שיטות טיהור ביומולקול מבוססות כרומטוגרפיה
בביוכימיה, שיטות טיהור מבוססות כרומטוגרפיה משמשות כדי לבודד תרכובות מתערובת מורכבת. שתי שיטות כאלה המשמשות בדרך כלל על ידי ביוכימאים הן כרומטוגרפיה גו…
בביוכימיה, שיטות טיהור מבוססות כרומטוגרפיה משמשות כדי לבודד תרכובות מתערובת מורכבת. שתי שיטות כאלה המשמשות בדרך כלל על ידי ביוכימאים הן כרומטוגרפיה גודל-הדרה וכרומטוגרפיה זיקה. בכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, עמודה עמוסה חרוזים נקבוביים מפרידה בין רכיבים של תערובת בהתבסס על גודל. מצד שני, כרומטוגרפיה של זיקה מאפשרת הפרדה ספציפית יותר של ביומולקולים באמצעות עמודה המורכבת משלב נייח, המכיל ליגנדים ספציפיים למטרה.
וידאו זה משמש מבוא לכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל וזיקה, כמו גם למושגים השולטים בהם. הליך שלב אחר שלב לטיהור של חלבון מתויג היסטידין על ידי כרומטוגרפיה זיקה מתכתית משותקת מתואר. יישומים עבור שתי שיטות כרומטוגרפיות אלה בביוכימיה ומחקר ביו-רפואי הם גם פרופיל.
"כרומטוגרפיה" מתייחסת למגוון רחב של שיטות המשמשות לבידוד רכיב מתערובת מורכבת, שלב חיוני לפני שניתן לקבוע את התכונות והפעילויות של ביומולקולה. לכל טכניקה כרומטוגרפית יש מנגנון הפרדה שונה, בהתאם למטריצת הדגימה ולתרכובת המטרה. סרטון זה יתמקד בעקרונות ובפעולה של שתי שיטות הנפוצות בביוכימיה: אי הכללת גודל וכרומטוגרפיה של זיקה.
כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל או SEC מבוססת על גודל התרכובות בדגימה. שלב נייד המכיל את הדגימה מתווסף לעמודה עם חומר נקבובי: השלב הנייח. המולקולות בדגימה מתחלקות ל-1 מתוך 3 קטגוריות.
מולקולות גדולות מכדי להיכנס לנקבוביות עוברות את המרחק הקצר ביותר דרך העמודה. כל מין עם משקל מולקולרי מעל "גבול ההרחקה" הזה ייצא מהעמודה באותו הזמן. מולקולות קטנות מספיק כדי להיכנס בחופשיות לנקבוביות יישמרו הכי הרבה זמן, וייצאו מהעמודה יחד. המשקל המולקולרי המאפשר כניסה מלאה של הנקבוביות הוא "גבול החלחול".
רק מולקולות בין הגבולות הללו יופרדו זו מזו, מכיוון שהן מבלות פרקי זמן משתנים בפיזור לתוך הנקבוביות והחוצה מהן. מולקולות קטנות יותר נשמרות זמן רב יותר על העמודה מכיוון שהן מבלות זמן רב יותר בשלב הנייח, בעוד שמולקולות גדולות יותר בגבולות אלה יוצאות מוקדם יותר.
משקלים מולקולריים על פני 1 עד 2 סדרי גודל נופלים בגבולות אלה. עמודות נבחרות מתוך מחשבה על כך, או שניתן להשתמש במספר עמודות בסדרה אם יש מגוון רחב של תרכובות רצויות.
כעת, לאחר שראיתם את התיאוריה של ה-SEC, בואו נסתכל כיצד היא מתבצעת.
כדי להתחיל בהליך ה-SEC, יש לאזן את העמודה עם מאגר מים וכרומטוגרפיה נטולי יונים. לאחר ההכנה, מאגר המכיל את הדגימה מוזרק לעמודה. לאחר מכן המאגר נדחף בקצב זרימה נמוך. גלאי עוקב אחר מה שיוצא מהעמודה כדי לקבוע את נוכחות האנליט הרצוי. מולקולות גדולות עם משקל מולקולרי מעל גבול ההרחקה יוצאות מהעמודה בו זמנית. שברים קטנים מהעמודה נאספים בצינורות. כל שבר נבדק לאיכות מולקולת המטרה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל או טכניקות אנליטיות אחרות.
עכשיו בואו נסתכל על כרומטוגרפיה של זיקה או AC, אחת הדרכים היעילות ביותר לטיהור חלבונים. ביומולקולות רבות נקשרות באופן סלקטיבי לליגנדים מסוימים - תכונה ש-AC משתמשת בה על ידי הדבקת ליגנד ספציפי למטרה לשלב הנייח.
כאשר התערובת זורמת דרך העמודה, מולקולות המטרה מתחברות לליגנד, והשאר זורמות דרכו. לאחר שהתערובת עברה דרך העמודה, ניתן לאסוף את מולקולת המטרה באחת משתי שיטות פליטה המבוססות על ספציפיות.
ניתן לומר שלפליטה ביו-ספציפית יש תפקיד "נורמלי" או "הפוך". בפליטה ביו-ספציפית בתפקיד נורמלי, מתווסף חומר המתחרה בליגנד המודבק כדי להיקשר לביו-מולקולת המטרה.
בפליטה ביו-ספציפית בתפקיד הפוך, סוכן מתחרה עם המטרה כדי להיקשר לליגנד המודבק. סוג הפליטה השני, "פליטה לא ספציפית", מוריד את קשירת המטרה לליגנד על ידי שינוי ה-pH, החוזק היוני או הקוטביות של התמיסה. אם חלבון אינו נקשר לליגנד שניתן לשתק, ניתן לבטא את החלבון המכיל "תג": רצפי פפטידים קצרים המהונדסים להיקשר לליגנד.
זן אחד הוא כרומטוגרפיה של זיקה ליוני מתכת משותקת, "IMAC" בקיצור, שבה ליגנד מתכת דבוק, כמו ניקל או קובלט, נקשר לשאריות היסטידין על החלבון המותאם. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבוני מטרה נוצרים עם שאריות היסטידין חוזרות, הנקראות תג פוליהיסטידין, הנקשר למתכת דרך שרשרת הצד של האימידזול על היסטידין. לאחר קשירה, ניתן לאסוף את החלבון עם אימידזול חופשי באמצעות פליטה ספציפית בתפקיד הפוך ומאוחר יותר להשתמש בו במגוון רחב של יישומים במורד הזרם.? כעת, לאחר שראיתם את התיאוריה של כרומטוגרפיה של זיקה, בואו נסתכל על הליך IMAC במעבדה.
ב-IMAC, ניתן להוסיף את השלב הנייח ישירות לתערובת של השלב הנייד והדגימה, מה שמאפשר את קשירת החלבון המתויג שלו. לאחר מכן יוצקים את התרחיץ הזה לתוך העמוד, שם התרכובות הלא קשורות מטפטפות לפסולת, בעוד התרחיץ נשאר. מיכל התרחיץ נשטף כדי לאסוף שאריות שרף ודגימה, המתווספים לעמודה.
מערבבים את השרף כדי להבטיח שהרכיבים הלא קשורים זורמים בחופשיות. תוספת חוצץ כביסה עוזרת לשטוף אותם. לאחר הסרת כל הרכיבים הלא קשורים, הפסולת מוחלפת במיכל לאיסוף חלבון המטרה.
מאגר המכיל אימידזול מתווסף, מערבב ונותן לו לנוח כדי לשחרר את מולקולת המטרה. האימידזול נקשר למתכת, מחליף ומשחרר את החלבון המתויג. החלבון המשוחרר נאסף, ושלב האימידזול חוזר על עצמו כדי להבטיח איסוף מלא. כדי לטהר עוד יותר את הדגימה, ניתן להפעיל SEC על הדגימה לפני הניתוח.
