ממוקד הדור הבא רצפי וכן ביואינפורמטיקה צינור להעריך גורמים גנטיים של המחלה החוקתי

המטרה הכוללת של ריצוף ממוקד של הדור הבא היא להבהיר את הגורמים הגנטיים של מחלות חוקתיות שונות על ידי התמקדות באזורים גנומיים בעלי עניין מיוחד. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח הנוגעות לאידיאולוגיה הגנטית של מחלה, במיוחד כאשר יש קשרים גנטיים ידועים בעבר. טכניקה זו יעילה ביותר.

הוא מייצר מיליוני קריאות בפרק זמן קצר, אנו מקבלים אותן בעלות נמוכה יחסית, יש עומס חישובי נמוך יחסית, במיוחד כאשר אנו משווים אותו לגישות ריצוף אחרות של הדור הבא. ההשלכות של הטכניקה משתרעות על אבחון מחלות נוירודגנרטיביות, שהן הטרוגניות מבחינה פנוטיפית וגנטית, אך יש להן מיקומים גנטיים רבים הקשורים אליה. למרות ששיטה זו מכוונת במיוחד למחלות נוירודגנרטיביות, ניתן ליישם אותה גם על מחלות חוקתיות שונות אחרות עם אזורי עניין גנומיים שזוהו בעבר.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהעיבוד הביואינפורמטי הנדרש לניתוח סופי של וריאנטים נדירים יכול להיות אינטנסיבי מבחינה חישובית וליצור מקורות שגיאה רבים. בהליך זה, דגימות דם אנושיות נאספות בשלושה-ארבעה צינורות EDTA K2 של מיליליטר כדי לספק נפח כולל של כ-12 מיליליטר. צנטריפוגה של דגימות הדם בכוח הכבידה פי 750 למשך 20 דקות.

זה יפצל כל דגימה לשלב עליון של פלזמה, שלב אמצעי דק של לויקוציטים ושלב תחתון של אריתרוציטים. פיפטה את הפלזמה מהחלק העליון של דגימת הדם באמצעות פיפטת העברה חד פעמית. יש לחלק למספר של 500 מיקרוליטר ולאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס לניתוח ביוכימי עתידי.

חלץ DNA מדגימת הדם עם ערכת מיצוי דם לפי הוראות היצרן. ה-DNA המופק משמש לאחר מכן להכנת ספריית ריצוף לריצוף הדור הבא. לאחר השלמת הפעלת הרצף, במחשב, חפש את הקבצים בסביבת המחשוב המבוססת על ענן צמתים על-ידי בחירה באפשרות הפעל בלוח הניווט.

בחר את הפעלת הרצף המתאימה כדי לנווט לדף סיכום ההפעלה. בחר הורד כדי לקבל נתונים מהענן. מתיבת הדו-שיח שמופיעה, בחר את קבצי FASTQ כסוג הקובץ להורדה ולחץ על הורד.

בדף סיכום הפעלה של סביבת המחשוב מבוססת הענן, נווט אל תרשימים כדי לנתח את איכות הרצף המופעל עם הנתונים השונים המופקים על-ידי סביבת המחשוב. בדף הפעל תרשימים, חפש את האיור שכותרתו נתונים לפי מחזור, תחת תרשים בחר עוצמה, ותחת ערוץ בחר את כל הערוצים כדי להפיק את תרשים עוצמת האות. בחלונית Run Navigation, בחר בכרטיסייה Indexing QC כדי למצוא את ההיסטוגרמה של בקרת איכות יצירת אינדקס, שנמצאת בצד ימין של הדף.

בדף הפעל סיכום של סביבת המחשוב מבוססת הענן, לחץ על מדדים בלוח הניווט הפעל כדי לנווט אל מדדי האיכות. תחת צפיפות קלווין למילימטר בריבוע, ודא שצפיפות האשכול של ריצת הרצף נמצאת בטווח המומלץ על ידי ערכת ההעשרה שבה נעשה שימוש. במקרה זה, 1, 200 עד 1, 400 קלווין למילימטר בריבוע.

תחת האחוז הכולל גדול או שווה ל- Q30, ודא שהערך גדול או שווה ל- 85% המשקף את איכות קריאות הרצף. תחת מיושר, ודא שהערך דומה לאחוז השליטה החיובית שנכלל בהפעלת הרצף. לדוגמה, אם נעשה שימוש בבקרה חיובית של 1%, האחוז המיושר הצפוי יהיה בערך 1 עד 5% ושינויים בתוך כמה נקודות עשרוניות מקובלות.

התחל תהליך זה על ידי ייבוא קריאות רצף FASTQ לתוכנת עיבוד הנתונים. בתוך אזור הניווט, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר תיקיה חדשה. תן שם לתיקיה כך שתהיה בהירות לגבי הפעלת הרצף שבוצעה.

