הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

המטרה הכוללת של ניסויים אלה היא לקבוע את ההשפעות של תרופות מבוססות נוגדנים על מצבי הפעלת מקרופאגים אנטי דלקתיים באמצעות מח עצם של עכבר ומקרופאגים צפקיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון, האם תרופות נוגדנים ספציפיות פועלות על ידי שינוי מקרופאגים למצב הפעלה אנטי דלקתי המייצר IL-10. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מודדת את התגובה של מקרופאגים ראשוניים של עכבר ממח העצם במבחנה וחלל הצפק in vivo.

בצע הליך זה במכסה מנוע סטרילי. אבטח עכבר שהומת בהמתת חסד על לוח קצף כשגפיו פרושות. לאחר מכן, נקו את הרגליים עם אתנול 70%.

לאחר מכן, בצע חתך רדוד בעומק של כשני מילימטרים כדי להסיר את העור והפרווה מפני השטח של כל רגל אחורית. לאחר מכן, נתחו את הרקמות כדי לגשת לטיביה ולעצם הירך. כדי להסיר את השוקה ועצם הירך, חתכו את העצם והשרירים ממש מתחת למפרק הירך, ומעל הקרסוליים.

לאחר מכן, הסר כמה שיותר מרקמת השריר מהעצמות. לאחר מכן, נקו את העצמות עם 70% אתנול, והניחו לו להתאדות למשך דקה אחת. לאחר מכן, מניחים את העצמות בצלחת שש בארות מלאה במדיום בשר עצם.

בצלחת, חתוך מילימטר אחד משני קצות עצם הירך כך שהחללים הפנימיים שלהם ייחשפו. ודא שמחט בגודל 26 יכולה לגשת לחללים. לאחר מכן, הפרד את השוקה ועצם הירך ממפרק הברך.

לאחר מכן, הכנס את המחט המחוברת למזרק של 10 מיליליטר לחלל עצם ואסוף את מח העצם. משוך את מח העצם מכל ארבע העצמות לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של מדיום בשר עצם. צנרת את המדיום ומח למעלה ולמטה מספר פעמים.

או מערבולת במהירות איטית כדי לפזר בעדינות גושים במתלים. יש לפרק מחרוזות מח לכתמים קטנים של מח באורך של פחות מחצי מילימטר. לאחר מכן, מלאו את הצינור ל -50 מיליליטר במדיום בשר עצם, והעבירו אותו לבקבוק תרבית רקמות בגודל 75 סנטימטר מרובע.

דגרו על מח העצם למשך שעה. במהלך הדגירה, התאים הבוגרים ידבקו לבקבוק, והאבות ההמטופויאטיים הרצויים יישארו בתרחיף. העבירו את התרחיף לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וסובבו את התאים לכדור.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית MCSF. לאחר מכן התאם את צפיפות התאים ל-500, 000 למיליליטר וטען 30 מיליליטר לבקבוק חדש של 75 סנטימטר רבוע. המשך בתרבית התאים, ובימים 4, 7 ו-10, ודא שהתאים דבוקים ומסועפים מעט באמצעות מיקרוסקופ שדה ניגודיות פאזה הפוך.

בעת בדיקת התאים, השליכו את המדיום המכיל את התאים הלא נדבקים. לאחר מכן שטפו את התאים הדבקים עם IMDM פעם אחת, והוסיפו 30 מיליליטר של מדיום תרבית MCSF טרי בחזרה לבקבוק. ביום העשירי, החלף את המדיום בשמונה מיליליטר של מאגר דיסוציאציה תאי מבוסס EDTA ללא אנזימים כדי לאסוף את התאים.

דגרו על התאים לזמן קצר, ואז גרדו את התאים בעדינות, וודאו שהם השתחררו באמצעות מיקרוסקופ. לאחר שחרור התאים, העבירו את המאגר עם התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. לאחר מכן שטפו את הבקבוק שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר IMDM כדי לאסוף תאים נוספים.

משוך את כל האוספים, צנטריפוגה אותם והשהה מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר MCSF. כעת, ספרו את התאים והתאימו את ריכוזם למיליון למיליליטר. לאחר מכן צלחו 100 מיקרוליטר של מתלה תאים לבאר בצלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות.

הצלחת כולה צריכה להיות ניתנת למילוי. תרבית התאים כשעה עד שהם נדבקים. לאחר מכן לעורר אותם עם ריכוזים שונים של LPS או אימונוגלובולין תוך ורידי או שניהם שהוכנו ב-IMDM.

