וזמינותו מבוססי Cytometry זרימה כדי לזהות תרכובות לשבש קשירה של ליגנד כימוקין שכותרתו Fluorescently CXC 12 לקולטן כימוקין CXC 4
10 במרץ 2018
זרם איגוד הסלולר מבוססי cytometry assay מתואר זה משמש בעיקר ככלי מיון כדי לזהות תרכובות המעכבות את הכריכה של ליגנד כימוקין CXC fluorescently שכותרתו 12 (CXCL12) לקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4).
המטרה הכוללת של הבדיקה מבוססת התאים היא לזהות מולקולות הנקשרות לקולטן מצומד לחלבון G. מבוסס על יכולתם להתחרות בליגנד המסומן פלואורסצנטי על קשירה לקולטן. בדיקת קשירת תחרות יכולה לתמוך בגילוי תרופות קולטן מצומד לחלבון G.
כפי שנדגים עם פרוטוקול זה עבור קולטן הכימוקין, CXC4. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שתאים חיים משמשים לניתוח קשירה קליטה במקום תכשירי זיכרון. וכי נמנע השימוש בבדיקות תווית רדיואקטיביות.
למרות ששיטה זו הוגדרה בתחילה כדי לחקור את הקישור לקולטן הכימוקין CXCR4, ניתן לפתח אותה גם עבור GPCR אחרים שעבורם קיימים ליגנדים בעלי תווית פלואורסצנטית. כדי להתחיל, חלק 100 מיקרוליטר של תמיסה מורכבת לצלחת תחתונה שקופה 96 מעוגלת היטב, על פי פריסה ניסויית מוגדרת מראש. הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף תאים ממאגר ריאגנט לתוך צלחת 96 הבאר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
דוגרים את הצלחת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של 100 ננוגרם למיליליטר CXCL12 המסומן פלואורסצנטי ממאגר ריאגנטים דומה לבארות של 96 לוחות הבאר. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
לאחר מכן, צנטריפוגה את צלחת 96 הבארות בכוח הכבידה פי 400 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנטנט מהתאים הגלולים על ידי היפוך הצלחת. יבש את הצלחת על טישו.
הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר SA טרי ממאגר ריאגנטים לבארות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. המשך מיד לצנטריפוגה שוב של הצלחת, למשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 400 בטמפרטורת החדר. שוב הסירו את הסופרנטנט, על ידי הפיכת הצלחת ואז ייבושה על טישו.
לבסוף, השעו בעדינות את כדור התא ב-200 מיקרוליטר של 1% פרפורמלדהיד מומס ב-PBS. שלב זה יתקן את התאים. כדי לנתח את הדגימות לפי ציטומטריית זרימה, הפעל את המכשיר ופתח את התוכנה המתאימה.
בחר את הפרמטרים הסלולריים שיוצגו באופן חזותי בפורמט בלוק נקודות, כאזור פיזור קדימה, אזור פיזור צדדי, ובתצוגת היסטוגרמה, ערוץ הזיהוי של פלואורו ארבע. בחר דוגמה אחת. לדוגמה, דגימת בקרה שלילית, לביצוע שער של אוכלוסיית תאים הומוגנית מוגדרת על סמך פרמטרי הפיזור קדימה ופיזור הצד.
התאם את ההגדרות להעמסת התאים למכשיר ציטומטריית הזרימה. בחר שלוש תערובות לפני ההזרקה. בחר הזרקה אוטומטית של 100 מיקרוליטר של תאים קבועים, והשתמש בקצב זרימת דגימה של 1.5 מיקרוליטר לשנייה.
הפעל את הדוגמה על-ידי בחירה באפשרות השגת נתונים. פרמטרי הפיזור קדימה ופיזור הצד עבור דגימה זו, כמו גם זיהוי הפלואורו ארבע יופיעו כעת על המסך. כעת, בחר את כלי שער התוכנה.
בהתבסס על הדמיית פיזור קדימה ופיזור נקודות פיזור צד, הגדר מראש אוכלוסיית תאים הומוגנית ובת קיימא על ידי שער. בחר כדי לנתח 20,000 אירועים לדגימה. המשמעות היא שעבור כל דגימה, 20,000 תאים הנופלים בתוך שערים מוגדרים מראש, ינותחו בסופו של דבר.
