על ידי הדגמת SUMOylation של סובסטרטים בעלי רלוונטיות קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לאפיון של SUMO E3 ligases על פני פרויקטים ומחלקות מטרות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בבקרת מסלול ה-SUMO, ובכך מגביר את הביטחון בבחירת המטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכת הפעילות של E3 ligase, המשפרת את השחזוריות בין מעבדות ואת השוואתיות של הנתונים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go באמצעות הצגת ראיות ישירות לתאימות בין הליגאז לסובסטרט, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תוכניות המכוונות ל-SUMO המותאם לסיכון, בהתבסס על נתונים מכניסטיים מאושרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיהור חלבונים, קינטיקה של אנזימים וזיהוי באמצעות אימונובלוט (immunoblot).
- תלוי בגישה לאיזופורמים מטוהרים של SUMO, אנזימי E1/E2 וחלבון סובסטרט.
- מחייב שימוש במסדי תגובה סטנדרטיים ובקרת טמפרטורה למדידות פעילות עקביות.
- כולל אופטימיזציה של ריכוזי האנזים והסובסטרט כדי למנוע אותות שאינם ספציפיים.
- מוגבל לפעילות in vitro; הקשר תאי ומנגנוני בקרה דורשים תיקוף משלים.