בצע את כל המניפולציות בשכפול או משולש והקפד לשמור על פקדים לא מטופלים. לאחר מכן דגרו על התאים למשך 24 שעות ונתחו את הסופרנטנטים. הכן מזרק מיליליטר אחד עם הכמות הנדרשת של אימונוגלובולין תוך ורידי ו- LPS, והצמד מחט בגודל 26.

עבור פקדים, השתמש במקום זאת ב- PBS וב- LPS. אחזו בעכבר בשרוול שלו תוך אבטחת החלק האחורי והזנב שלו ביד אחת. כוון לרבע הימני התחתון של הבטן, והכנס את המחט בזווית של 30 עד 40 מעלות כשהשיפוע כלפי מעלה, והכנס אותה כ-1.5 סנטימטרים.

לאחר מכן הזריק את הבולוס. לאחר שעה, קצרו מקרופאגים צפקיים לאחר המתת חסד של העכבר. במכסה מנוע סטרילי, הצמידו את העכבר שהורדם ללוח קצף עם גפיים פרושות ועיקרו את הבטן עם 70% אתנול.

לאחר מכן, בצע חתך רדוד של שני מילימטרים לאורך קו האמצע, ומשוך את עור הבטן. הימנע מניקוב דופן הצפק. לאחר מכן, טען במלואו מזרק של חמישה מיליליטר עם PBS סטרילי ב-pH 7.4, והזריק את העכבר באמצעות מחט בגודל 25 או 27, בחלק העליון של חלל הצפק, משני הצדדים, לכיוון קו האמצע, כששיפוע המחט כלפי מעלה.

לאחר משיכת המחט החוצה, עסו את הצפק למשך 10 שניות כדי לעקור את התאים. כעת, הכנס שוב את המחט, בחזרה לחלל, ואסוף כ -3.75 מיליליטר נוזל שטיפה. העבירו את נוזל השטיפה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר על קרח.

חזור על ההזרקה, העיסוי ואיסוף נוזל השטיפה שלוש פעמים נוספות, ומשוך את כל האוספים לאותו צינור. במהלך האיסוף הסופי ייתכן שיהיה קל יותר להוציא את נוזל השטיפה מהצד הרחוק של העכבר. לאחר מכן סובב את התאים, והשהה אותם מחדש ב -500 מיקרוליטר של מדיום ציפוי.

לאחר מכן ספרו את המקרופאגים הקיימאים, והשעו אותם מחדש במיליון למיליליטר. כעת, צלחת 100 מיקרוליטר של מתלים לבארות של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך שעה.

המקרופאגים הצפק ידבקו לצלחת. לאחר מכן, הסר את התאים שאינם נדבקים, ושטוף כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטר IMDM חם. לאחר כל שטיפה, המתן 10 שניות והטה לאט את הצלחת כדי למשוך את תמיסת השטיפה.

לאחר הכביסה מוסיפים בחזרה 100 מיקרוליטר של מדיום ציפוי, ומניחים את הצלחת בחממה. עבור ה-ELISA, המשיכו לדגור על התאים ללא גירוי למשך 24 שעות. לאחר מכן אסוף והבהיר את המדיום המותנה לניתוח ציטוקינים.

ניתן להשתמש ב-BMDM כדי לבחון תגובות תרופתיות מבוססות נוגדנים כאשר הם מאותגרים עם גירוי דלקתי במבחנה. אימונוגלובולין תוך ורידי עם LPS מגדיל את ייצור הציטוקין האנטי דלקתי IL-10, פי שבעה, בהשוואה לגירוי LPS בלבד. וזה מקטין את הייצור של IL-12/23p40.

בנוסף, גירוי אימונוגלובולין תוך ורידי לבד או עם LPS הגביר את ההפעלה של MAP קינאז ERK1/2, עם זרחון מוקדם וממושך. גם הפעלת ה-P-38 התרחשה מוקדם יותר. יתר על כן, מקרופאגים צפקיים הגדילו משמעותית את ייצור ה-IL-10 עם גירוי במבחנה, בהשוואה לעכברים שהוזרקו ב-PBS.

לאחר מכן הוערך ייצור הציטוקינים בנוזל שטיפה ובסופרנטנטים ממקרופאגים צפקיים מגורים ex vivo. IL-10 גדל בנוזל השטיפה, תאי הצפק ומקרופאגים צפקיים כאשר העכברים מאותגרים עם אימונוגלובולין תוך ורידי ו-LPS. לשם השוואה, ייצור תת-היחידה של ציטוקינים פרו דלקתיים IL-12/23p40 הופחת באופן משמעותי במקרופאגים צפקים בתרבית, אך לא בנוזל השטיפה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבדוק את ההשפעות של תרופות מבוססות נוגדנים על מצבי הפעלת מקרופאגים במבחנה ובגוף החי באמצעות מח עצם עכבר ומקרופאגים צפקיים.