ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis
26 בינואר 2018
אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.
המטרה הכוללת של מערך ניסוי מיקרופלואידי זה היא לאפשר תצפית ארוכת טווח על תאי חיידקים בודדים בתנאים סביבתיים קבועים ומבוקרים מאוד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של החיידקים, כגון מהם דפוסי התגובה ארוכי הטווח של תאים בודדים ללחץ או כיצד פנוטיפ הטרוגני על פני אוכלוסייה משתנה עם הזמן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לצפות בשושלות תאים בודדות במשך עשרות ואף מאות דורות, בתנאי סביבה קבועים, אחידים ומבוקרים מאוד.
לאחר הכנת פולימר PDMS על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו מאסטר סיליקון על פיסת נייר אלומיניום לא שבור בצלחת פטרי פוליסטירן. יוצקים את תערובת ה- PDMS הנטולת הגז על המאסטר לעומק של כחמישה מילימטרים. לאחר מכן מסירים את המנה למשך 10 דקות לפחות.
מרפאים את ה-PDMS בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות ומצננים אותו לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את נייר האלומיניום המכיל את המאסטר ואת ה-PDMS הנרפא מהצלחת. קלעו אותו בזהירות וקילפו את נייר האלומיניום מגב המאסטר.
ואז מקלפים בזהירות את ה- PDMS מהמאסטר. כפרוסה, כוללים בדרך כלל מספר מכשירים מיקרופלואידיים בעלי ממדים שונים במקצת. השתמש באזמל נקי וחד כדי לחתוך מכשיר בודד לגודל המתאים.
הנח פיסת סרט משרדי שקוף על הצד המעוצב של המכשיר כדי לשפר את הנראות של התכונות המעוצבות. יציאות הכניסה והיציאה מזוהות כאזורים עגולים בקצוות מנוגדים של התעלות הנוזליות הנראות לעין. הפוך את מכשיר ה-PDMS כשצד התבנית כלפי מטה והשתמש באגרוף ביופסיה של 0.75 מילימטר כדי לנקב את המכשיר לנקודות המסומנות.
ואז השליכו את האגרופים. ייתכן שתידרש פינצטה כדי להסיר את האגרופים מהמכשיר. הכנס את זכוכית הכיסוי הנקייה והמיובשת ומכשיר ה-PDMS לתוך מנקה פלזמה חמצן וטפל בפלזמה במכשיר עם ההגדרות המוצגות כאן.
מיד לאחר סיום הטיפול בפלזמה, הסר את המכשיר וכסה את הזכוכית ממנקה הפלזמה. הפוך את ה-PDMS והנח אותו במרכז זכוכית הכיסוי כך שצד התבנית ייגע בזכוכית. ודא שתעלות ההזנה מיושרות עם הגישה הארוכה של זכוכית הכיסוי.
לחץ כלפי מטה בעדינות רבה כדי לוודא שה-PDMS נאטם כנגד הזכוכית. אופים את המכשיר המורכב בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר האפייה, ודא ידנית שה-PDMS מחובר לזכוכית על ידי לחיצה עדינה על פינה אחת של המכשיר.
לאחר חיתוך צינורות פולימרים על פי פרוטוקול הטקסט, הרכיבו צמתים Y לשסתומי צביטה, אם משתמשים בהם, על ידי חיתוך והצמדה של אורכים של שני סנטימטרים של צינורות סיליקון גמישים לדוקרנים העליונים של ה-Y ואורכים של סנטימטר אחד של צינורות סיליקון לדוקרנים התחתונים של ה-Y.לאחר מכן, חתכו אורכים של 10 סנטימטרים של צינורות פולימרים ואז חברו אותם בקצה אחד לצומת המתג על ידי הכנסתם למקטעי צינורות הסיליקון של סנטימטר אחד הדוקרן התחתון של ה-Y.חבר את אורכי הצינורות בקצה השני למחטים בגודל 21 שהוסרו ממתאמי מזרק הפלסטיק שלהם והתכופפו כ-90 מעלות כתשעה מילימטרים מקצה המחט. חבר מחטים קהות בגודל 21 לקצה אחד של מקטעי הצינורות שיעברו מהמזרקים למנגנון המתג על ידי הכנסת המחטים לתוך הצינור. הכנס את הקצוות האחרים של כל אורך צינור לתוך מקטעי צינורות הסיליקון על דוקרני הכניסה של צומתי ה-Y.
לאחר מילוי מזרקים במדיום גידול חיידקים, בתוספת BSA, על פי פרוטוקול הטקסט, חבר את המזרקים הטעונים למחטים המוכנות בגודל 21, חבר לצינור הכניסה והעמיס את המזרקים למשאבות המזרק. נקה אוויר מצנרת הכניסה על ידי הפעלת משאבות המזרק בקצב זרימה גבוה וכיוון משאבות המזרק אנכית, הקשה על המזרקים כדי להביא בועות אוויר למעלה. לאחר טיהור האוויר מהמזרק, מקם את משאבת המזרק בצורה אופקית והקש או העביר בהדרגה את קווי הפולימר מהמזרקים, למעלה דרך מנגנון המתג כדי לעקור ולנקות בועות אוויר.
חזור על תהליך זה עבור בנק המזרקים השני אם אתה מחליף מדיה. לאחר טיהור בועות האוויר, הגדר את משאבת המזרק שלב שני ל-1.5 מיקרוליטר לדקה ולאחר מכן השהה את הזרימה. הנח תפסי קלסר קטנים על קטעי הצינורות הגמישים על ענף צומתי ה-Y המתאימים לשלב הבינוני השני והמשיכו להפעיל את משאבת השלב הראשון כדי לטהר את המדיום השני במורד הזרם של צומת ה-Y.
כדי לטעון את מכשיר ה-PDMS, התחל בהנחת קצות מיקרופיפטה ריקים ודקים עם טעינת ג'ל לתוך חורי היציאה של המכשיר המיקרופלואידי. בעזרת קצות טעינת ג'ל דקים עם המיקרו-פיפטה P200, הפציבו את המכשיר על ידי הזרקת מדיום המכיל מיליגרם אחד למיליליטר BSA לתוך חורי הכניסה, תוך התבוננות בקצוות ובחורי היציאה כדי לפקח על מילוי התעלות המיקרופלואידיות. דגרו את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך כחמש דקות.
לאחר מכן, בעזרת טיפים דומים, טען כל ערוץ עם התאים התלויים מחדש באמצעות הקצוות בערוץ היציאה כדי לעקוב אחר התקדמות התאים דרך המכשיר. הסר בעדינות את קצות העמסת הג'ל מחורי היציאה, ועבוד בזה אחר זה כדי למנוע נזק למכשיר. צנטריפוגה את המכשיר במיקרו-צנטריפוגה שולחנית במתאם רוטור מתאים בכ-6,000 פעמים גרם למשך 10 דקות.
ודא טעינה מוצלחת מתחת למיקרוסקופ אך מבלי להצמיד את המכשיר להכנסת שלב מחזיק השקופיות. התקן בזהירות את המכשיר הטעון על tagתוספת על ידי הדבקת זכוכית הכיסוי משני צידי ה-PDMS לתחתית תוספת הבמה. הפוך את מכלול התקן הכנסת ה-stage כך שה-PDMS פונה כלפי מעלה והנח אותו על משטח רך כגון מגבון נטול אבק.
התאם את קצב הזרימה של משאבת המזרק שלב אחד ל-35 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן עבדו עם נתיב אחד בכל פעם, הכניסו את מחט הכניסה ואז את מחט היציאה שעוברת לכוס הפסולת. לאחר בדיקה ויזואלית של המכשיר לאיתור נזילות, בדוק את צינור היציאה להופעת תאים עודפים המופיעים כפס עכור במניסקוס הבינוני, אשר ינוע לאט לאט לעבר הפסולת.
לאחר שהמכשיר פעל במשך כ-15 דקות, הגדר את משאבת המזרק בשלב הראשון ל-1.5 מיקרוליטר לדקה והשהה את הזרימה. הביאו את כל המשאבה ומנגנון המכשיר למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך והפעל מחדש את הזרימה הבינונית של שלב 1 ב-1.5 מיקרוליטר לדקה. התקן בזהירות את תוספת הבמה עם המכשיר על המיקרוסקופ, באמצעות סרט לפי הצורך כדי לנתב את צינורות הכניסה והיציאה.