מסרגל הכלים בחלק העליון, בחר ייבוא ומהרשימה הנפתחת, בחר את הפלטפורמה שבה בוצע הרצף. למטרות ONDRISeq, נבחרת אילומינה. בתיבת הדו-שיח, נווט ובחר את קבצי ה-FASTQ מריצת הרצף המעובדת.

מהאפשרויות הכלליות של תיבת הדו-שיח, לחץ על התיבה לצד קריאות משויכות אם הרצף השתמש בכימיה של קצה משויך. מתיבת הדו-שיח Paired read info, בחר Paired-end אם קובץ FASTQ לקריאה קדימה מופיע לפני הקריאה ההפוכה ברשימת הקבצים. הגדר את מרחק הקריאה המינימלי המזווג לאחד ואת המרחק המקסימלי ל-1000.

מתוך אפשרויות Ilumina של תיבת הדו-שיח, בחר הסר קריאות שנכשלו. מהרשימה הנפתחת ציון איכות, בחר את צינור ה-NGS ששימש לרצף. בחר הבא בחלק התחתון של תיבת הדו-שיח.

בחר שמור וצור תיקיות משנה לכל יחידת אצווה. בחר הבא בחלק התחתון של תיבת הדו-שיח. בחר את התיקיה שנוצרה קודם לכן.

זה המקום שבו ייובאו קבצי ה- FASTQ. בחר סיום בתחתית תיבת הדו-שיח והמתן עד לייבוא קבצי FASTQ. לחץ על הכרטיסייה תהליכים כדי לראות את מצב ייבוא הקובץ.

לאחר מכן, תכנן זרימת עבודה בתוך התוכנה לביצוע רצף מחדש וקריאת וריאנטים בהתאם להוראות היצרן. עיצוב זרימת העבודה של הרצף מחדש וקריאת המשתנים הוא ההיבט הקשה ביותר בהליך זה. הצוות שלנו חקר שיטות עבודה מומלצות והשתמש בניסוי וטעייה כדי להגיע לזרימת העבודה החזקה ביותר שתתאים לצרכים שלנו.

כדי להפעיל את קבצי הקריאה של רצף FASTQ המיובא דרך זרימת העבודה הביואינפורמטית המותאמת אישית, התחל בזיהוי זרימת העבודה בארגז הכלים של התוכנה ולחיצה כפולה עליה. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, אתר את התיקיות של קובצי FASTQ שיובאו בתוך אזור הניווט. סמן את כל התיקיות על-ידי בחירתן באזור הניווט ולאחר מכן לחץ על התיבה לצד אצווה.

השתמש בחץ הפונה ימינה כדי להעביר את הקבצים לרכיבים שנבחרו. לחץ על הבא בתחתית תיבת הדו-שיח. בתוך תיבת הדו-שיח, סקור את סקירת האצווה כדי לוודא שנבחרו קבצי FASTQ הנכונים ולאחר מכן לחץ על הבא.

סקור את שלבי זרימת העבודה בתיבת הדו-שיח כדי לוודא שנבחרו הקבצים ומיקומי הייצוא הנכונים בעת עיצוב זרימת העבודה. שלבים אלה כוללים מיפוי קריאות לרצף ההפניה, הסרת קריאות ממופות כפולות, יצירת סטטיסטיקה עבור אזורי יעד, ייצוא קבצי BAM, ייצוא טקסט מופרד באמצעות טאבים, סינון המבוסס על חפיפה וייצוא קבצי VCF. בשלב האחרון בתיבת הדו-שיח, טיפול בתוצאות, בחר באפשרות שמור בתיקיית הקלט.

לחץ על סיום בתחתית תיבת הדו-שיח. השלב האחרון הוא לבצע הערת וריאנטים על קובץ ה-VCF של כל דגימה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. המתודולוגיות שהודגמו בסרטון זה יושמו על 528 דגימות DNA של משתתפים מאנשים שנרשמו ל-ONDRI.

דגימות הופעלו על לוח ONDRISeq ב-22 ריצות של 24 דגימות בכל ריצה. בסך הכל, נתוני הריצוף נקבעו כאיכותיים עם כיסוי מדגם ממוצע של פי 78. ממוצע של 95.6% מהקריאות הותאמו לרצף הייחוס, ולכל ריצות ONDRISeq היו יותר מ-90% מהקריאות מופו.

מבין הקריאות הממופות, 92.0% וציון פרד גדול או שווה לרבעון השלישי. כדי להדגים את התועלת של זרימת עבודה ממוקדת זו של NGS, מוצגת דוגמה של גבר בן 68, חולה פרקינסון, המראה ירידה ב-N על תפוקה. שונות מבוארת נאספת כדי לזהות את אלה שסביר ביותר שיהיו בעלי משמעות קלינית, כפי שמסומן על ידי התיבות האדומות.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להתאים את השלבים כראוי לפלטפורמת הריצוף, לערכת ההעשרה בה נעשה שימוש ולצורכי המחקר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנטיקה להשיג נתונים איכותיים וספציפיים לאזור תוך שמירה על זול יותר ממקבילותיה באקסום השלם ובגנום השלם.