כעת, לאחר שראינו את התיאוריה וההליך של שתי הטכניקות הללו, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן הן מיושמות בתחום הביוכימי.
סיבה נפוצה לטיהור חלבונים היא לחקור את תפקידם במחלות. סיסטיק פיברוזיס נגרמת על ידי פגמים בחלבון מווסת המוליכות הטרנסממברנית של סיסטיק פיברוזיס, או CFTR. לאחר גידול החלבון עם תג שלו בשמרים, גם כרומטוגרפיה של זיקה וגם כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מאפשרות בידוד של החלבון, ואחריו חקר תפקודו.
במקרים מסוימים, נוכחות של תג פוליהיסטידין יכולה לשנות את מבנה החלבון, ובכך להשפיע על תפקודו. תג נפוץ נוסף הוא חלבון קושר מלטוז או MBP, שייקשר לעמילוז קשור בעמודה. לאחר מכן משתמשים במלטוז כדי לשחרר את הקומפלקס. לאחר מכן ניתן לבקע את ה-MBP ולהסיר אותו עם SEC כדי לייצר את החלבון הטהור הרצוי.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על אי הכללת גודל וכרומטוגרפיה של זיקה. הוא כיסה את התיאוריה של הטכניקות, עבר על נהלים כלליים וכיסה חלק מהשימושים של הטכניקות.
תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does size-exclusion chromatography separate molecules in a mixture?
Size-exclusion chromatography separates molecules based on their size using a column packed with porous material. Large molecules cannot enter the pores and exit first, while small molecules enter the pores and exit last. Only molecules between the exclusion and permeation limits are separated from one another as they spend varying amounts of time diffusing in and out of the pores.
Q2: What are the three molecular weight categories in size-exclusion chromatography?
Molecules fall into three categories: those above the exclusion limit that cannot enter pores and exit together first; those below the permeation limit that freely enter pores and exit together last; and those between these limits that separate based on varying retention times. Molecular weights across one to two orders of magnitude typically fall within the separation range.
Q3: How does affinity chromatography use ligands to purify target proteins?
Affinity chromatography attaches target-specific ligands to the stationary phase. When a mixture flows through the column, target molecules selectively bind to the ligands while other components pass through. The target protein is then collected through elution methods that either compete with the ligand or change solution conditions like pH or ionic strength.
Q4: What is a polyhistidine tag and how is it used in immobilized metal affinity chromatography?
A polyhistidine tag is a short peptide sequence of repeating histidine residues engineered onto target proteins. In immobilized metal affinity chromatography, these tags bind to adhered metal ligands like nickel or cobalt via the imidazole side chain on histidine. The tagged protein is then released using free imidazole via reverse-role specific elution.
Q5: What steps are involved in the immobilized metal affinity chromatography procedure?
The IMAC procedure involves adding the stationary phase directly to the sample mixture to allow his-tagged protein binding. The slurry is poured into a column where unbound compounds drain to waste. After washing to remove unbound components, imidazole buffer is added to release the target protein by competing with the metal ligand.
Q6: Why might researchers combine size-exclusion and affinity chromatography in protein purification?
Researchers combine these techniques to achieve higher purity levels. After affinity chromatography isolates the target protein using ligand binding, size-exclusion chromatography can further purify the sample by separating based on molecular size. This sequential approach is particularly useful when protein tags like polyhistidine may affect protein structure or function.
Q7: How is gel electrophoresis used to evaluate fractions collected from size-exclusion chromatography?
After fractions are collected from the size-exclusion column, gel electrophoresis and other analytical techniques are used to test the quality and identity of the target molecule in each fraction. This verification step ensures that the desired biomolecule has been successfully isolated and separated from other components in the mixture.