שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9
10 באפריל 2018
עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשיג שיבוש גנים מהיר ויעיל באמצעות CRISPR/Cas9 ותאי אב המטופויאטיים ראשוניים באמצעות גישת ריבונוקלאופרוטאין. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחומי המטופואיזיס נורמלי וממאיר, כגון מהן ההשלכות המולקולריות והפנוטיפיות של אובדן הגן X.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה, מהירה וחסכונית במיוחד. הזמן המשוער הדרוש משלב הרעיון של הניסוי ועד לביצועו קצר משבוע.
למרות ששיטה זו עברה אופטימיזציה עבור תאי אב המטופויאטיים, ניתן ליישם אותה על סוגי תאים אחרים, כגון תאי T ראשוניים, קווי תאים המטופויאטיים של עכברים ובני אדם ודגימות לוקמיה ראשוניות. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו כיצד גישות אחרות של מתן CRISPR/Cas9, כולל פלסמידים ווירוסים, היו רעילות לתאים שלנו או שזמני האספקה שלהן היו איטיים. על מנת לעצב RNA מדריך יחיד מעניין, נווט תחילה לאתר CRISPRscan.
בהתבסס על התא המבוקש, לחץ על כפתור העכבר או האדם ולאחר מכן הזן את הגן המעניין בתיבת החיפוש של UCSC ולחץ על בצע. לאחר מכן, התקרב לאקסון שאליו ברצונך למקד. בדוק אם רצפי יעד RNA חד-מובילים רשומים תחת תחזיות CRISPRscan בכותרת גנים.
לאחר מכן, לחץ על RNA מוביל יחיד מטרה המסומן כמלבן ירוק והעתק את הרצף המלא המוצג תחת רצף אוליגו. לאחר מכן הדבק את הרצף במסמך טקסט. לאחר מכן, הוסף את הנוקלאוטידים ATAGC לשלושת הקצה הראשוני של הרצף.
בצע את ההזמנה עבור הרצף באורך מלא. כעת, כדי לסנתז את תבנית ה-DNA עבור ה-RNA היחיד-מדריך, יש להמיס ולאחר מכן לדלל את ה-RNA החד-מוביל קדימה ואת הפריימרים ההפוכים האוניברסליים. לאחר מכן הוסף את כל הריאגנטים בצינור PCR כדי לבצע את ה-PCR החופף.
לאחר יצירת תגובת ה-PCR, הנח את הצינור בתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית. לאחר סיום התוכנית, טהר את מוצר ה-PCR באמצעות עמודות טיהור DNA. לדלל את ה-DNA ב-11.5 מיקרוליטר של מאגר פליטה.
לאחר מכן, השתמש במאגר הפליטה כריק בספקטרופוטומטר. מדוד את ריכוז ה-DNA של הדגימה על הספקטרופוטומטר. ראשית, מערבבים את ה-DNA המנומק, פוספטים דאוקסי-נוקלאוטיד, מאגר התגובה ותערובת האנזים T7 RNA פולימראז בצינורות רצועת ה-PCR.
לאחר מכן דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מכן, מרחו את חומר הניקוי RNase כדי להסיר RNase מהכפפות בשימוש. לאחר מכן, התאם את הנפח של כל דגימת RNA ל-50 מיקרוליטר עם מים נטולי נוקלאז.
טהר את ה-RNA בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, יש להוציא את ה-RNA ב-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. ראשית, השתמש במים נטולי נוקלאז כדי לרוקן את הספקטרופוטומטר ולאחר מכן למדוד את ריכוז ה-RNA המנופח.
השתמש באי-הכללה של טריפן כחול כדי לספור את מספר התאים. עבור כל שכפול, אסוף 200,000 תאים ברי קיימא לכל שכפול, ולאחר מכן הוסף מי מלח חוצץ פוספט כדי לשטוף את התאים. ואז סובב את הצינור ב -300 פעמים גרם למשך שבע דקות.
לאחר צנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט. במהלך הצנטריפוגה, דגרו 1.5 מיקרוגרם של Cas9 עם מיקרוגרם אחד של RNA יחיד בצינור PCR למשך 20 עד 30 דקות. זאת כדי להכין את מתחמי Cas9-sgRNA RNP עבור כל שכפול.
לאחר חישוב נפח מאגר ההשעיה T הנדרש, ממיסים את כדור התא המתקבל במאגר ההשעיה T.לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף התאים המומס בצינור ה-PCR עם מתחמי Cas9-sgRNA RNP. לאחר מכן, הפעל את יחידת האלקטרופורציה. החלק את הקובטה למחזיק הקובטה.
לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של מאגר E.הגדר את התנאים במכשיר האלקטרופורציה. כדי לבצע את האלקטרופורציה, החזק תחילה את פיפטת האלקטרופורציה ולאחר מכן הושיט את הטופר ותפס את הדיסק בתוך קצה הפיפטה, ולאחר מכן לחץ בחוזקה על הפיפטה כלפי מטה כדי להדק את הקצה. לאחר מכן, מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 10 פעמים.
צייר 10 מיקרוליטר מהדגימה וודא שאין בועות אוויר. לאחר מכן, הכנס את הקצה ישירות למאגר האלקטרוליטי בקוביית האלקטרופורציה. לאחר מכן לחץ על התחל על המסך.
