אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית
אלקטרופורזה ג'ל דו מימדי (2DGE) היא טכניקה שיכולה לפתור אלפי ביומולקולים מתערובת. טכניקה זו כוללת שתי שיטות הפרדה נפרדות ששולבו יחד: מיקוד איזואלקטרי…
אלקטרופורזה ג'ל דו מימדי (2DGE) היא טכניקה שיכולה לפתור אלפי ביומולקולים מתערובת. טכניקה זו כוללת שתי שיטות הפרדה נפרדות ששולבו יחד: מיקוד איזואלקטרי (IEF) ונתרן דודסיל סולפט אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (SDS-PAGE). זה מפריד פיזית תרכובות על פני שני צירים של ג'ל על ידי הנקודות האיזואלקטריות שלהם (מאפיין אלקטרוכימי) ואת המשקלים המולקולריים שלהם.
ההליך בסרטון זה מכסה את המושגים העיקריים של 2DGE והליך כללי לאפיון הרכב של פתרון חלבון מורכב. שלוש דוגמאות לטכניקה זו מוצגות בסעיף היישומים, כולל זיהוי סמנים ביולוגיים ליזום והתקדמות המחלה, ניטור הטיפול בחולים וחקר חלבונים לאחר שינוי פוסט-טרינסלציה (PTM).
אלקטרופורזה דו-ממדית, או דו-ממדית, היא טכניקה המשתמשת בשתי שיטות הפרדה נפרדות שיכולות להפריד אלפי חלבונים מתערובת אחת. אחת הטכניקות, SDS-PAGE או אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל סולפט, אינה יכולה להפריד לחלוטין תערובות מורכבות לבד. אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי מצמידה את ה-SDS-PAGE לשיטה שנייה, מיקוד איזואלקטרי או IEF, המפרידה על סמך נקודות איזואלקטריות, ומאפשרת רזולוציה פוטנציאלית של כל החלבונים בליזאט תא. סרטון זה יציג את העקרונות של אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל, הליך כללי וכמה מהיישומים הביו-רפואיים שלו.
אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל מתחילה ב-IEF כממד הראשון. לכל חלבון יש ערך pH, הנקרא הנקודה האיזואלקטרית או pI, כאשר המטען הנקי הוא אפס. כאשר חלבון נתון לשדה חשמלי, הוא ינוע לעבר האלקטרודה עם מטען הפוך. דגימות מעניינות נטענות על רצועות שיפוע pH משותק, או IPG, שיש בהן אמפוליטים משובצים, מולקולות המכילות קבוצות חומציות ובסיסיות כאחד. לאחר מכן מופעל שדה חשמלי על רצועת שיפוע ה-pH, מה שגורם לחלבונים לנדוד עד שהם מגיעים לערך ה-pH התואם את ה-pI שלהם, שם הם מאבדים את המטען הנקי שלהם.
לפני הפעלת הממד השני, החלבונים המשובצים מטופלים ב-SDS, מנטרלים אותם ומספקים מטען שלילי אחיד. לאחר השלמתו, רצועות ה-IPG מונחות על ג'ל פוליאקרילאמיד. שדה חשמלי מופעל מושך את החלבונים לכיוון האנודה, כאשר חלבונים גדולים יותר נעים לאט יותר דרך הג'ל.
לאחר הפרדת תערובת החלבונים לפי pI ומשקל מולקולרי, מפת הפרוטאום מדומיינת באמצעות כתמים, ומזהים חלבונים מעניינים.
כעת, לאחר שדנו בעקרונות של אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל, בואו נעבור על הליך מעבדה טיפוסי.
לפני שניתן יהיה לבצע את הניסוי, יש להמיס את החלבונים למדיה. המסה של הדגימה מושגת על ידי ביטול צבירה של חלבונים עם שילוב של חומרים כאוטרופיים לשיבוש אינטראקציות קשרי מימן, חומרי ניקוי לא יוניים למניעת שינוי מטען החלבונים, חומרים מפחיתים לשבירת קשרי דיסולפיד וחוצצים. כדי להסיר חלבונים מפריעים בשפע ומולקולות אחרות, החומר מופק ברצף על ידי צנטריפוגה, ואיסוף הגלולה המתקבלת; ואחריו טיפול באנדונוקלאז, אנזים המשמש לצריכת כל DNA שיפריע לניסוי.
לאחר המסת החלבונים, מכינים את רצועות ה-IPG על ידי שטיפה בתמיסת ניקוי רצועות ומשאירים הפוכות לייבוש. לאחר מכן מוקצה לכל רצועה מספר מחזיק רצועה. לאחר המוכן, התמצית התאית נטענת על הרצועות בתנועה איטית ומחליקה מהקצה השלילי לקצה החיובי. לצורך התייבשות, נייר סופג לח מונח על גבי האלקטרודה ומתחת לרצועות הג'ל; לאחר מכן רצועות ה-IPG מרופדות על מכשיר ה-IEF. מופעל זרם חשמלי גבוה, והחלבונים מתחילים לנדוד.
לאחר השלמת הממד הראשון, מכינים את הג'ל ל-SDS-PAGE במנגנון יציקה. רצועות ה-IPG מטופלות על ידי הנחתן עם הפנים כלפי מטה במאגר שיווי משקל המכיל SDS. יחידת האלקטרופורזה מוכנה בתוספת מאגר אלקטרופורזה. רצועות ה- IPG המטופלות נאספות באמצעות פינצטה, מונחות על גבי צלחות הג'ל ונאטמות בתמיסת איטום אגרוז. לאחר מכן מקור מתח מפעיל שדה חשמלי, המוחזק עד שהחלבונים הנעים במהירות הגבוהה ביותר נמצאים במרחק של 1 ס"מ מתחתית הג'ל.
לאחר השלמת האלקטרופורזה, יש לדמיין את החלבונים. באופן מסורתי זה מבוצע על ידי צביעה בכחול קומאסי או חנקת כסף. חלבונים מעניינים עשויים להיות מועברים מהג'ל, ומנותחים על ידי ניתוח כתמים מערביים.
גישת זיהוי שנייה כוללת כריתה של החלבונים מהג'ל, עיכולם, מאשר ניתוחם על ידי ספקטרומטריית מסה.
כעת, לאחר שסקרנו הליך, בואו נסתכל על כמה מהשימושים באלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל.
אחד השימושים הנפוצים ביותר בטכניקה זו הוא זיהוי מולקולות המעורבות בהתחלת המחלה והתקדמותה. אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל, יחד עם ספקטרומטריית מסה, יכולה לזהות ויסות למעלה או למטה של חלבונים ספציפיים באזורים חולים בהשוואה לבריאים.
בנוסף, אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל שימושית במעקב אחר התקדמות תגובת המטופלים לתרופה טיפולית פוטנציאלית. ניתן לקחת דגימות ממטופלים בנקודות זמן שונות לאחר מתן הטיפול. באופן זה, אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל בשילוב עם ניתוח כתם מערבי או ספקטרומטריית מסה, יכולה לזהות חלבונים הקשורים לתגובות שליליות כגון דלקת; או היעדר חלבונים במצב הקלה.
שימוש נוסף באלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל הוא בחקר מבנה ותפקוד החלבון לאחר שינוי פוסט-תרגומי, או PTM, שהם תוספות לחלבונים בעקבות תרגומם מ-mRNA. PTM יכולים לווסת מגוון פונקציות, כולל איתות חלבון, ביטוי גנים או לגרום לנזק חמצוני. אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל רגישה לשינויים כגון מתילציה או אצטילציה, שעלולים לגרום לשינוי ב-pI כמו גם במשקל המולקולרי.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל. סרטון זה תיאר את עקרונות הטכניקה, הליך ניסיוני טיפוסי וכמה מהיישומים שלו בתחום הביו-רפואה.
תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the two separation methods used in 2D gel electrophoresis?
Two-dimensional gel electrophoresis couples isoelectric focusing (IEF) with SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). IEF separates proteins in the first dimension based on their isoelectric points, where each protein has a specific pH value with zero net charge. SDS-PAGE then separates proteins in the second dimension by molecular weight, allowing resolution of thousands of proteins from a single mixture.
Q2: How does isoelectric focusing separate proteins in the first dimension?
In isoelectric focusing, proteins are loaded onto immobilized pH gradient (IPG) strips containing ampholytes, molecules with both acidic and basic groups. An electric field is applied, causing proteins to migrate until they reach the pH matching their isoelectric point (pI), where their net charge becomes zero and they stop moving. This precise separation by charge allows proteins with different pI values to be resolved.
Q3: Why is sample solubilization necessary before 2D gel electrophoresis?
Sample solubilization de-aggregates proteins using chaotropic agents to disrupt hydrogen bonds, nonionic detergents to preserve protein charge, and reducing agents to break disulfide bonds. This preparation also includes treatment with endonuclease to remove interfering DNA. Proper solubilization ensures proteins are fully dispersed and ready for separation without interference from other cellular components.
Q4: What happens to proteins during the SDS-PAGE second dimension?
After IEF, IPG strips are treated with SDS-containing equilibration buffer, which denatures proteins and provides them with a uniform negative charge. The strips are then placed on polyacrylamide gels, and an electric field draws proteins toward the anode. Larger proteins move more slowly through the gel matrix, allowing separation by molecular weight and creating a two-dimensional separation pattern.
Q5: How are proteins visualized and identified after 2D gel electrophoresis?
After electrophoresis, proteins are visualized using stains such as Coomassie blue or silver nitrate, creating a proteome map. Proteins of interest can then be identified through Western blot analysis or by excision from the gel, digestion, and analysis by tandem mass spectrometry principle instrumentation uses to determine protein identity and modifications.
Q6: What biomedical applications does 2D gel electrophoresis have?
2D gel electrophoresis is used to identify molecules involved in disease initiation and progression by detecting protein up- or down-regulation in diseased versus healthy areas. It also monitors patient response to therapeutic drugs by detecting inflammation-associated proteins or their absence in treated states. Additionally, it studies protein structure and function following posttranslational modifications like methylation or acetylation, which shift isoelectric point and molecular weight.
Q7: Why can't SDS-PAGE alone fully separate complex protein mixtures?
SDS-PAGE separates proteins only by molecular weight, which means proteins of similar size but different charges cannot be distinguished. Many complex mixtures contain numerous proteins with overlapping molecular weights, making complete separation impossible with a single dimension. Coupling SDS-PAGE with isoelectric focusing in 2D gel electrophoresis adds a second separation axis based on charge, enabling resolution of potentially all proteins in a cell lysate.