איסוף הנתונים יימשך עד שיגיע למספר זה של אירועים. התחל את הריצה על ידי בחירה תחילה, הבארות שיש לנתח. לאחר מכן בוחר בארות ריצה.
מכשיר ציטומטריית הזרימה ינתח כעת את הדגימות הללו אחת אחת, על ידי רישום עוצמת הקרינה הממוצעת עבור כל דגימה. מה שמתאים לאות הפלואורסצנטי הממוצע מ-20,000 התאים שנופלים בתוך השער שהוגדר מראש. לבסוף, בצע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול.
לאחר דגירה מוקדמת של תאי ג'ורקט עם ריכוזים גבוהים של AMD3100, אנטגוניסט CXCR4 לא מבוסס וספציפי. עוצמת הקרינה הממוצעת המשקפת את הקישור של CXCL12 המסומן מופחתת כמעט לחלוטין לרמות הרקע. זה מדגים את הקישור הספציפי ביותר של CXCL12 ל-CXCR4 המתבטא בתאי ג'ורקט.
תרכובות שאינן מסוגלות להתחרות עם CXCL12 המסומן על קשירה בקולטן CXCR4, כמו אנטגוניסט CCR5 Maraviroc, לא ישפיעו על עוצמת הקרינה הממוצעת. לעומת זאת, תרכובות פעילות מאוד יעשו זאת באופן תלוי מינון. לאחר הצפייה בסרטון, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע בדיקת קשירה קולטת תחרות באמצעות תאים חיים וציטומטריית זרימה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר בדיקת קישור תאית המבוססת על ציטומטריה של זרימה, שמטרתה לזהות תרכובות המעכבות את הקישור של CXCL12 ל-CXCR4. השיטה משתמשת בתאים חיים כדי לנתח את הקישור לקולטן, ובכך נמנעת מהשימוש בסימון רדיואקטיבי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- בדיקות קישור תאיות
- קולטנים מצומדים לחלבון G
- גילוי תרופות
רקע
- CXCL12 הוא כימוקין הנקשר ל-CXCR4, קולטן המצומד לחלבון G.
- זיהוי מעכבים של קישור זה יכול לסייע בפיתוח תרופות.
- שיטות מסורתיות כוללות לרוב רדיואקטיביות, דבר שבדיקה זו שואפת למנוע.
- שימוש בתאים חיים מספק ייצוג מדויק יותר של אינטראקציות ביולוגיות.
מטרת המחקר
- פיתוח כלי סריקה לזיהוי תרכובות המעכבות את קישור ה-CXCL12 ל-CXCR4.
- הדגמת היתרונות שבשימוש בתאים חיים במבדקי קישור.
- תמיכה במאמצי גילוי תרופות המכוונות לקולטנים מצומדים לחלבון G.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציטומטריית זרימה לניתוח קישור תאי.
- שימוש בליגנדים מסומנים פלואורסצנטית להערכת תחרות על קישור.
- בדיקות בתאי חיים להערכת אינטראקציות של רצפטורים.
- הימנעות מסימון רדיואקטיבי במערך הניסויי.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מזהה בהצלחה תרכובות המעכבות את קישור ה-CXCL12.
- ניתוח תאים חיים מספק נתונים רלוונטיים יותר בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- השיטה יעילה לסריקת מועמדים פוטנציאליים לתרופות.
- התוצאות תומכות בהיתכנות השימוש בבדיקה זו בתהליכי גילוי תרופות.
מסקנות
- הבדיקה המבוססת על ציטומטריית זרימה היא כלי בעל ערך לזיהוי מעכבי CXCR4.
- שימוש בתאים חיים משפר את הדיוק של מחקרי קישור.
- הימנעות משימוש ברדיואקטיביות מפשטת את התהליך הניסויי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת קישור תחרותית מבוססת ציטומטריית זרימה זו מאפשרת לצוותי ביו-פארמה לזהות מולקולות קטנות המשבשות אינטראקציות בין CXCL12 ל-CXCR4, יעד מרכזי בתוכניות פיתוח לתחומי האונקולוגיה ומחלות דלקתיות. באמצעות שימוש בתאים חיים וליגנדים פלואורסצנטיים, השיטה נמנעת משימוש ברדיואקטיביות תוך אספקת נתוני קישור רלוונטיים פיזיולוגית. היא תומכת בתיקוף יעדים ובזיהוי מובילים (lead identification) בשלבים מוקדמים, על ידי אספקת תוצאים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך תעדוף תרכובות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מדידת השפעות ישירות של תרכובות על קישור רספטור-ליגנד בהקשר תאי טבעי.
