Name: ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: למדו שיטת מיקרו-פלואידיקה לניתוח תאים בודדים של Bacillus subtilis לאורך דורות רבים. טכניקה זו מאפשרת תצפית ממושכת בתנאי סביבה מבוקרים לחקר פיזיולוגיה חיידקית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט מומן על ידי מכוני הבריאות הלאומיים תחת GM018568. פרוטוקול זה בוצעה באופן חלקי במרכז עבור ננו מערכות (CNS), חבר של נבחרת ננוטכנולוגיה מתואמת תשתית רשת (NNCI), אשר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת ה-NSF פרס 1541959 מס. CNS מהווה חלק מאוניברסיטת הרווארד. תודה רבה הן בשל תומאס נורמן ואדון נתן לעבודתם להריון, בדיית בתבנית האב המשמש עבור ההתקנים המוצגים כאן, בבניין את הגירסה המקורית של המנגנון. אנחנו גם תודה פאולסון יוהן על עצתו שיתופי יקר ותודה חברי המעבדה שלו עצה, שיפורים המשך מנגנוני microfluidic חיידקי.

<ol><li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li>
<li>Dusny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+bias+of+microcultivation+environments+on+single-cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology.</a> Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
<li>Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+and+modularity+in+cell-fate+decision+making%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory and modularity in cell-fate decision making.</a> Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).</li>
<li>Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Organ%2FBody-on-a-Chip+Devices+at+the+Convergence+of+Biology+and+Microengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering.</a> Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).</li>
<li>Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+analysis+of+C.+elegans+muscular+forces+and+locomotion+patterns+in+microstructured+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments.</a> Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+distant+biofilms+and+emergence+of+nutrient+time-sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing.</a> Science. 356 (6338), 638-642 (2017).</li>
<li>Choi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+cell-laden+microgels+using+double+emulsion+drops+with+a+sacrificial+ultra-thin+oil+shell%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell.</a> Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).</li>
<li>Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+meets+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microfabrication meets microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).</li>
<li>Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25747591">Single-Cell Physiology.</a> Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).</li>
<li>Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+physical+mechanisms+and+biofilm+processes%3A+review+of+microfluidic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods.</a> Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).</li>
<li>Yu, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+microfluidic+tracking+of+coccoid+cyanobacterial+cells+reveals+robust+control+of+division+timing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing.</a> BMC Biol. 15 (1), 11(2017).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+constant+size+extension+drives+bacterial+cell+size+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis.</a> Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).</li>
<li>Taheri-Araghi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-size+control+and+homeostasis+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-size control and homeostasis in bacteria.</a> Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).</li>
<li>Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization%2C+competition%2C+and+dispersal+of+pathogens+in+fluid+flow+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks.</a> Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).</li>
<li>Connell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+prokaryotic+social+behaviors+with+bacterial+%22lobster+traps%22%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps".</a> MBio. 1 (4), (2010).</li>
<li>Long, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+bacterial+adaptation+dynamics+at+the+single-cell+level+using+a+microfluidic+chemostat+and+time-lapse+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy.</a> Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).</li>
<li>Okumus, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+slowing-down+of+cytoplasmic+diffusion+allows+in+vivo+counting+of+proteins+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells.</a> Nat Commun. 7, 11641(2016).</li>
<li>Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+circadian+oscillations+in+growing+cyanobacteria+require+transcriptional+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback.</a> Science. 340 (6133), 737-740 (2013).</li>
<li>Baker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable%2C+Pneumatically+Actuated+Microfluidic+Device+with+an+Integrated+Nanochannel+Array+To+Track+Development+of+Individual+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria.</a> Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).</li>
<li>Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+in+a+phosphorelay+drives+stochastic+entry+into+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis.</a> EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).</li>
<li>Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+microfluidic+platform+to+uncover+basic+features+of+energy+and+environmental+stress+responses+in+individual+cells+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis.</a> PLoS Genet. 13 (7), e1006901(2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מיקרופלואידיקה הוא גמיש כי רבים מן השלבים ניתן לשנות כדי למטב את השימוש עם מינים מסוימים או זן או למטרה מסוימת. ואכן, ב פרוטוקול זה עשינו שינויים המקורי "האם מכונה" קונספט4 כדי למטב את השימוש עם B. subtilis. לעתים קרובות, התעלות שבו מרותקים התאים מהווה תכונה שכבה אחת, ואילו בפרוטוקול זה נשתמש תעלות תא דו שכבתי, עם ערוץ רדוד המקיפים את התאים. העיצוב דו שכבתי הוצג כדרך להגדיל את השטף של חומרי הזנה של מטבוליטים מתאי B. subtilis , במיוחד ב לונג (> 75 מיקרומטר) תעלות<sup c...

אחד המאפיינים הבולטים ביותר של החיים על פני כדור הארץ הוא שלה חוסן נפשי גדול ומגוון. מטרה מרכזית של הביולוגיה המולקולרית היא להבין את ההיגיון שבו תאים להשתמש גנים, חלבונים כדי להגדיל את הצמיחה ואת כושר תחת מגוון רחב של תנאים סביבתיים. כדי להשיג מטרה זו, מדענים להיות מסוגל להתבונן בביטחון כמה תאים בודדים לגדול, לחלק ולבטא את הגנים שלהם תחת מערכת נתונה של תנאים, וציין כיצד התאים מגיבים לשינויים הבאים בסביבתם. עם זאת, מסורתיים שיטות אנליטיות במיקרוביולוגיה יש מגבלות טכניות המשפיעות על סוגי שאלות שיכול הליות ממוען. לדוגמה, בצובר מבוססת תרבות הניתוחים היה שימושי מאוד במשך השנים, אך הם מציעים רק הנתונים ברמת האוכלוסייה מטשטשים את משמעות וריאציות לתא או ההתנהגויות של אוכלוסיות משנה קטנים יותר של תאים במכלל האוכלוסייה. תא בודד ניתוחים של חיידקים החיים מבוסס על מיקרוסקופ אור לחשוף התנהגות תא בודד אבל גם מוגבלים מבחינה טכנית. חיידקים הם בדרך כלל ותשמרו על רפידות agarose שמכיל מדיום הגידול, אבל התא גדילה וחלוקה קהל התצוגה מיקרוסקופיים, מכלה את החומרים המזינים זמין לאחר כמה מחזורים תא, משמעותית להגביל את התצפית זמן1, 2. יתר על כן, דלדול המקומי של חומרים מזינים, הצטברות בו-זמני של תוצרי לוואי מטבוליים עקב צמיחת תאים משתנים ללא הרף הסביבה הצמיחה המקומית תא בדרכים שקשה למדוד או לנבא. שינויים סביבתיים כאלה באמצעות רפידות agarose להוות אתגר ללימודים של מצב יציב התנהגויות או הסלולר התגובות שינויים ספציפיים צמיחה תנאי3.
טכנולוגיית Microfluidic, שבו מדיום נוזלי מוזרם באופן רציף באמצעות התקנים microfabricated, מציעה פתרון מגבלות הניסוי הקלאסי. מכשיר microfluidic יכול לשמור תאים בודדים במצב מתאים לחיות תאים במיקרוסקופ בזמן הזרימה של מדיום הגידול באופן קבוע מספק תאים עם חומרים מזינים טריים, ייעלם תוצרי לוואי מטבוליים ותאים עודף, ובכך יוצר גידול מאוד אחידה סביבה. בתנאים צמיחה מתמדת, התנהגויות התא יכול להיות שנצפו במנותק מן ההשפעה של גורמים סביבתיים, המתיר נוף ללא הפרעה של ההיגיון הפנימי של תאים. זרימת נוזל מונע מההתקן microfluidic הופך צפוף עם תאים, התבוננות שושלות תא בודד עבור עשרות או מאות דורות הופך להיות אפשרי4,5. בזמנים כאלה התבוננות ארוכה היתר זיהוי התנהגויות אחרת לגילוי תאים לטווח ארוך או נדירים. לבסוף, ההרכב של המדיום זה הזורם דרך המכשיר יכול להשתנות בכל וויל, ומאפשר תאים שחלים באיזו תחילתה של הלחץ או מבוא או הסרה של תרכובת מסוימת.
מיקרופלואידיקה נהנתה כבר מספר יישומים חשובים. למשל, זה נעשה שימוש ברקמות, איברים או התקנים הגוף-על-שבב, שבה מספר סוגי תאים אנושיים הם תרבותי משותף כדי לדמות של ויוו תנאי6; לצורך המחקר של נמטודות בתנועת סביבות microstructured7; לבדוק אינטראקציות בין biofilms חיידקי (למשל, 8); כדי להפוך את עטיפת מניפולציה של כרכים קטנים של תאים או כימיקלים (למשל, 9). Microfluidic התקנים הפכו יותר ויותר פופולרי גם בתחום מיקרוביולוגיה (עבור ביקורות מצוינות, ראה 10 ו -11), במיוחד כמו הפיזי שלהם, תכונות הזרימה גם בהתאמה לנישות מיקרוביאלית טבעית12. למשל, מיקרופלואידיקה לאחרונה ננקטה על ידי מיקרוביולוגים למטרות כאלה כמו דיוק מדידה תא גדילה וחלוקה13,14,15, ניתוח תנועה הפתוגן16, ניטור quorum חישה17 ו מעברים פיזיולוגיים18, וספירת החלבונים19, בין דוגמאות רבות אחרות. השיטה המוצגת כאן היא תוכננה במיוחד עבור הניתוח של שושלות תא החיידק בודד יותר מאשר שילובים של זנים או מינים. המכשיר microfluidic המודגמות כאן מנצל וריאציה אחת של "אמא המכונה" עיצוב4, שבו תאים גדלים קובץ יחיד בתוך תעלה microfluidic עם קצה אחד סגור, קצה פתוח אחד; צמיחת תאים וחלוקה דוחף תאים רומא יוצא את הקצה הפתוח לתוך זרימת נוזלים. הבדיקות שלנו בדרך כלל מתמקדים רק התא "אמא" מוגבל בקצה הסגור של התעלה. אנו רואים בשיטה זו כמו קידום מעל הקודם אור מבוסס מיקרוסקופיה תא בודד בשיטות אנליטיות, כגון תא הנייח על רפידות agarose. בעוד B. subtilis משמש כמודל כאן, השיטה ישימה גם למינים אחרים חיידקי (Escherichia coli הוא מודל נפוץ נוסף; מינים מסוימים עם תאים שונים הגדלים או מורפולוגיות עשויים לדרוש הזיוף של מכשירים חדשים עם ממדים שונים). השימוש של כתבים פלורסנט כדי לסמן את התאים וכדי להמחיש שינויים בביטוי הגנים מחייב שימוש המינים גנטית צייתן; עם זאת, ניתוח של צמיחת תאים, מורפולוגיה אפשריים גם ללא סמנים פלורסנט.
בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל התהליך של בדיית המאסטר סיליקון באמצעות פוטוליתוגרפיה, אשר כבר מתואר בהרחבה במקום אחר5; ניתן בקלות מיקור חוץ של מתקני מיקרו-מלאכותית גם מאסטרים. היא כוללת המכייר של מכשיר PDMS מהמאסטר סיליקון מוקשח; מליטה להתקן חתיכת זכוכית מכסה; הרכבת microfluidic כניסת ואינסטלציה outlet, קמצוץ כולל שסתומים להתיר מיתוג בינונית; passivating המכשיר, הכנת תאים חיידקיים, טעינת המכשיר עם תאים חיידקיים; חיבור הצנרת להתקן, equilibrating התאים; טעינת המכשיר על גבי מיקרוסקופ פלורסצנטיות עבור הדמיה. כי ייבוא תמונות שונות רבות ועיבוד תוכנה ניתן להשתמש בכלים כדי להמחיש ולנתח נתונים שונים של עניין4,5, תמונות לדוגמה מוצגים, אך שיטות לכידת התמונה לא נכללות פרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>זה מכונה PDMS בפרוטוקול. ישנם 2 רכיבים המעורבבים ביחס של 10:1</td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה של 0.75 מ"מ</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 מ"מ זכוכית כיסוי מס' 1.5</td><td>VWR</td><td>48393 172</td><td></td></tr><tr><td>תחריט פלזמה PE-50</td><td>תחריט פלזמה בע"מ.</td><td>PE-50</td><td>מכשיר המשמש להצמדת PDMS לזכוכית באמצעות טיפול בפלזמת חמצן</td></tr><tr><td>Tygon גמיש צינורות מזהה 0.02 אינץ', OD 0.06 אינץ'</td> <td>Saint-Gobain PPL Corp.</td><td>AAD04103</td><td>עבור החלק העיקרי של הצינור, למשל מחובר למחטים</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון, 0.04 אינץ' ID, 0.085 אינץ' OD</td><td>HelixMark צינורות סיליקון סטנדרטיים</td><td>60-795-05</td><td>עבור שסתומי צביטה וחיבור צומת Y</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906-100G</td><td>משמש כסוכן פסיבציה</td></tr><tr><td>ART ג'ל טיפים לפיפט (P200)</td> <td>מוצרים ביולוגיים מולקולריים</td><td>2155</td><td>לטעינת המכשיר עם מסנן מזרק בינוני ותאים</td></tr><tr><td>Acrodisc 32 מ"מ עם 5-&mu; m ממברנה סופור</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4560</td><td>לסינון תרביות לפני טעינת מכשיר</td></tr><tr><td>מחטים קהות 21 ga,</td> מחבר <td>1 אינץ' McMaster-Carr</td><td>75165A681</td><td></td></tr><tr><td>Y עם דוקרנים מסדרת 200, צינורות זיהוי 1/16 אינץ', פוליפרופילן</td><td>Nordson Medical</td><td>Y210-6005</td><td>החברה היא AKA Value Plastics</td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td></td><td>יחידה זו הופסקה על ידי היצרן והוחלפה על ידי Ti 2 E.</td></tr><tr><td>LB Lennox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis זן NCIB3610</td><td>Bacillus Genetic Stock Center</td><td>3A1</td><td>זן הורי מסוג פרא שונה לשימוש בניסויים המוצגים בפרוטוקול זה</td></tr><tr><td>תנור הסעת כבידה</td><td>VWR</td><td>414005-106</td><td>לריפוי PDMS ואפייה מורכבת התקנים</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש בערכת אפוקסי Scotch-Weld</td><td>3M</td><td>2216 B/A</td><td>כדי להצמיד פרוסת סיליקון ללוחית גיבוי מאלומיניום</td></tr><tr><td>סקוטש מג'יק, רוחב 3/4 אינץ'</td><td>3M</td><td></td><td>לניקוי אבק מהתקני PDMS ולהצבה מעל תכונות להגברת הנראות (מסומן "סרט משרדי" או "סרט דבק" בפרוטוקול)</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>רשום כאן כדוגמה; כמעט כל סטריאומיקרוסקופ יעשה</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W292907</td><td>לניקוי משאבת מזרק זכוכית</td></tr><tr><td>, 6 ערוצים</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>מותג מגבונים ללא אבק</td></tr></tbody></table>

ניתוח microfluidic תא בודד של bacillus subtilis

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic טכנולוגיה מתגבר על רבים מן המגבלות לשיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה. שלא כמו שיטות בצובר-תרבות, הוא מציע רזולוציית תא בודד והתבוננות ארוכה פעמים המתפרסות על-פני מאות דורות; בניגוד agarose המבוסס על דירת מיקרוסקופ, יש תנאי הגידול אחיד זה יכול להיות נשלט בחוזקה. כי זרימה רצופה של מדיום הגידול מבודד התאים במכשיר microfluidic של וריאציות לא צפוי בסביבה כימית מקומיות הנגרמת על ידי צמיחת תאים, חילוף החומרים, אותנטי שינויים בביטוי הגנים צמיחת תאים בתגובה גירויים מסוימים יכול להיות שנצפו בביטחון רב יותר. Bacillus subtilis משמש כאן כמו זן חיידקי דגם להפגין מכונה"אמא"-הקלד שיטה לניתוח הסלולר. אנו מראים כיצד לבנות לשרברב מכשיר microfluidic, לטעון אותו עם תאים, ליזום הדמיה מיקרוסקופיים ואני לחשוף תאים לגירוי על ידי מיתוג של מדיום הגידול אחד למשנהו. כתבת תגובה ללחץ משמש כדוגמה כדי לחשוף את סוג הנתונים שניתן להשיג על ידי שיטה זו. בקצרה גם נדון בהמשך יישומים של שיטה זו עבור סוגים אחרים של ניסויים, כגון ניתוח במחקרים על הנבגה חיידקי.

תא הראשונית מוצלחת טעינה, כפי מוערך על ידי מיקרוסקופ ניגודיות שלב לפני שתצרף את הצנרת microfluidic למכשיר, ייחשב כבעל כל או כמעט כל ערוצי הצד microfluidic המכיל תאים חיידקיים, אחד או יותר ( איור 3 א). טעינה אופטימלית יראה תאים אחדים בכל אחד מהערוצים, אך ערוצי ימלא בכל זאת עם תאים עקב צמיחת תאים במהלך תקופת equilibration (איור 3B). הסמטאות המסכן טעינה, שבו יחסית מעטים (&lt; 50%) לצד ערוצי נטענים עם תאים, עשוי לשמש, אך הצפיפות הנתו...

