דיאליזה היא טכניקה נפוצה המשמשת בביוכימיה להפרדת מולקולות המבוססות על דיפוזיה. בהליך זה, קרום חצי-אמין מאפשר תנועה של מולקולות מסוימות בהתבסס על גודל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הסרת חוצץ, המכונה התפלה, או החלפת מולקולות חיץ או יונים מפתרון חלבון.
וידאו זה מכסה את עקרונות הדיאליזה יחד עם הליך כללי. מספר יישומים של דיאליזה נבדקים, כולל הסרת ריאגנטים הדרגתיים בעקבות ultracentrifugation, הסרת דטרגנט לאחר מיצוי חלבון ממברנה, ואת שחזור של חלבונים על ידי שינוי סביבת הפתרון.
דיאליזה היא טכניקה נפוצה המשמשת בביוכימיה להפרדת מולקולות המבוססות על דיפוזיה. בהליך זה, קרום חצי-אמין מאפשר תנועה של מולקולות מסוימות בהתבסס על גודל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הסרת חוצץ, המכונה התפלה, או החלפת מולקולות חיץ או יונים מפתרון חלבון.
וידאו זה מכסה את עקרונות הדיאליזה יחד עם הליך כללי. מספר יישומים של דיאליזה נבדקים, כולל הסרת ריאגנטים הדרגתיים בעקבות ultracentrifugation, הסרת דטרגנט לאחר מיצוי חלבון ממברנה, ואת שחזור של חלבונים על ידי שינוי סביבת הפתרון.
דגימות ביוכימיות בדרך כלל יש ריכוזי חיץ גבוהים שיכולים לשבש עיבוד וניתוח במורד הזרם. דיאליזה היא טכניקה נפוצה וזולה המשמשת להפרדת מולקולות המבוססות על דיפוזיה. השיטה משתמשת בממברנה חדירה למחצה המאפשרת תנועה של רכיבים מסוימים, בהתבסס על גודל. וידאו זה יציג את המושגים של דיאליזה, הליך כללי, וחלק מהשימושים שלה בביוכימיה.
ההיבט החשוב ביותר של דיאליזה הוא קרום חדיר למחצה, אשר יש נקבוביות להטיל חתך משקל מולקולרי, המאפשר מולקולות מתחת לגודל מסוים לעבור. לדוגמה, קרום 10k בדרך כלל ישמור על מולקולות גדולות מ 10 קילודלטון. עם זאת, ניתוק המשקל המולקולרי אינו גבול נפרד או מדויק. הממברנה מכילה בדרך כלל מגוון רחב של גדלי נקבוביות, כך שחלק קטן של מולקולות ליד הניתוק עלול ללכת לאיבוד.
מכיוון שהניתוק במשקל המולקולרי מוגדר באמצעות חלבונים כדוריים, מולקולות ליניאריות של מסה דומה, כמו DNA או RNA, עשויות לחמוק. ממברנות נבחרות בדרך כלל חצי עד שליש מהמשקל המולקולרי של המולקולה הרצויה.
כדי לבצע את ההליך, מדגם ממוקם לתוך הממברנה, אשר בתורו מתווסף נפח גדול של פתרון, הנקרא דיאליזה. עם הזמן, מולקולות קטנות יותר יפוזרו בחופשיות על פני הממברנה שבין המדגם לדיאליזה, בעוד הביומולקולות הגדולות יותר מוחזקות בפנים. דיאליזה היא תהליך איטי. זה נפוץ לאפשר לו לרוץ לילה, או אפילו על פני מספר ימים.
אם הדיאליזה היא מים טהורים, ריכוז המאגר הכולל יקטן, תהליך המכונה התפלה. אם הפתרון מכיל חלקיקים קטנים אחרים, חלקם יעברו לדגימה, מה שיוביל להחלפת חיץ. מכיוון שדיאליזה היא תהליך שיווי משקל, ניתן לרענן את הדיאליזה מספר פעמים כדי לעקור עוד יותר מולקולות קטנות. לאחר השלמת התהליך המדגם נאסף מחדש לעיבוד נוסף.
עכשיו שראיתם את היסודות של דיאליזה, בואו נסתכל על הליך כללי.