- ערך תפעולי: מספק קריאה פונקציונלית המפחיתה את הסיכון ב-CXCR4 כמטרה, באמצעות אישור מכניסטי של פעילות התרכובת.
- ערך חיזוי: תומך במיון הפורטפוליו על ידי זיהוי תרכובות עם פרופילי עיכוב תלויי-מינון המעידים על מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של עיכוב קישור באמצעות עוצמת פלואורסצנציה ממוצעת, מה שמאפשר ניתוח של קשר מבנה-פעילות.
- ערך תפעולי: ניתן להתאמה לפורמט של פלטה בעלת 96 בארות, מה שמעלה את התפוקה של קמפיינים של סריקה תוך שמירה על עקביות הבדיקה.
- יכולת שימוש חוזר: מבסס פלטפורמה סטנדרטית שניתן להחיל על GPCRs אחרים כאשר קיימים ליגנדים פלואורסצנטיים, ובכך מפחית את המאמץ הנדרש לפיתוח מחדש.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שימוש בתאי Jurkat חיים כדי לשקף ביטוי רצפטורים ודינמיקת קישור פיזיולוגית, ובכך לשפר את הרלוונטיות התרגומית.
- ערך תפעולי: יצירת נתונים התואמים להערכה פרה-קלינית בהמשך, באמצעות אישור השפעות של תרכובות ספציפיות למטרה.
- צמצום סיכונים: הפחתת תוצאות חיוביות שגויות על ידי הבחנה בין מעכבי CXCR4 ספציפיים לבין תרכובות לא ספציפיות (למשל, Maraviroc אינו מראה השפעה).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, ומספקת נתוני קישור המנחים את התהליך של מעבר מלהיט למוביל. היא משלימה סריקה פנוטיפית על ידי הוספת עומק מכניסטי לאפיון התרכובת.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות של שיבוש הקישור של CXCL12 ל-CXCR4 בתאים חיים שנובע מחומרים כימיים.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות שלבי אינקובציה, שטיפה וקיבוע סטנדרטיים התואמים לקריאות של ציטומטריית זרימה.
- אנליטיקה: מספק את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת כפלט כמותי להשוואת עוצמת הפעולה והיעילות של חומרים במינונים שונים.
- מחקר תרגומי: משתמש בשורת תאים רלוונטית למחלה (Jurkat) המבטאת CXCR4, ובכך מקשר בין נתוני הקישור להשפעה טיפולית פוטנציאלית בסרטן ובדלקת.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת קישור מודולרית הניתנת להעברה בין מטרות GPCR, ובכך ממקסם את ההחזר על ההשקעה (ROI) בפיתוח הבדיקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במעורבות המטרה על ידי הדגמת קישור ספציפי וניתן לת 대체 של CXCL12 ל-CXCR4.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות טיפול סטנדרטי בתאים, זמני אינקובציה ופרוטוקולי gating של ציטומטריה של זרימה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי סינון מוקדם של תרכובות שחסרה להן פעילות ספציפית למטרה בתהליך הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי זיהוי תרכובות בעלות פרופילי עיכוב ברורים התלויים במינון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול ציטומטריית זרימה, פיצוי (compensation) ואסטרטגיות סינון (gating) עבור אוכלוסיות תאים חיוניים.
- תלוי בגישה לציטומטרים של זרימה המסוגלים לזהות אותות פלואורסצנטיים בערוץ המתאים (למשל, FITC או שווה ערך).
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת התאים, דילול התרכובות ותנאי האינקובציה בין סבבי הסריקה השונים.
- התאמה ל-GPCRs אחרים דורשת פיתוח או רכישה של ליגנדים מסומנים פלואורסצנטית הספציפיים לקולטן המטרה.
- מגבלות מעשיות כוללות את משך הבדיקה (~90 דקות בתוספת זמן ניתוח) ואת הצורך באופטימיזציה של ריכוז הליגנד כדי להבטיח יחסי אות-רעש חזקים.