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

המטרה הכוללת של מערך ניסוי מיקרופלואידי זה היא לאפשר תצפית ארוכת טווח על תאי חיידקים בודדים בתנאים סביבתיים קבועים ומבוקרים מאוד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של החיידקים, כגון מהם דפוסי התגובה ארוכי הטווח של תאים בודדים ללחץ או כיצד פנוטיפ הטרוגני על פני אוכלוסייה משתנה עם הזמן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לצפות בשושלות תאים בודדות במשך עשרות ואף מאות דורות, בתנאי סביבה קבועים, אחידים ומבוקרים מאוד.לאחר הכנת פולימר PDMS על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו מאסטר סיליקון על פיסת נייר אלומיניום לא שבור בצלחת פטרי פוליסטירן. יוצקים את תערובת ה- PDMS הנטולת הגז על המאסטר לעומק של כחמישה מילימטרים. לאחר מכן מסירים את המנה למשך 10 דקות לפחות.מרפאים את ה-PDMS בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות ומצננים אותו לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את נייר האלומיניום המכיל את המאסטר ואת ה-PDMS הנרפא מהצלחת. קלעו אותו בזהירות וקילפו את נייר האלומיניום מגב המאסטר.ואז מקלפים בזהירות את ה- PDMS מהמאסטר. כפרוסה, כוללים בדרך כלל מספר מכשירים מיקרופלואידיים בעלי ממדים שונים במקצת. השתמש באזמל נקי וחד כדי לחתוך מכשיר בודד לגודל המתאים.הנח פיסת סרט משרדי שקוף על הצד המעוצב של המכשיר כדי לשפר את הנראות של התכונות המעוצבות. יציאות הכניסה והיציאה מזוהות כאזורים עגולים בקצוות מנוגדים של התעלות הנוזליות הנראות לעין. הפוך את מכשיר ה-PDMS כשצד התבנית כלפי מטה והשתמש באגרוף ביופסיה של 0.75 מילימטר כדי לנקב את המכשיר לנקודות המסומנות.ואז השליכו את האגרופים. ייתכן שתידרש פינצטה כדי להסיר את האגרופים מהמכשיר. הכנס את זכוכית הכיסוי הנקייה והמיובשת ומכשיר ה-PDMS לתוך מנקה פלזמה חמצן וטפל בפלזמה במכשיר עם ההגדרות המוצגות כאן.מיד לאחר סיום הטיפול בפלזמה, הסר את המכשיר וכסה את הזכוכית ממנקה הפלזמה. הפוך את ה-PDMS והנח אותו במרכז זכוכית הכיסוי כך שצד התבנית ייגע בזכוכית. ודא שתעלות ההזנה מיושרות עם הגישה הארוכה של זכוכית הכיסוי.לחץ כלפי מטה בעדינות רבה כדי לוודא שה-PDMS נאטם כנגד הזכוכית. אופים את המכשיר המורכב בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר האפייה, ודא ידנית שה-PDMS מחובר לזכוכית על ידי לחיצה עדינה על פינה אחת של המכשיר.לאחר חיתוך צינורות פולימרים על פי פרוטוקול הטקסט, הרכיבו צמתים Y לשסתומי צביטה, אם משתמשים בהם, על ידי חיתוך והצמדה של אורכים של שני סנטימטרים של צינורות סיליקון גמישים לדוקרנים העליונים של ה-Y ואורכים של סנטימטר אחד של צינורות סיליקון לדוקרנים התחתונים של ה-Y.לאחר מכן, חתכו אורכים של 10 סנטימטרים של צינורות פולימרים ואז חברו אותם בקצה אחד לצומת המתג על ידי הכנסתם למקטעי צינורות הסיליקון של סנטימטר אחד הדוקרן התחתון של ה-Y.חבר את אורכי הצינורות בקצה השני למחטים בגודל 21 שהוסרו ממתאמי מזרק הפלסטיק שלהם והתכופפו כ-90 מעלות כתשעה מילימטרים מקצה המחט. חבר מחטים קהות בגודל 21 לקצה אחד של מקטעי הצינורות שיעברו מהמזרקים למנגנון המתג על ידי הכנסת המחטים לתוך הצינור. הכנס את הקצוות האחרים של כל אורך צינור לתוך מקטעי צינורות הסיליקון על דוקרני הכניסה של צומתי ה-Y.לאחר מילוי מזרקים במדיום גידול חיידקים, בתוספת BSA, על פי פרוטוקול הטקסט, חבר את המזרקים הטעונים למחטים המוכנות בגודל 21, חבר לצינור הכניסה והעמיס את המזרקים למשאבות המזרק. נקה אוויר מצנרת הכניסה על ידי הפעלת משאבות המזרק בקצב זרימה גבוה וכיוון משאבות המזרק אנכית, הקשה על המזרקים כדי להביא בועות אוויר למעלה. לאחר טיהור האוויר מהמזרק, מקם את משאבת המזרק בצורה אופקית והקש או העביר בהדרגה את קווי הפולימר מהמזרקים, למעלה דרך מנגנון המתג כדי לעקור ולנקות בועות אוויר.חזור על תהליך זה עבור בנק המזרקים השני אם אתה מחליף מדיה. לאחר טיהור בועות האוויר, הגדר את משאבת המזרק שלב שני ל-1.5 מיקרוליטר לדקה ולאחר מכן השהה את הזרימה. הנח תפסי קלסר קטנים על קטעי הצינורות הגמישים על ענף צומתי ה-Y המתאימים לשלב הבינוני השני והמשיכו להפעיל את משאבת השלב הראשון כדי לטהר את המדיום השני במורד הזרם של צומת ה-Y.כדי לטעון את מכשיר ה-PDMS, התחל בהנחת קצות מיקרופיפטה ריקים ודקים עם טעינת ג'ל לתוך חורי היציאה של המכשיר המיקרופלואידי. בעזרת קצות טעינת ג'ל דקים עם המיקרו-פיפטה P200, הפציבו את המכשיר על ידי הזרקת מדיום המכיל מיליגרם אחד למיליליטר BSA לתוך חורי הכניסה, תוך התבוננות בקצוות ובחורי היציאה כדי לפקח על מילוי התעלות המיקרופלואידיות. דגרו את המכשיר בטמפרטורת החדר למשך כחמש דקות.לאחר מכן, בעזרת טיפים דומים, טען כל ערוץ עם התאים התלויים מחדש באמצעות הקצוות בערוץ היציאה כדי לעקוב אחר התקדמות התאים דרך המכשיר. הסר בעדינות את קצות העמסת הג'ל מחורי היציאה, ועבוד בזה אחר זה כדי למנוע נזק למכשיר. צנטריפוגה את המכשיר במיקרו-צנטריפוגה שולחנית במתאם רוטור מתאים בכ-6,000 פעמים גרם למשך 10 דקות.ודא טעינה מוצלחת מתחת למיקרוסקופ אך מבלי להצמיד את המכשיר להכנסת שלב מחזיק השקופיות. התקן בזהירות את המכשיר הטעון על tagתוספת על ידי הדבקת זכוכית הכיסוי משני צידי ה-PDMS לתחתית תוספת הבמה. הפוך את מכלול התקן הכנסת ה-stage כך שה-PDMS פונה כלפי מעלה והנח אותו על משטח רך כגון מגבון נטול אבק.התאם את קצב הזרימה של משאבת המזרק שלב אחד ל-35 מיקרוליטר לדקה. לאחר מכן עבדו עם נתיב אחד בכל פעם, הכניסו את מחט הכניסה ואז את מחט היציאה שעוברת לכוס הפסולת. לאחר בדיקה ויזואלית של המכשיר לאיתור נזילות, בדוק את צינור היציאה להופעת תאים עודפים המופיעים כפס עכור במניסקוס הבינוני, אשר ינוע לאט לאט לעבר הפסולת.לאחר שהמכשיר פעל במשך כ-15 דקות, הגדר את משאבת המזרק בשלב הראשון ל-1.5 מיקרוליטר לדקה והשהה את הזרימה. הביאו את כל המשאבה ומנגנון המכשיר למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך והפעל מחדש את הזרימה הבינונית של שלב 1 ב-1.5 מיקרוליטר לדקה. התקן בזהירות את תוספת הבמה עם המכשיר על המיקרוסקופ, באמצעות סרט לפי הצורך כדי לנתב את צינורות הכניסה והיציאה.אתר את המיקומים המתאימים במכשיר להדמיה והתחל בהדמיה כרצונך. שימו לב שהתאים דורשים בדרך כלל כמה שעות כדי לקרוא צמיחת פאזה מעריכית במצב יציב, ותחילת רכישת התמונה עשויה להתעכב לפי הצורך כך שההדמיה תתחיל לאחר תקופת שיווי המשקל. כדי להחליף מדיום בין סבבי הדמיה עוקבים, השהה את זרימת משאבת המזרק שלב 1, שחרר בזהירות את תפסי הקלסר מצינור הסיליקון שלב שני, העבר כל אחד מהם לצינור הסיליקון בענף השלב הראשון של צומת ה-Y, ולאחר מכן בטל את ההשהיה של זרימת משאבת המזרק שלב שני והמשך בהדמיה.כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, לפני חיבור הצנרת המיקרופלואידית למכשיר, טעינת תאים ראשונית תיחשב מוצלחת אם כל או כמעט כל תעלות הצד המיקרופלואידיות מכילות תא חיידקי אחד או יותר. לאחר טעינת המכשיר בתחילה, הוא מאוזן בקצב זרימה גבוה יחסית. כפי שמוצג כאן, בדיקה מיקרוסקופית של מכשיר מאוזן אמורה לחשוף כמה תאים מוגבלים בקובץ יחיד ברוב ערוצי הצד.ברגע שמכשיר מאוזן מונח על המיקרוסקופ בזרימה במהירות של 1.5 מיקרוליטר לדקה ב-37 מעלות צלזיוס, התאים יחזרו לצמיחת פאזה אקספוננציאלית אחידה וקבועה במהלך כשעתיים. ניתן לצלם תאים שחידשו את צמיחת הפאזה האקספוננציאלית באופן אמין באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או פלואורסצנטי למשך 24 שעות לפחות. הכנסת מתג בינוני מרחיבה את מגוון הניסויים שניתן לבצע, אך גם מגדילה את התדירות של אירועי מוות תאים קטסטרופליים באמצעות נוכחות בועות אוויר או אשכולות תאים בכניסה שנעקרים ועוברים דרך תעלת ההזנה.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כחמש שעות, אם היא מבוצעת כראוי. על ידי שימוש בהליך זה, עם מדווחים פלואורסצנטיים שונים, זנים ותנאים סביבתיים, ניתן לבחון מגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות, כולל אירועים נדירים מאוד או חולפים.