אתר את המיקומים המתאימים במכשיר להדמיה והתחל בהדמיה כרצונך. שימו לב שהתאים דורשים בדרך כלל כמה שעות כדי לקרוא צמיחת פאזה מעריכית במצב יציב, ותחילת רכישת התמונה עשויה להתעכב לפי הצורך כך שההדמיה תתחיל לאחר תקופת שיווי המשקל. כדי להחליף מדיום בין סבבי הדמיה עוקבים, השהה את זרימת משאבת המזרק שלב 1, שחרר בזהירות את תפסי הקלסר מצינור הסיליקון שלב שני, העבר כל אחד מהם לצינור הסיליקון בענף השלב הראשון של צומת ה-Y, ולאחר מכן בטל את ההשהיה של זרימת משאבת המזרק שלב שני והמשך בהדמיה.
כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, לפני חיבור הצנרת המיקרופלואידית למכשיר, טעינת תאים ראשונית תיחשב מוצלחת אם כל או כמעט כל תעלות הצד המיקרופלואידיות מכילות תא חיידקי אחד או יותר. לאחר טעינת המכשיר בתחילה, הוא מאוזן בקצב זרימה גבוה יחסית. כפי שמוצג כאן, בדיקה מיקרוסקופית של מכשיר מאוזן אמורה לחשוף כמה תאים מוגבלים בקובץ יחיד ברוב ערוצי הצד.
ברגע שמכשיר מאוזן מונח על המיקרוסקופ בזרימה במהירות של 1.5 מיקרוליטר לדקה ב-37 מעלות צלזיוס, התאים יחזרו לצמיחת פאזה אקספוננציאלית אחידה וקבועה במהלך כשעתיים. ניתן לצלם תאים שחידשו את צמיחת הפאזה האקספוננציאלית באופן אמין באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או פלואורסצנטי למשך 24 שעות לפחות. הכנסת מתג בינוני מרחיבה את מגוון הניסויים שניתן לבצע, אך גם מגדילה את התדירות של אירועי מוות תאים קטסטרופליים באמצעות נוכחות בועות אוויר או אשכולות תאים בכניסה שנעקרים ועוברים דרך תעלת ההזנה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. על ידי שימוש בהליך זה, עם מדווחים פלואורסצנטיים שונים, זנים ותנאים סביבתיים, ניתן לבחון מגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות, כולל אירועים נדירים מאוד או חולפים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מיקרופלואידית לניתוח שושלות של תאי חיידקים בודדים, ובפרט תוך שימוש ב-Bacillus subtilis. הטכניקה מאפשרת מעקב ארוך טווח אחר דורות של תאים תחת תנאי גידול מבוקרים, ובכך נותנת מענה למגבלותיהן של שיטות מיקרוביולוגיות מסורתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- מיקרופלואידיקה
רקע
- שיטות מסורתיות במיקרוביולוגיה נכשלות לעיתים קרובות בניטור התנהגויות של תאים בודדים לאורך זמן.
- הבנת הפיזיולוגיה הבקטריאלית דורשת תובנות לגבי תגובות של תאים בודדים למתח סביבתי.
- מיקרופלואידיקה מציעה פתרון ליצירת תנאים ניסיוניים מבוקרים.
- Bacillus subtilis משמש כאורגניזם מודל למחקר זה.
מטרת המחקר
- לאפשר תצפית ארוכת טווח על תאים בקטריאליים בודדים.
- לחקור דפוסי תגובה של תאים למצבי עקה לאורך זמן.
- לבחון את השונות של פנוטיפים בתוך אוכלוסיות חיידקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פולימר PDMS עבור התקנים מיקרופלואידיים.
- שימוש בתבנית סיליקון (master) ליצירת תעלות מיקרופלואידיות.
- ניקוז גזים מתערובת ה-PDMS להסרת בועות אוויר.
- מעקב אחר שושלות תאים תחת תנאים מבוקרים.
תוצאות עיקריות
- תצפית מוצלחת על שושלות של תאי חיידקים בודדים לאורך מספר דורות.
- תובנות לגבי ההתנהגות ארוכת הטווח של תאים תחת עקה.
- הדגמה של יכולתה של הטכניקה לשמור על תנאים סביבתיים אחידים.
- יישומים פוטנציאליים בחקר פיזיולוגיה של חיידקים ודינמיקה של אוכלוסיות.
מסקנות
- השיטה המיקרופלואידית מספקת כלי רב-עוצמה למחקר מיקרוביולוגי.
- היא מאפשרת מחקרים מפורטים של התנהגות תאים בודדים לאורך פרקי זמן ממושכים.