לפני תחילת ההליך, הממברנה מוכנסת מראש בדיאליזה. זה מקל על השימוש, ומסיר כל חומרים משמרים. לאחר מוכן, המדגם נאסף, בדרך כלל עם מזרק ולאחר מכן מתווסף למיכל הדיאליזה. זה יכול להיות צינורות חשופים, או כלול בתוך קלטת. עודף אוויר מוסר ממערך הדיאליזה כדי למקסם את שטח הפנים של הדגימה עם הממברנה. לאחר מכן ההתקנה ממוקמת בדיאליזה תוך ערבוב כדי למקסם את הדיפוזיה. זה צריך לצוף כדי לא לעכב ערבוב.
הדיאליזה משתנה במרווחי זמן רלוונטיים כאשר מתבצע שיווי משקל בין דגימה לדיאליזה. לאחר השינוי האחרון, התגובה בדרך כלל נותרת לרוץ בן לילה. לאחר פרק זמן מספיק, המדגם ללא מאגר או מוחלף מוסר מהקלטת. לאחר איסוף, המדגם ניתן לנתח או מעובד נוסף, בהתאם לאופי הניסוי.
עכשיו שבדקנו הליך דיאליזה כללי, בואו נראה כמה מהדרכים שבהן הטכניקה הזו משמשת בביוכימיה.
שיפועי צפיפות הם דרך נפוצה להפריד דגימות ביולוגיות מורכבות. מושג זה מסתמך על ההתפלגות על חלקיקים קטנים, בדרך כלל סוכרוז או יונים כלוריד צסיום. לאחר השלמת, ריאגנטים אלה בדרך כלל צריך להיות מוסר לפני המדגם שנאסף ניתן לעבד. דיאליזה מאפשרת להשתמש במדגם המטוהר לניתוח עתידי.
חלבונים מסוימים נמצאים בתוך דו-שכבתי השומנים של התא, והם נחקרים בדרך כלל על ידי שילובם לתוך שלל שומנים כדורי המכונה ליפוזומים. החלבונים והשומנים מופקים תחילה עם חומר ניקוי. דיאליזה יכול לשמש כדי להסיר לאט את חומר הניקוי, יצירת פרוטאוליפוזומים.
לאחר הטיהור, חלבונים מסוימים מטופלים לא נכון, או denatured, המוביל לאובדן פונקציונליות. ניתן להסיר את התרכובות הגורמות לשינויים אלה במבנה באמצעות דיאליזה, מה שמוביל לרפורמציה של ניתוחים מתפקדים.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב בדיאליזה. עכשיו אתה צריך להבין שיטה זו המבוססת על דיפוזיה, הליך ניסיוני פשוט, ואת השימוש בטכניקה זו.
תודה שצפיתם!
דיאליזה היא טכניקה נפוצה המשמשת בביוכימיה להפרדת מולקולות המבוססות על דיפוזיה. בהליך זה, קרום חצי-אמין מאפשר תנועה של מולקולות מסוימות בהתבסס על גודל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על הסרת חוצץ, המכונה התפלה, או החלפת מולקולות חיץ או יונים מפתרון חלבון.
וידאו זה מכסה את עקרונות הדיאליזה יחד עם הליך כללי. מספר יישומים של דיאליזה נבדקים, כולל הסרת ריאגנטים הדרגתיים בעקבות ultracentrifugation, הסרת דטרגנט לאחר מיצוי חלבון ממברנה, ואת שחזור של חלבונים על ידי שינוי סביבת הפתרון.
לדגימות ביוכימיות יש בדרך כלל ריכוזי חיץ גבוהים שעלולים לשבש את העיבוד והניתוח במורד הזרם. דיאליזה היא טכניקה נפוצה וזולה המשמשת להפרדת מולקולות המבוססות על דיפוזיה. השיטה משתמשת בקרום חדיר למחצה המאפשר תנועה של רכיבים מסוימים, בהתאם לגודל. סרטון זה יציג את המושגים של דיאליזה, הליך כללי וחלק מהשימושים שלו בביוכימיה.
ההיבט החשוב ביותר של הדיאליזה הוא קרום חדיר למחצה, שיש לו נקבוביות המטילות חתך משקל מולקולרי, מה שמאפשר למולקולות מתחת לגודל מסוים לעבור דרכו. לדוגמה, ממברנה של 10k בדרך כלל תשמור על מולקולות גדולות מ-10 קילודלטון. עם זאת, חתך המשקל המולקולרי אינו גבול בדיד או מדויק. הממברנה מכילה בדרך כלל מגוון רחב של גדלי נקבוביות, כך שחלק קטן מהמולקולות ליד החתך עלול ללכת לאיבוד.
