הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים
9 במאי 2018
הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין פרוסות טריות של רשתית דג הזברה לניסויים הדורשים הדמיה חיה של חלבונים פלואורסצנטיים או חיישנים ביולוגיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הראייה, כגון התפקידים הפיזיולוגיים והמטבוליים של יוני סידן בסוגי תאים ספציפיים ובתאים תאיים בתוך הרשתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מידע מרחבי וזמני על מטבוליטים מרכזיים ומולקולות איתות ברקמות חיות.
כדי לאפשר להסיר את אפיתל פיגמנט הרשתית, או RPE, מדגי הזברה, התאימו את הדג לשעה לפני הכנת פרוסות רקמה. עבור תא חיתוך, צבעו קווי לק על שקופית. בעזרת לק שקוף, צבעו קווים צרים ליצירת מלבן.
צבעו מחדש את הלק פעם אחת כשהוא יבש. אם החדר ישמש להדמיה סטטית, או לניסויי הזרקה עם זרימת תמיסה מינימלית, השתמש במזרק כדי למרוח שתי רצועות מקבילות של ג'לי נפט על כיסוי, באורך סנטימטר אחד ובמרחק של 0.5 סנטימטרים זה מזה. עכשיו הכינו את הלהבים.
ראשית, נקו סכין גילוח פיפיות עם אתנול והניחו לו להתייבש באוויר. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך אותו לחתיכות של סנטימטר אחד בערך. לאחר מכן, הניחו את תא החיתוך על הבמה של פורס הרקמות, מרכזו אותו אופקית על הבמה, וסמנו את הקצה הארוך בטוש קבוע ליישור.
לאחר מכן, טען חתיכת להב על זרוע הפורס. אבטח את הלהב, כך שהקצה יהיה מעל אמצע המגלשה ועובר במקביל למשטח המגלשה, אך אינו נוגע בלק. לאחר מכן הורד את זרוע הלהב באמצעות רבע סיבוב.
עכשיו, נסה לחתוך נייר פילטר. התקן מחדש את הלהב במידת הצורך. כדי להמשיך, בעזרת המזרק הפקידו נקודה אחת קטנה של ג'לי בצלחת של 10 סנטימטרים, כ -1.5 סנטימטרים מנקודת האמצע.
לאחר מכן לחץ על הצד היבש של הכיסויהחליק לתוך הג'לי בעזרת מלקחיים. לאחר מכן, הניחו נקודה קטנה נוספת של ג'לי כסנטימטר אחד מקצה הכניסה של תא ההדמיה. כעת, השתמש במחט בגודל 20 כדי ליצור שתי רצועות מקבילות דקות באורך סנטימטר אחד של ג'לי נפט לאורכן לאורך מרכז תא החיתוך במרחק של כסנטימטר אחד זה מזה.
לאחר מכן העבירו את דג הזברה לצלחת ועקרו את הדג בצוואר הרחם ללא עריפת ראש. כעת, השתמש בלולאת חוט כדי לשחרר את רקמת החיבור סביב עין אחת ולאחר מכן משוך את העין קדימה בעדינות. לאחר מכן, חתכו בזהירות את עצב הראייה הלבן מתחת לעין באמצעות מספריים, אך אל תחתכו את החלק האחורי של העין.
כדי להמשיך, העבירו את העין לצלחת של תמיסת רינגר קרה על קרח. ואז קצור את העין השנייה. המשך לעבוד באור אדום עד להסרת כל ה-RPE.
לאחר מכן, העבירו עין אחת לטיפה של תמיסת רינגר קרה על מגלשת זכוכית על צלחת פטרי. לאחר מכן הניחו את המנה מתחת למיקרוסקופ חיתוך בעל עוצמה נמוכה כדי לנתח את העין באור אדום. ראשית, חודרים את הקרנית בעזרת מלקחיים עדינים.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי להסיר בעדינות חתיכות של קרנית שבירה שקופה וסקלרה כסופה. לאחר מכן הסר והשליך את העדשה, ואת רוב הסקלרה כדי לבודד את העין. בטיפול מינימלי יש להסיר את כל פיסות השומן והסקלרה שנשארות מחוברות לגביעונית העין מבלי להסיר את הרשתית.
אם הרשתית נפרדת מה-RPE, המשך בזהירות יתרה כדי להימנע מפגיעה ברשתית העדינה. כעת, מקם מחדש את גביעונית העין עם הצד הפתוח כלפי מטה וחתוך אותה לשליש או לרבעים עם להב חדש. השליכו את חתיכות גביעונית העיניים המעוקלות מכדי לשטח.
חלקים אלה לרוב קטנים מכדי להיות שימושיים בכל מקרה. כדי להרכיב את חלקי הרשתית, הרטיבו פיסת נייר פילטר בתמיסה של רינגר והשתמשו במלקחיים שטוחים כדי להניח אותה ליד חלקי העיניים. לאחר מכן טבלו את נייר הסינון והטישו בתמיסה הקרה של רינגר.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי למקם חתיכות רשתית על גבי נייר סינון עם ה-RPE וקולטני האור כלפי מעלה. טפל בעדינות בקצוות חלקי העיניים בעזרת מלקחיים עדינים כדי לכוון אותם לקו יחיד במרכז נייר המסנן. כעת משטחים את הרשתית באמצעות מלקחיים כדי להרים את נייר הסינון כשהרשתית מחוברת והנחתו על מגבת נייר יבשה.
במשך כשלוש שניות, הניחו לכוח נידוף הנוזל לתוך מגבת הנייר לשטח את הרשתית. עבדו את כל חלקי הרשתית בצורה זו, רק אל תתנו להם להתייבש. כעת, מרחו טיפה מהתמיסה של רינגר והשתמשו במלקחיים עדינים כדי לקלף את כל היריעות השחורות שנותרו של RPE מהרקמה.
מקלפים בעדינות, ואם הרשתית מתרוממת מהנייר, מנפים עוד תמיסה כמו קודם והיא אמורה להשתטח שוב. כעת העבירו את הנייר עם חתיכות הרשתית לשקופית וחתכו את הנייר למלבן והשאירו כ -0.5 סנטימטרים משני צידי שורת הטישו. לאחר מכן, העבר את נייר הסינון לתא החיתוך המוכן.
דחפו את קצוות נייר הסינון הארוכים לתוך קווי הנפט הדקים בעזרת מלקחיים, ולאחר מכן טבלו את הרשתית בשלוש עד ארבע טיפות של תמיסת רינגר קרה. ראשית, העבירו את התכשיר לשלב פורס הרקמות. מקם את הקצה הארוך לאורך הקו המסומן ואבטח את קצוות החדר לבמה בעזרת סרט מעבדה.
לאחר מכן, החל מקצה אחד, חותכים את הרשתית ונייר הסינון באמצעות לחץ יציב ועדין על זרוע החיתוך. בדקו שהפרוסה הראשונה נחתכה במלואה, ולאחר מכן המשיכו להשתמש במיקרומטר כדי לחתוך פרוסות בעובי של כ-400 מיקרון. לאחר מכן, העבירו את החדר עם החלקים הפרוסים לצלחת הפטרי המכילה את הכיסוי המוכן, שישמש כסולם הדמיה.
הציפו את המנה בתמיסת רינגר קרה והניחו אותה על במת המיקרוסקופ המנתח. כעת, בהגדלה נמוכה, השתמש במלקחיים כדי לאבטח רצועה ולהעביר אותה לסולם ההדמיה על ידי החלקת צלחת הפטרי שמתחתיה. סובבו את הפרוסות 90 מעלות וקברו את שולי נייר הסינון לתוך הג'לי.
חשוב לשמור על הרשתית שקועה ולהימנע מכל מגע ישיר עם הרשתית. לאחר מכן, מקם מחדש את הפרוסות בסולמות כך ששכבות הרשתית ייראו בבירור. עבור הפרוסות בכל קצה של הסולם, גרמו לרשתית לפנות פנימה לכיוון הפרוסות האחרות כדי למזער את התנועה במהלך ההזרקה או הזרימה.
השלך את כל הפרוסות שאינן נדבקות היטב לנייר. כעת, הכתים את הרקמה. בינתיים, הכן את תא ההדמיה ומנגנון ההזרקה.
ראשית, שטפו את הצינור בתמיסה של רינגר, עד שלא יישארו בועות אוויר. לאחר מכן, חבר את הצינור לכניסת תא ההדמיה וסגור את זין העצירה. לאחר מכן, מלאו מחדש את המזרק בתמיסה להזרקה והצמידו אותו מחדש לצינור.
כעת, השתמש במלקחיים כדי להעביר את סולם ההדמיה המוכן לתא ההדמיה. לחץ אותו לתוך נקודת הג'לי ליד קצה הכניסה ומלא את החדר בתמיסה של רינגר כדי לכסות את הפרוסות. לאחר מכן המשך בהדמיה.
באמצעות הטכניקות המתוארות, ניתן לדמות פרוסות רוחביות בצורה מושלמת דרך כל שכבות הרשתית. כאשר מסובבים מעט, צרורות של הקטעים החיצוניים יהיו גלויים. באמצעות צביעת PI, ניתן לסלק תאים מתים מהניתוח.
לקולטני אור שליליים בריאים יש מורפולוגיה מוארכת מקוטבת סטריאוטיפית. כאשר הם נמצאים ברינגר מחומצן, ניתן לצלם אותם עד ארבע שעות. אסטרטגיית הדמיה אחת היא לדמיין את הדינמיקה של הרטיקולום האנדופלזמי של קולטני האור של החרוט ביחס לגרעין.
שימוש ברקמות המבטאות GFP, והחרוט ER, תוך צביעה נגדית בצבע גרעיני. ניתן להשתמש באסטרטגיה דומה כדי לראות את השלד הציטולוגי של האקטין עם רקמה המבטאת אקטין התמזג GFP. באמצעות הדמיה בזמן, ניתן לצפות בדינמיקה תאית כגון תנודות סידן ציטוזוליות בקולטן אור חרוט.
לדוגמה, תוך דלדול איזוטוני של נתרן בתא ההדמיה, ניתן להשתמש ב-GCaMP כדי לדמיין עלייה בריכוזי הסידן הציטוזולי. על ידי כימות תגובות הקרינה ממקטעים חיצוניים של חרוט יחיד, גופי תאים וסינפסות, ניתן לקבוע את דינמיקת הסידן התוך-תאית במהלך מניפולציות פרמקולוגיות וכן הלאה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באור אדום לפני הסרת ה-RPE.
משטחים בזהירות את כוסות העיניים לפני החיתוך, ושומרים את הפרוסות שקועות כל הזמן. לאחר השליטה, ניתן לבצע חיתוך רקמות, חיתוך והכנה להדמיה תוך פחות מ-30 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין פרוסות רשתית מדגי זברה כדי לחקור את חילוף החומרים והפיזיולוגיה בסוגי תאים ספציפיים בתאים תאיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת פרוסות טריות של רשתית דג זברה כדי לאפשר הדמיה חיה באמצעות חיישנים ביולוגיים פלואורסצנטיים. השיטה נועדה לשפר את ההבנה של תפקידי יוני סידן בסוגי תאים מסוימים ומדורים בתאי הרשתית, ומספקת מידע מרחבי ומרחיב על תהליכים ביולוגיים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של הרשתית
- טכניקות הדמיה
רקע
- הדמיית רקמת הרשתית מאפשרת ניתוח של תא בודד שלא ניתן להשיג באמצעות ביוכימיה.
- דגי זברה הם מודל חשוב להבנת תפקודי הרשתית של בעלי חוליות.
- הטכניקה מספקת תובנות לגבי דינמיקת יוני הסידן בתאי הרשתית.
מטרת המחקר
- לחקור את התפקידים הפיזיולוגיים והמטבוליים של יוני הסידן בתאי הרשתית של דגי זברה.
- לפתח שיטה אמינה להשגת פרוסות רשתית חיות להדמיה.
- לשפר את ההבנה של תהליכים תאיים במחקר הראייה.
שיטות בשימוש
- פלטפורמת הדמיה אקס ויוו המשתמשת בפרוסות טריות של רשתית דג זברה.
- המודל הביולוגי כולל תאי רשתית ומדורים תאיים שלהם.
- שלבים קריטיים כוללים התאמת תאורה של הדג, ניתוח זהיר והשרייה בתמיסת רינגר קרה.
- השיטה מתארת את הכנת תאי חיתוך, טכניקות חיתוך ומיקום פרוסות הרשתית להדמיה.
תוצאות עיקריות
- השיטה אפשרה תצפית על דינמיקת יוני הסידן ברקמות הרשתית החיות.
- תובנות מרכזיות לגבי איתות מטבולי ועיבוד חזותי בסוגי תאים מובחנים ברשתית נאספו.
- ההבנה המכנית של השפעות יוני הסידן על תפקודיות הרשתית השתפרה.
מסקנות
- מחקר זה קובע פרוטוקול המאפשר הדמיה חיה ברשתית דג זברה, ומקדם את ההבנה של תהליכים תאיים הקשורים לראייה.
- התובנות שהושגו יכולות לתרום להשלכות רחבות יותר לחקר מנגנונים עצביים בבריאות וברפואה של הרשתית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables live imaging of retinal cell types in adult zebrafish, providing a physiologically relevant system for studying calcium signaling and metabolic processes in vision research. By preserving retinal architecture and cellular diversity, it supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical neuroscience programs. The approach bridges discovery biology with translational relevance for retinal disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in specific retinal cell types using fluorescent biosensors.
- Operational Value: Provides spatially resolved data on calcium dynamics to clarify pathway involvement in retinal function.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular targets to functional readouts in intact tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates reproducible retinal slices suitable for perfusion-based imaging and compound testing.
- Quantitative Output: Enables fluorescence-based measurements of metabolite fluxes in defined cellular compartments.
- Scalability: Allows serial slice preparation from single animals for multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of retinal cell types implicated in blinding diseases through live imaging of biosensors.
- Translational Continuity: Maintains retinal lamination and cell-type specificity from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights to inform target prioritization in vision therapeutics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional validation of retinal targets prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium signaling roles in photoreceptors, bipolar, and microglial cells.
- Screening: Delivers standardized, perfusion-compatible tissue for evaluating compound effects on retinal physiology.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence readouts for assessing target engagement and pathway modulation.
- Translational Research: Connects in vitro findings to intact retinal tissue physiology, enhancing predictive confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal studies of retinal cell biology and drug response.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in retinal signaling.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized slicing, mounting, and imaging procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional retinal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of vision therapeutics based on human-relevant retinal data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, retinal dissection, and live tissue imaging.
- Dependent on access to vibratory tissue slicers, confocal microscopes, and perfusion systems.
- Necessitates standardization across teams for consistent slice thickness and RPE removal.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissection and slicing parameters.
- Practical limitations include tissue viability duration and sensitivity to mechanical stress during preparation.