- גישה זו עשויה להוביל לתגליות חדשות בפיזיולוגיה של חיידקים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
גישה מיקרופלואידית זו מאפשרת ניתוח ארוך טווח של פיזיולוגיה בקטריאלית ברזולוציה של תא בודד תחת תנאים מבוקרים בקפידה, ובכך היא נותנת מענה למגבלה מרכזית בתיקוף מטרות אנטימיקרוביאליות, שבה נתונים ממוצעים של אוכלוסיות עלולים להסוות תגובות הטרוגניות. על ידי לכידה של תגובות למצוקה ספציפיות לשושלת ושונות פנוטיפית לאורך מאות דורות, השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי הבהרה אם הפנוטיפים שנצפו הם יציבים, תורשתיים או חולפים. ביטחון תחזורי זה מסייע בתעדוף מטרות בעלות מנגנון פעולה עקבי, ובכך מפחית סיכונים לכישלון בשלבים מאוחרים של תוכניות לפיתוח תרופות אנטיבקטריאליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור דינמיקת ביטוי גנים ברמת התא הבודד לתוצאות תפקודיות תחת גירויים מוגדרים.
- ערך תפעולי: מספק נתונים כמותיים בעת רבוי (time-resolved) על פנוטיפים הטרוגניים, ובכך משפר את הביטחון בהערכות של מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר קריאות (readouts) סטנדרטיות ו可שחזרות של תא בודד, שניתן להשתמש בהן כדי לבצע בנצ'מרק להשפעות של תרכובות על מסלולי תגובה למאמץ (stress-response pathways).
- ערך תפעולי: תומך במוכנות הבדיקה באמצעות בקרה סביבתית אחידה, ובכך מפחית שונות במדידות של תגובתיות למינון (dose-response) לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על מידול מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות לכידה של תגובות חיידקיות מתמשכות לגירויים אנטימיקרוביאליים, דבר המסייע בזיהוי ביומרקרים תרגומיים.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות ממחקרי מנגנון פעולה ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים ארוכי טווח עם מעקב אחר שושלות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת השערות על מטרות ועד לאופטימיזציה של מובילים (lead optimization), כאשר הבנת תגובות דינמיות ברמת התא הבודד להפרעות סביבתיות מספקת מידע על קשרי מבנה-פעילות ועל חיזוי מנגנוני עמידות.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומכת בהורדת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת השאלה האם הטרוגניות פנוטיפית משפיעה על עקביות המטרה על פני שושלות תאים.
- סריקה (Screening): מספקת תוצאות כמותיות, המבוססות על פלואורסצנציה או ניגודיות מופע (phase-contrast), המאפשרות השוואה של תגובות למצבי עקה המושרים על ידי תרכובות לאורך זמן.
- אנליזה (Analytics): מייצרת מאגרי נתונים אורכיים של תאים בודדים המתאימים לניתוח סטטיסטי של קינטיקה של גדילה, הפעלת רפורטרים וסטרטפיקציה של האוכלוסייה.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מידול תנאי חשיפה ממושכים הרלוונטיים למיקרו-סביבות של זיהומים.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): מייצגת יכולת פלטפורמה ישימה על פני זני חיידקים וגורמי עקה מרובים, ובכך מקדמת סטנדרטיזציה בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה (target validation) על ידי פתרון שונות קלוונלית והבחנה בין תגובות אדפטיביות לתגובות סטוכסטיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות סטנדרטיזציה מיקרופלואידית, ובכך מזכיר אפקטים של סדרות (batch effects) בסינון פנוטיפי.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי אספקת תובנה מכניסטית לגבי משך הזמן ועקביות ההשפעות המתווכות על ידי המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי מטרות בעלות מנגנון פעולה הומוגני ועמיד על פני שורות תאים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור התקני מיקרופלואידיקה, טיפול סטרילי בנוזלים ומיקרוסקופיית Time-lapse.
- תלוי בגישה למכשירי ניקוי בפלזמת חמצן, משאבות מזרקים מדויקות ומיקרוסקופי פלואורסצנציה הפוכים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים להחלפת מצעים ותזמון גירויים לצורך קבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מרחיבים את השימוש לפתוגנים שאינם אורגניזמי מודל או למערכות קהילתיות מורכבות.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לכשלים קטסטרופליים כתוצאה מבועות אוויר או צברי תאים, דבר הדורש טכניקה אספטית קפדנית.
