Name: תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: למד שיטה מודיפיקציה להזרקת תאי גזע עובריים לתא הפנימי בכימריזם גבוה יותר. הטכניקה מגבירה ייצור כימרות ללא ציוד נוסף ומקצרת זמן להעברת גרמליין במחקר גנטי ופיתוחי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך [חלקית] על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה. תודה מיוחדת Shyamal Peddada לשם ניתוח סטטיסטי. אנחנו גם רוצים להודות יאו האמפרי, גארי ציפור, יוקי םינוי לסקירה של כתב היד הזאת, פרנקו דימיו עבור המשך תמיכה וייעוץ שלו.

כל הפעולות נעשו כחלק מההתנהלות הרגילה של המתקן NIEHS לדפוק את העכבר הליבה. כל העכברים הוחזקו 12:12 מחזור אור h: כהה, היו להאכיל דיאטה של NIH-31 ומים ad libitum. כל הניסויים בוצעו בהתאם החיה אכפת והוועדה שימוש של נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה.
1. הכנה בעלי חיים
<ol><li>מתרבים התורם עכברים, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J עכברים נקבה בגיל 8-10 שבועות של הגיל באופן טבעי כדי B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J עכברים גברים בין גיל 8 ו- 26 שבועות. בדוק תקעים חזותית למחרת בבוקר (E0.5).</li>
	<li>גזע עכברים הנמען, וובסטר שוויצרי עכברים הנשי בין גיל 6 ו 9 שבועות שנבחרים באופן טבעי עיקור עכברים זכרים וובסטר שוויצרי. בדוק תקעים חזותית למחרת בבוקר (E0.5).</li>
</ol>2. ES תא הכנה
<ol><li>עבור תאים AB2.2 ES 129-derieved, התרבות תאים DMEM בתוספת 15% FBS, 1% גלוטמין, 1% פן/דלקת ו- 0.1% β-mercaptoethanol. תרבות כל התאים האחרים ES לפי ההוראות של ES תא הספק, באמצעות פרוטוקולים המומלצת שלהם.</li>
</ol>3. העובר אוסף
<ol><li>
דיסקציה בעלי חיים
	<ol>
<li>להכין מספר מאכלים 60 מ מ, כ 1 לכל 5 עכברים כולל תוספת 3, עם 10 מ"ל הפיצוץ אוסף המדיה (BCM) (10% FBS IN DMEM)., 4. ובכן מגישים עם 0.5 mL BCM לכל טוב. Equilibrate ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
		<li>המתת חסד B6 (Cg)-Tyr < c-2J > עכברים הנשי /J ב E3.5 באמצעות חנק2 CO, עם קצב זרימה של 10%.</li>
		<li>לאחר המתות חסד, במקום העכברים במצב פרקדן, להרטיב את הבטן ביסודיות עם 70% אתנול.</li>
		<li>עשו את החתך הראשון דרך העור בלבד, אל נקודת האמצע של הבטן, ביצוע פתיחת רחבה ככל האפשר. לאחר מכן פתח דרך דופן הבטן, שוב עושה את החתך רחבה ככל האפשר. הערה: עושה את זה בשני שלבים מסייע להפחית או למנוע זיהום פרווה.</li>
		<li>החל מ- שחלה, והחזקת כרית השומן של השחלה עם מלקחיים בוטה, בזהירות להסיר את השחלה, oviduct, הרחם, לוקח טיפול נוסף כדי לשמור את רקמת שומן עד למינימום. הסר את הרחם כמקשה אחת, או כמו קרניים בודדים, ללא כל שינוי בהליך הבא.</li>
		<li>לאחר ההסרה, מקום הרחם תבשיל 60 מ מ המכיל הפיצוץ אוסף המדיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הסרת העובר
	<ol>
<li>להכין מזרק 10 מ"ל מלא BCM, ובכושר עם מחט 25 גרם.</li>
		<li>הרחם אחד בכל פעם, להסיר אותם מן המנה החזקה של BCM, למחוק אותם על טישו כדי להסיר את עודף דם, ומניחים בקערה 60 מ מ מתחת הגדלה נמוכה לנתח מיקרוסקופ.</li>
		<li>והחזקת בעדינות ובזהירות את הרחם מתחת הקצה הדיסטלי (ליד oviduct) עם מלקחיים לנתח, להוסיף את המחט אל המרכז של הרחם, במקביל מטוס ככל האפשר. הכנס את המחט מעבר קצות המלקחיים.</li>
		<li>ללחוץ כדי המלקחיים להחזיק את הרחם על המחט, לגרש כ- 1 מ ל BCM דרך הקרן של הרחם. הערה: יש לנקוט בשלב זה, כמו לחץ רב מדי על המזרק יגרום זרם בלתי נשלט של מדיה, לעיתים קרובות עוזב את המנה.</li>
		<li>לאחר ריקון הרחם, uteri כל עד 5 לכל צלחת 60 מ מ, מניחים את המנה חזרה בחממה עד אוסף.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אוסף העובר
	<ol>
<li>באמצעות פיפטה מזכוכית מצוירת על יד מנגנון פיפטה בפה, לאסוף את blastocysts תחת טווח ויבתר, הניצב בין 25 X 35 X. (איור 1). הערה: הפה פיפטה מנגנון מורכב של 30-40 ס מ, צינורות גמישים, מתחת לגיל 5 מ"מ זהות להוסיף 1, 000 µL פיפטה עצה, בשלב הראשון בקצה אחד, ולהצמיד את פיפטה מזכוכית בתוכו. להוסיף מסנן מזרק הקצה השני, עם צמוד 1 cc מזרק החבית, לא בוכנה, להתנהג כמו חתיכה הפה.</li>
		<li>הסרת מנות החממה, באמצעות תבנית רשת, לבחון כל חלק המנה עבור עוברי. עוברי נאספות למעלה בנפרד ומניחים על ירידת BCM בקערה משנית.</li>
		<li>לאחר איסוף כל המנות, לשטוף את העוברים פעם נוספת בטיפה של BCM טריים, ולאחר מכן מקם בצלחת טוב 4 להמתין הזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. העובר הזרקה
<ol><li>לאסוף תאים ES בנפרד עם מחט ההזרקה המבוסס על אישור.<ol>
<li>להכין צלחת הזרקת על-ידי הוספת 5-7 מ של הזרקת מדיה (DMEM, 10% FBS ו 20 מ מ HEPES) על צלחת זכוכית הזרקת התחתון. זריקות נעשים בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>שימוש microinjector אוויר או שמן, להחיל ואקום המחט הזרקת כדי למשוך תאים ES. לטפל כדי לשמור, על שטח קטן ככל האפשר בין תאים. לספור את התאים ES כאן, או בשלב ההזרקה.</li>
		<li>בחר תאים ES שהם בינוניים עד קטנים בגודלם בהשוואה לאוכלוסייה הכללית של תאים, עם משטח חלק, וללא פגמים ברור כגון וקואלות. הערה: אוכלוסיות תאים ES להשתנות במידה רבה באיכות מורפולוגי, הסטנדרטים בשימוש יהיה צורך להתאים איתם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להזריק העוברים עם תאים ES כ 15 (איור 1).<ol>
<li>לצרף פיפטה החזקה של עצה כדי microinjector השני אוויר, והצב העובר ליד הפתח של בעל. החל ואקום כדי לאבטח את העובר עם בעלי.</li>
		<li>להתאים עבור ציר z באמצעות הזזת פיפטה החזקה של למעלה או למטה כך העובר רק נוגע השקופית, ואחריו בסדר התמקדות סונה. לאחר מכן, להתאים ציר Z של המחט הזרקת כך ES תאים ליד הקצה הם בפוקוס.</li>
		<li>להתאים את העובר כעת על ידי דחיפת בעדינות מן המחט הזרקת בחלק העליון או התחתון, סיבוב זה כדי לשים את ICM במיקום הרצוי.</li>
		<li>הכנס את המחט הזרקה של סונה, את ICM או trophoblast, באמצעות דחיפה חזקה אבל מבוקרת. חלות לחץ קל microinjector של המחט הזרקת כדי לסייע למנוע את blastocoel קורסת.</li>
		<li>ברגע שהמחט שחדר את blastocoel, הפעילו לחץ מ microinjector כדי להעביר תאים ES blastocoel של העובר. השהה בקצרה כמו שפוע של המחט מתחיל לצאת העובר כדי לאפשר את הלחץ בתוך העובר יחזור לקדמותו, תוך שמירה על התאים. הערה: תאים ES קבוצת התייחסות הוזרקו בדרך כלל, בעקבות ES המסורתי של תא הזרקת פרוטוקול9, מטפל לא לגעת את ICM. תאים ES הוזרקו גם באמצעות ICM, דוחף את המחט ישירות דרך ICM (TICM) (איור 2הסרט משלים).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. העברת eEmbryos
<ol><li>העברת העוברים וובסטר שוויצרי עכברים-E2.5, באמצעות התקן העברה ניתוחי העובר, לפי נהלי ייצור. הליך כירורגי זה מחייב ללא הרדמה או טיפול מיוחד לאחר הניתוח. עכברים בבית בנפרד לאחר המעבר של העוברים, וכן באמצעות משלוח הגמילה עוקבות.</li>
</ol>

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR%2FCas+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li>
<li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li>
<li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+knockout+mouse+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li>
<li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells%3A+A+Case+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105(2015).</li>
<li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li>
<li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li>
<li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li>
<li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+embryo%22">Manipulating the Mouse embryo</a>. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2014).</li>
<li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPease%2C+S+%22Advanced+Protocols+for+Animal+Transgenesis%22">Advanced Protocols for Animal Transgenesis</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2011).</li>
<li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139(2017).</li>
</ol>

המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.

זה זמן רב כבר חשבה כי כל הפרעה של ICM יכול להוביל התמותה, למעשה, הנוכחי הבלסטוציסט microinjection פרוטוקולים עדיין מזהירים זה12,13. מה שהראתי כאן זה microinjection דרך ICM אינה פוגעת העובר, והיא מגדילה את היבול של כימרות.
המנגנון המדויק בשביל האפקט הזה לא זוהתה. עם זאת, שיבוש מכני את ICM, את hypoblast הנלווים, צריך להגביר את השכיחות של שילוב תאים ES ICM שהוקם בעקבות microinjection. עבודה בתחום iPSCs הראו כי גירוי מכני מסייע התכנות של ה...

במשך קרוב ל-25 שנים, הקמת יישוב גנטית עכברים כבר תהליך איטי, לעיתים קרובות הקשו על ידי צוואר בקבוק בשלב microinjection תא blastocysts ES לדור של germline משדר כימרות. הפיתוחים האחרונים, כולל1,CRISPR/Cas92 פילוח תאים ES, תפוקה גבוהה ES תא דור מהמגזר כמו komp ב, השתפרו הדור/הזמינות של תאים ES מהונדסים. עם זאת, הדור של germline כימרות נשאר צוואר בקבוק ביצירת עכברים מהונדסים אלה ES תאים3,4. תפוקה גבוהה ES תא דור פרויקטים שייסרו על ידי השתנות גבוהה באיכות תא ES, אשר הוא קריטי עבור יצירה מוצלחת של germline כימרות. בנוסף, חלק מהשורות תא ES שימוש בדרך כלל ידועים הגבוהה אנאפלואידיה וייצור קשה germline כימרות המוסמכת5.
פותחו שיטות רבות ליצירת עכברים עם גם שימרה גבוה יותר, או לגמרי ES תא נגזר עכברים6,7,8,9,10. בעוד כל אחת ממערכות אלה יש את היתרונות שלה, יש להם גם החסרונות. הדור של tetraploid היו בעת יצירת תאים ES 100% נגזר עכברים, הוא לא יעיל, מוגבל בדרך כלל קווים outbred 5,6. שיטות חדשות של הזרקת morula יכול להניב כימרות אחוז גבוה, מתקרב 100%, אבל בדרך כלל דורשים ציוד נוסף משמעותי (לייזרים או piezos) ואימונים10,11. במעבדות איפה טכניקות אלה שכבר נמצאים במקום, מתודולוגיה חדשה זו ייתכן שלא יהיה צורך.
המטרה של מחקר זה היתה למצוא שיטה המשתמשת טכניקות נפוצות וציוד זמינים כדי להגביר את הקצב של כמירה הדור, ומגדילים את הסיכוי germline שידור של אלל mutant להקים את המושבה העכבר עוקבות.

<table><tbody><tr><td>מחט הזרקת תא ES</td><td>Humagen</td><td>MSC-20-0</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר NSET</td><td>Paratechs</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (טכנולוגיות חיים)</td> <td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (טכנולוגיות חיים)</td> <td>10439-024</td><td>יש לבדוק בנפרד את תאימות תא ES.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-מרקפטואתנול</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מניפולטור</td><td>Leica</td><td>מיקרו מניפולטור</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מזרק</td><td>Eppendorf AG</td><td>תא חשמלית אוויר 5176</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>DM IRB</td><td></td></tr><tr><td>4 באר צלחת</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 60 מ"מ</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td></td></tr><tr><td>B6(Cg)-Tyr< c-2J>/J</td><td>Jackson Labs, בר הרבור, מיין, ארה"ב</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>עכברי וובסטר שוויצריים</td><td>Taconic, ארה"ב</td><td>Tac:SW</td><td></td></tr><tr><td>צלחת הזרקה</td><td>MatTek Corp.</td><td>P50G-0-30-F</td><td></td></tr></tbody></table>

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של chimerism

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

במאמץ להגדיל את יעילות ביצירת עכברים מהונדסים באמצעות מתודולוגיות ES תא, אנו מציגים עיבוד בפרוטוקול הנוכחי של הזרקת הבלסטוציסט. כאן אנחנו מדווחים כי סיבוב פשוט של העובר, וכן הזרקה דרך טראנס-הפנימית תא בנפח גדול (TICM) גדל אחוז עכברים chimeric מ 31% ל- 50%, עם אין ציוד נוסף או יותר התמחה הדרכה. 26 שונים מוכלאים שיבוטים, שיבוטים הכולל 35 הוזרקו על פני תקופה של 9 חודשים. היה הבדל משמעותי ההריונות או קצב ההחלמה של העוברים בין טכניקות מסורתיות הזרקת TICM. לכן, ללא שינוי כלשהו העיקריים בתהליך הזרקה, מיצוב פשוטה של הבלסטוציסט ואת הזרקת דרך ICM, משחררים את התאים ES לתוך חלל blastocoel יכולים פוטנציאל לשפר את הכמות של ייצור chimeric ובעקבות germline שידור.

מודל לינארי אפקטים מעורבים בטיפול קו תא כאפקט אקראי, שימש כדי לנתח את הנתונים התוכנה (למשל SAS (גרסה 9.2)). כל ניתוח מבוקר על המספר של עוברי העבירה לבין הקו הסלולרי. הניתוח השני מבוקר גם עבור מספר הגורים ששרדו.
במחקר זה, כל שורת ES התאים ולשכפל הוזרק שניהם עם מסורתית וטכניקות TICM, לסירוגין בין שתי השיטות לאחר כל העובר. לאחר ההזרקה, העוברים היו הפרדה על מדיח הכלים, כשהם מקובצים לפי העברה, בדרך כלל בין העוברים 12 ו- 15 לכל נמען נ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להגביר את ייצור כמירה ללא השימוש של ציוד חדש. שינוי כיוון פשוטה של העובר להזרקה ניתן להגדיל את מספר העוברים המיוצר, להפחית באופן פוטנציאלי את ציר הזמן germline שידור.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

המטרה הכוללת של הליך שונה זה היא להגביר את ייצור הכימריה מבלי לשאת בעלויות נוספות או תקופות אימון ארוכות. שיטה זו יכולה לעזור למעבדות להיות יעילות יותר בייצור כימרה, במיוחד במקרים שבהם תאי ה-ES פחות מאופטימליים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת ציוד נוסף ואינה דורשת הכשרה מיוחדת.מי שידגים את ההליך היום יהיה תומאס הגלר. הוא ביולוג וסטודנט לתואר שני שעובד במעבדת הליבה. כדי לקצור את העוברים, יש למרוח את הרחם על רקמת מעבדה כדי להסיר את עודפי הדם ולהניח את האיבר בצלחת חדשה של 60 מילימטר תחת מיקרוסקופ ניתוח בהגדלה נמוכה.בעזרת מלקחיים לניתוח כדי להחזיק בזהירות ובעדינות את הרחם ליד צינור הביצית, הכנס מחט בגודל 25 המחוברת למזרק של 10 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מדיום איסוף פיצוץ למרכז הרחם ממש מעבר לקצות המלקחיים במישור מקביל ככל האפשר. הפעל לחץ על המלקחיים כדי להדק את המחט בתוך הרחם ושטוף בעדינות כמיליליטר אחד של מדיום דרך קרן הרחם. לאחר שכל הבלסטוציסטים נפלטו, הרכיבו את מנגנון פיפטת הפה והשתמשו בפיפטה של הפה כדי להעביר את העוברים הבודדים לטיפות בודדות של מדיום איסוף פיצוץ בצלחת שנייה של 60 מילימטר.לאחר מכן שטפו כל עובר בטיפה שנייה של מדיום איסוף פיצוץ והעבירו את העוברים לכלי של ארבע בארות עד להזרקתם. כדי להתחיל, השתמש במיקרו-מזרק כדי להחיל ואקום על מחט ההזרקה. הנח צלחת של תאי ES מתחת למיקרוסקופ ההזרקה שבו מחוברים מחט ההזרקה ופיפטת מחזיק העובר.חיוני להצלחת ההזרקה להקדיש זמן להגדרה נכונה של המיקרוסקופ. זה כולל את הכמות הנכונה של מדיה במחט ואת היישור הנכון של ציר ה-z. השתמש במיקרו-מזרק כדי להחיל ואקום על מחט ההזרקה.תוך שמירה על מרווח קטן ככל האפשר בין התאים, משוך פנימה תאים עובריים קטנים עד בינוניים ללא פגמים ברורים מצלחת העוברים. לאחר איסוף לפחות 15 תאים, מקם עובר ליד פתח המחזיק. מרחו ואקום כדי להדק את העובר למחזיק והזיזו את פיפטת האחיזה למעלה או למטה כדי לכוונן את ציר ה-z עד שהעובר רק נוגע במגלשה.התמקד בסדר באזור הפלוסידה והתאם את ציר ה-z של מחט ההזרקה עד שהתאים העובריים ליד קצה המחט יהיו בפוקוס. במידת הצורך, השתמש במחט ההזרקה כדי לגלגל בעדינות את הבלסטוציסט עד שמסת התא הפנימית תהיה במצב המתאים להזרקה. באמצעות דחיפה יציבה אך מבוקרת, הכנס את מחט ההזרקה דרך אזור הפלוסידה למסת התא הפנימית והפעל לחץ קל על המיקרו-מזרק של מחט ההזרקה כדי לעזור למנוע מהבלסטוקואל לקרוס.לאחר שהמחט חדרה לבלסטוקואל, הפעל לחץ על המיקרו-מזרק כדי להעביר את כל תאי הגזע העובריים לעובר, ועצור לזמן קצר כאשר שיפוע המחט מתחיל לצאת מהעובר כדי לאפשר ללחץ בעובר לחזור לקדמותו תוך שמירה על התאים. לאחר הזרקת כל הבלסטוציסטים, השתמש במכשיר העברת עוברים לא ניתוחי כדי להעביר את העוברים לעכברי וובסטר שוויצרי שלב 2.5 על פי הוראות היצרן ושכן את העכברים בנפרד לאחר כל העברה דרך הלידה והגמילה שלאחר מכן. בניסוי מייצג זה, שיעורי ההריון לא השתנו בין מסת התא הפנימית הטרנס שהוזרקה לקבוצת הביקורת שהוזרקה באופן מסורתי ומספר זהה של גורים שרדו עד לגמילה מכל קבוצה.יש לציין כי בעוד שמספר העכברים בעת הגמילה נותר ללא שינוי, מספר גבוה משמעותית של גורים מקבוצת מסת התא הפנימית הטרנס שהוזרקה הפגינו כימריזם בצבע פרווה בהשוואה לקבוצת הביקורת שהוזרקה. החלק הטוב ביותר בטכניקה זו הוא שהיא דורשת רק שינוי פשוט בכיוון העובר כדי להקל על ייצור גדול יותר בכימרות. הגדרה נכונה של המיקרוסקופ היא חיונית.אם המיקרוסקופ והמניפולטורים אינם מוגדרים כראוי ומתוחזקים היטב, תהליך ההזרקה לא יעבוד. אם אתה חדש בהזרקות עוברים, חזרה היא הדרך היחידה ללמוד. למתחילים, טיפול בעוברים נוטה להיות החלק הקשה ביותר בהליך.היכולת להעביר עוברים ביעילות מצלחת אחת לאחרת מבלי לאבד אף אחד היא החלק המכריע ביותר בניסוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד שינוי פשוט בטכניקת ההזרקה הסטנדרטית שלך יכול לעזור לך להיות יעיל יותר בייצור כימרה.

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל סיסית הקשיח עוברים רך, מניפולציה של עוברים medaka מעורב יותר מאשר דג הזברה. וידאו זה מציג צעד אחר צעד נהלים כיצד לתפעל עוברים medaka, כולל dechorionation, גובר agarose עבור הדמיה השתלת תאים לייצור מפלצות. נהלים אלה הם חיוניים כדי להשתמש medaka ו דג הזברה במעבדה כדי לנצל את מלוא היתרונות של התכונות המשלימות שלהם לנתיחה הגנטי של פונקציות הגנום החולייתנים.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

באמצעות קצה בסדר micropipettes אנו מזריקים פלסמיד דנ"א לתוך תחומי משנה של somites עוף או צינורות עצביים. ריכוז של פלסמיד מותאם לייצר תאים transfected יחיד. לאחר מכן, אנו מאפשרים לתאים להתפתח אוכלוסיות משובט.

תא יחיד transfection בעוברים צ&#39;יק

אנו מדגימים כאן reprogramming epigenetic באמצעות העברה תא סומטי גרעיני (SCNT) יכול לשמש ככלי לייצור מודלים העכבר עם קולטן T מוגדרים מראש תא (TCR) ספציפיות. עכברים אלה transnuclear לבטא את TCR המתאימה מוקד אנדוגניים שלהם תחת שליטה של ​​האמרגן אנדוגני.

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

אנו מדגימים שיטה להשתלת תאים מתורבתים לאתרים מוגדרים של עוברי עכברים מוקדמים כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם in vivo. אנו מציגים גם שיטת אלקטרופורציה אופטימלית המשתמשת בנימי זכוכית בקוטר ידוע, המאפשרת העברה מדויקת של DNA אקסוגני לכמה תאים בעוברים.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמרה ישירה של פיברובלסטים עובריים של עכברים לתאי גזע טרופובלסטים מתפקדים ויציבים לחלוטין על ידי ביטוי יתר של Tfap2c, Gata3, Eomes ו-Ets2.

פרוטוקול עבור ההמרה הישירה של Murine העוברי פיברובלסטים לתאי גזע Trophoblast

אנו מתארים פרוטוקול לביצוע בתוך הרחם השתלת (דליה) דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר של הזרקת במודל מאתר. פרוטוקול זה ניתן להציג תאים וקטורים ויראלי, חומרים אחרים לתוך לסביבה הייחודית של העובר החיסון-סובלנית.

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

בשיטה זו, רקמות הלב עובריים הם בניתוח microdissected, חלופה מועדפת, הנקרא fluorescently, מושתל לתוך רקמות עובריים המארח. זה מספק פלטפורמה לומד הפרט או רקמות ברמה התפתחותית הארגון תחת תנאים והמודינמיקה חוץ רחמי, ו/או שינו סביבות paracrine/juxtacrine.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

המטרה הכוללת של מאמר זה היא לתאר כיצד לבצע בהזרקה תוך תאית של אובו של חומרים אקסוגניים לעוברי עוף. גישה זו שימושית מאוד כדי לחקור את הביולוגיה ההתפתחותית של עוברי תרנגולות.

באובו הזרקה תוך-וסקולרית בעוברי עוף

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

למד שיטה מודיפיקציה להזרקת תאי גזע עובריים לתא הפנימי בכימריזם גבוה יותר. הטכניקה מגבירה ייצור כימרות ללא ציוד נוסף ומקצרת זמן להעברת גרמליין במחקר גנטי ופיתוחי.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

גלה סרטונים נוספים