single-cell-microfluidic-analysis-of-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר מודל microfluidic שיתוף תרבות לתרבות סימולטני מקומי של תאים וחיידקים אפיתל. מודל זה יכול לשמש חוקר את תפקידם של אותות מולקולריים שונים מסיסים על הפתוגנזה, כמו גם מסך האפקטיביות של זני חיידקים פרוביוטיים המשוערת.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

פרוטוקול זה מספק הליך צעד אחר צעד כדי לפקח על התנהגות תא בודד של חיידקים שונים בתוך זמן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטיות זמן לשגות. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כיצד לנתח את תמונות מיקרוסקופ.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

Biofilms חיידקים הם בדרך כלל מהווים ידי subpopulations שונים של תאים מיוחדים. מתא בודד ניתוח subpopulations אלה מחייב שימוש כתבים ניאון. כאן אנו מתארים את פרוטוקול לחזות ולפקח subpopulationswithin...

מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

מקור: Pioli, R., et al., דפוס של מיקרואורגניזמים ומיקרו-חלקיקים באמצעות הרכבה בסיוע נימיות רציפה. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את השיטה של לכידת תאי Escherichia coli (E. coli) בודדים מתויגים פלואורסצנטית במלכודות מיקרופלואידיות באמצעות תרחיף נטול פחמן וזרימה מבוקרת, ואחריו תוספת חומרים מזינים כדי לעורר צמיחה והדמיה פלואורסצנטית של מיקרו-מושבות.

דפוס מיקרופלואידית ומעקב מבוסס פלואורסצנטי של צמיחת חיידקים חד-תאיים

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

פרוטוקול זה מאפשר תיאור בזמן הפתרון של גידול חיידקי בתנאי לחץ בתא בודד ואת רמות האוכלוסייה התא.

רב היקף ניתוח של צמיחה חיידקים תחת טיפולי סטרס

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

התמדה אנטיביוטית מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית רגישה לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישות לאפיון פנוטיפ ההתמדה האנטיביוטית ברמה המולקולרית והתאית לאחר חשיפת Escherichia coli למינונים קטלניים של אופלוקסצין.

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בציטומטריית זרימה וספירת חרוזים כדי לכמת נבגי חיידקים המסומנים באתידיום ברומיד. השיטה יעילה גם לניתוח הצימוד הקוולנטי של חלבונים על פני השטח של נבגים שלמים.

שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

למדו שיטת מיקרו-פלואידיקה לניתוח תאים בודדים של Bacillus subtilis לאורך דורות רבים. טכניקה זו מאפשרת תצפית ממושכת בתנאי סביבה מבוקרים לחקר פיזיולוגיה חיידקית.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

גלה סרטונים נוספים