מכיוון שחתך המשקל המולקולרי מוגדר באמצעות חלבונים כדוריים, מולקולות ליניאריות בעלות מסה דומה, כמו DNA או RNA, עשויות להחליק דרכן. ממברנות נבחרות בדרך כלל חצי עד שליש מהמשקל המולקולרי של המולקולה הרצויה.
כדי לבצע את ההליך, מכניסים דגימה לתוך הממברנה, אשר בתורו מתווספת לנפח גדול של תמיסה, הנקראת דיאליזה. עם הזמן, מולקולות קטנות יותר יתפזרו בחופשיות על פני הממברנה שבין הדגימה לדיאליזה, בעוד שהביו-מולקולות הגדולות יותר מוחזקות בפנים. דיאליזה היא תהליך איטי. מקובל לאפשר לו לפעול למשך הלילה, או אפילו לאורך מספר ימים.
אם הדיאליזה היא מים טהורים, ריכוז החיץ הכולל יקטן, תהליך המכונה התפלה. אם התמיסה מכילה חלקיקים קטנים אחרים, חלקם יעברו לדגימה, מה שיוביל להחלפת חוצץ. מכיוון שדיאליזה היא תהליך שיווי משקל, ניתן לרענן את הדיאליזה מספר פעמים כדי לעקור עוד יותר מולקולות קטנות. לאחר השלמת התהליך, הדגימה נאספת מחדש להמשך עיבוד.
כעת, לאחר שראית את יסודות הדיאליזה, בואו נסתכל על הליך כללי.
לפני תחילת ההליך, הממברנה ספוגה מראש בדיאליזה. זה מקל על השימוש ומסיר חומרים משמרים. לאחר המוכנה, הדגימה נאספת, בדרך כלל עם מזרק ולאחר מכן מתווספת למיכל הדיאליזה. זה יכול להיות צינור חשוף, או כלול בתוך קלטת. עודפי אוויר מוסרים ממערך הדיאליזה כדי למקסם את שטח הפנים של הדגימה עם הממברנה. לאחר מכן מכניסים את ההתקנה לתוך הדיאליזה תוך ערבוב כדי למקסם את הדיפוזיה. זה צריך לצוף כדי לא לעכב ערבוב.
הדיאליזה משתנה במרווחי זמן רלוונטיים כאשר מגיעים לשיווי משקל בין הדגימה לדיאליזה. לאחר השינוי האחרון, התגובה בדרך כלל נשארת לרוץ בן לילה. לאחר פרק זמן מספיק, הדגימה נטולת המאגר או המוחלפת מוסרת מהקלטת. לאחר האיסוף, ניתן לנתח את הדגימה או לעבד אותה עוד יותר, בהתאם לאופי הניסוי.
כעת, לאחר שבדקנו הליך דיאליזה כללי, בואו נראה כמה מהדרכים שבהן משתמשים בטכניקה זו בביוכימיה.
שיפועי צפיפות הם דרך נפוצה להפריד בין דגימות ביולוגיות מורכבות. מושג זה מסתמך על התפלגות על חלקיקים קטנים, בדרך כלל יוני סוכרוז או צזיום כלוריד. לאחר השלמתם, בדרך כלל יש להסיר ריאגנטים אלה לפני שניתן יהיה לעבד את הדגימה שנאספה. דיאליזה מאפשרת לנצל את הדגימה המטוהרת לניתוח עתידי.
חלבונים מסוימים נמצאים בתוך שכבת השומנים הדו-שכבתית של התא, ובדרך כלל נחקרים על ידי שיבוץ שלהם לשלפוחיות שומן כדוריות הידועות בשם ליפוזומים. החלבונים והשומנים מופקים תחילה עם חומר ניקוי. ניתן להשתמש בדיאליזה כדי להסיר לאט את חומר הניקוי, וליצור פרוטאוליפוסומים.
לאחר הטיהור, חלק מהחלבונים מקופלים בצורה שגויה, או עוברים דנטורציה, מה שמוביל לאובדן פונקציונליות. ניתן להסיר את התרכובות הגורמות לשינויים אלה במבנה באמצעות דיאליזה, מה שמוביל לרפורמה של אנליטים מתפקדים.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על דיאליזה. כעת עליך להבין את השיטה המבוססת על דיפוזיה, הליך ניסיוני פשוט והשימוש בטכניקה זו.
תודה שצפית!
Videos from this collection: