כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים
4 באפריל 2018
כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.
המטרה הכוללת של זרימת עבודה חדשה זו היא לקבוע את התפוסה או הסטוכיומטריה של שינויים לאחר תרגום חלבונים באתרי אצטילציה ספציפיים. זרימת עבודה ספקטרומטרית מסה חדשה זו מספקת רמה גבוהה יותר של דיוק של כמות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ויסות חלבון הפיך על ידי שינוי לאחר תרגום כגון אצטילציה של ליזין או אתרי סוקסינילציה משתנים ביותר ועשויים לשנות את תפקוד החלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שסטוכיומטריה ברמת האתר של אצטילציה של ליזין וסוקסינילציה ותמציתיות נקבעות במדויק והשיטה יכולה לקבוע סטוכיומטריה מפפטידים עם שאריות ליזין מרובות. טכניקה זו רלוונטית מאוד מכיוון שהיא חושפת אצטילציה ותמציתיות סטוכיומטריה או פרופורציה שונה לעומת לא שונה במקום למדוד שינוי שפע יחסי חסר מימד. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשהבנתי ששימוש ברכישות בלתי תלויות בנתונים וכימות מבוסס MS2 לניתוח סטוכיומטריה ישפר מאוד את דיוק המדידה. הכנת שלושה שכפולים של 100
סקירה כללית
מחקר זה מציג תהליך עבודה חדש לספקטרומטריית מסות לצורך כימות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות של חלבונים, ובמיוחד אצטילציה וסוצינילציה. השיטה משפרת את דיוק המדידה על ידי קביעת התפוסה הספציפית לאתר או הסטוכיומטריה של מודיפיקציות אלו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ספקטרומטריית מסות
- פרוטאומיקה
רקע
- שינויים פוסט-טרנסלציונליים ממלאים תפקיד מכריע בתפקוד חלבונים.
- הבנת תהליכי האצטילציה והסוצינילציה חיונית לחקר הבקרה ההפיכה על חלבונים.
- ייתכן ששיטות מסורתיות חסרות דיוק בכימות של מודיפיקציות אלו.
- מחקר זה נועד לשפר את דיוקן של מדידות הסטוכיומטריה.
מטרת המחקר
- פיתוח זרימת עבודה (workflow) לכמתור accurate של אצטילציה וסוצינילציה של חלבונים.
- זיהוי אתרי הליזין שעברו את רמת המודיפיקציה הגבוהה ביותר והשפעתם על תפקוד החלבון.
- אספקת שיטה המסוגלת לנתח פפטידים בעלי שאריות ליזין מרובות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח רציומטרי של מודיפיקציות אנדוגניות.
- אצילציה כימית כמותית באמצעות אנהידרידים המסומנים באיזוטופים יציבים.
- ספקטרומטריית מס ברכישת נתונים בלתי תלויה (Data-independent acquisition).
- הכנת מספר חזרות להבטחת הדיוק.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת קביעה מדויקת של סטוכיומטריה ברמת האתר.
- היא חושפת את הפרופורציה של שאריות ליזין שעברו מודיפיקציה לעומת כאלו שלא.
- דיוק מדידה גבוה יותר בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- זיהוי אתרי אצטילציה וסוצינילציה מרכזיים המשפיעים על תפקוד החלבון.
מסקנות
- תהליך עבודה זה משפר משמעותית את הכימות של מודיפיקציות בחלבונים.
- הוא מספק תובנות לגבי הבקרה של תפקוד חלבונים באמצעות אצטילציה וסוצינילציה.
- הטכניקה ישימה למגוון רחב של מחקרי פרוטאומיקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של סטוכיומטריה של אצטילציה וסוצינילאציה של ליזין באתרים ספציפיים מאפשר הערכה מדויקת של תפוסת מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות, דבר שחיוני להבנת ויסות חלבוני הפיך במסלולים של מטרות תרופתיות. שיטה זו מספקת מדידה בלתי מוטה של רמות המודיפיקציה ברחב הפרוטאום, ותומכת בתיקוף מטרות על ידי הבחנה בין אתרי אצילציה רלוונטיים ביולוגית לבין רעשי רקע. על ידי אספקת נתונים סטוכיומטריים במקום שינויים בשפע יחסי, היא מגבירה את הביטחון החזוי בהפחתת סיכונים מכניסטיים במהלך שלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות התפוסה (occupancy) של אצטילציה וסוצינילציה בשאריות ליזין ספציפיות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה מדויקת של סטוכיומטריה של המודיפיקציה, מה ששופך אור על ההשפעה הפונקציונלית על פעילות החלבון.
- ערך חיזוי: משפר את הוודאות לגבי המטרה על ידי זיהוי האתרים המודיפיקטיים בעלי הסבירות הגבוהה ביותר לשנות את התפקוד, ובכך מסייע בתיעדוף תיק הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים באמצעות אספקת נתונים על תפוסת אצילציה ברמת האתר.
- פלט כמותי: משתמש בשטחי שיאי יוני פרוגמנטים מ-DIA-MS כדי לאפשר כימות מדויק עם הפרעות מופחתות, המתאים לסטנדרטיזציה של הבדיקה.
- סקילביליות: מקלה על המוכנות לסריקה באמצעות ניתוח פרוטאומי הניתן לשחזור ובעל יכולת ריבוי-דגימות (multiplex) של אצטילציה וסוצינילאציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין פרופילית המודיפיקציות בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות זיהוי אתרי אצילציה רלוונטיים למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקדת בערך ניבוי על ידי קביעת הסטוכיומטריה מפפטידים בעלי שאריות ליזין מרובות, מה שמאפשר רזולוציה ספציפית לאתר.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בהחלטות המשך/עצירה (go/no-go) על ידי חשיפת המודיפיקציות של הליזין בעלות משמעות פונקציונלית לעומת כאלה שהן סטוכסטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות ראשוני של המטרה ועד לזיהוי תרכובות מובילות, ומספקת נתונים סטוכיומטריים על אצטילציה וסוצינילאציה התורמים להבנה מכניסטית ולהבנת השפעותיהן של תרכובות על תפקוד חלבונים.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות התפוסה (occupancy) של מודיפיקציות באתרים ספציפיים בתגובה להפרעות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות (assays) באמצעות מדידה כמותית וסטנדרטית של רמות מודיפיקציה על פני דגימות פרוטאומיות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות סטוכיומטריות מדויקות באמצעות כימות יוני פרגמנט ב-DIA-MS, מה שמאפשר השוואה מדויקת של מצבי מודיפיקציה.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי זיהוי אתרי אצילציה בעלי תפוסה גבוהה שעשויים לשמש כביומארקרים או כמדדי קריאה (readouts) מכניסטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת פרוטאומית ניתנת לשימוש חוזר לצורך פרופיל PTM עקבי בין פרויקטים ומחלקות מטרה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי באמצעות סטוכיומטריה מדויקת ברמת האתר של אצטילציה וסוצינילאציה, ובכך מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות DIA-MS וכמותיות המבוססות על Skyline, תוך מזעור השונות הטכנית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי זיהוי אתרי מודיפיקציה בעלי תפוסה גבוהה ורלוונטיות פונקציונלית, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכונים, המבוסס על ראיות פונקציונליות המונעות על ידי מודיפיקציות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות ובטכניקות להעשרה של PTM.
- תלות במכשור המסוגל לבצע DIA וביצירת ספרייה ספקטרלית לצורך כימות מדויק של יוני פגמנט.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת הדגימות ואצילציה כימית לצורך שחזוריות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום סבב העבודה על מערכות מודל מגוונות או סוגי רקמות שונים.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות ליכולת הגילוי של פפטידים ולנגישות של שאריות ליזין בתערובות מורכבות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