תן להודעה המלאה להופיע על המסך. ואז הסר את הפיפטה מהקובטה. לאחר מכן, הוציאו תכולה מהקובטה לבאר המלאה במדיום תרבית HSPC חדש.
כדי לחקור את היעילות של אלקטרופורציה של Cas9-sgRNA RNP, HSPCs שבודדו מהעכברים עוברים אלקטרופורטציה עם RNase מדריך יחיד המכוון ל-GFP או tdTomato. HSPCs אלה ביטאו בכל מקום GFP או tdTomato. ניתוח זרימה ציטומטרי מראה כ-75 ו-74% אובדן של ביטוי GFP או tdTomato ב-HSPCs ברמת החלבון.
לאחר מכן, בדיקה מבוססת T7 endonuclease one מבוצעת עם DNA מוגבר PCR ממיקום ה-GFP של התאים האלקטרופורטיים. זאת כדי לכמת את יעילות שיבוש הגנים של GFP. תוכנת ImageJ משמשת לחישוב היחס בין העוצמות של הרצועות השסועות לרצועות הבלתי מחורצות כדי לחשב את אחוז המחשוף.
היעילות של שלושה RNA מובילים יחידים שונים המכוונים ל-CD45 אנושי נבדקת בקו התאים HL-60 AML. ציטומטריית זרימה מציגה את RNA1 עם מדריך יחיד כיעיל ביותר עם יעילות נוקאאוט של 98% בהשוואה לבקרה. לאחר מכן, נוקאאוט CD45 מבוצע גם ב-HSPCs חיוביים ל-CD34 בדם טבורי אנושי ראשוני באמצעות RNA1 מוביל יחיד.
ניתוח ציטומטריית זרימה מראה כמעט 80% תאים עם אובדן CD45 ללא שינוי בביטוי CD34 בהשוואה ל-Cas9 בלבד. על מנת לחקור השתלה של HSPCs אנושיים מסוג CD45, תאי מח עצם וטחול נקצרים מעכברי NSG חיוביים ל-CD34 שעברו טרנספטציה רטרו-אורביטלית לניתוח, ומראים תאים ערוכים כחיוביים ל-HLA-ABC ו-CD45 שליליים. לאחר השליטה, ניתן להשלים פרוטוקול זה תוך שלושה ימים, אם הוא מבוצע מתוקן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על כל המשטחים והריאגנטים נקיים מ-RNase, לוודא שיבוש גנים יעיל בטכניקות מרובות ולהשתמש בבקרות הניסוי המתאימות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן, לסנתז ולהעביר ריבונוקלאופרוטאינים Cas9-sgRNA לתאי אב המטופויאטיים כדי להשיג שיבוש גנים מהיר ויעיל.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לשיבוש גנים מהיר באמצעות CRISPR/Cas9 בתאי המטופואזה ראשוניים של עכבר ובני אדם, תוך שימוש בגישת ריבונוקלאופרוטאין. שיטה זו מאפשרת יעילות עריכה גבוהה בזמן ובעלות מינימליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- עריכת גנים
- ביולוגיה של תאי המטופואזה
- טכנולוגיית CRISPR/Cas9
רקע
- CRISPR/Cas9 הוא כלי רב עוצמה לשיבוש גנים.
- תאי המטופואזה ראשוניים חיוניים לחקר ההמטופואזה.
- שיטות הובלה מסורתיות עבור CRISPR עלולות להיות רעילות או איטיות.
- פרוטוקול זה נועד לשפר את היעילות ולהפחית עלויות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה ויעילה לשיבוש גנים.
- בדיקת ההשפעות של אובדן גנים בתאי אב המטופואטיים.
- אספקת פרוטוקול שניתן ליישום בסוגי תאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון של RNA מדריך יחיד (sgRNA) באמצעות CRISPRscan.
- סינתזה של RNA והכנת קומפלקסים של ריבונוקלאו-פרוטאין (RNP) מסוג Cas9-sgRNA.
- ביצוע אלקטרופורציה לתאי הלואמיפוייזיס ראשוניים באמצעות קומפלקסי ה-RNP.
- הערכת יעילות השבוב הגנטי באמצעות ציטומטריה זרימה ובדיקות T7 endonuclease.
תוצאות עיקריות
- הושגה הפחתה של כ-75% בביטוי הגן המטרה ב-HSPCs.
- הוכפשה יעילות knockout של 98% בשורת תאי AML מסוג HL-60.
- הודגם שיבוש גנים יעיל בתאי דם ראשוניים משgore של אדם.
- אושר השתקעות (engraftment) של תאים ערוכים בעכברי NSG.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל וניתן להשלמתו בתוך פחות משבוע.
- הוא ישים עבור סוגים שונים של תאי המטופואטיים.
- שמירה על תנאים נקיים מ-RNase היא קריטית להצלחה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
שיבוש יעיל של גנים בתאי המטופואטיים ראשוניים מאפשר תיקוף מהיר של מטרות והסרת סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות המטולוגיות. גישת ה-ribonucleoprotein CRISPR/Cas9 מפחיתה אי-ודאות ביולוגית על ידי השגת יעילות גבוהה של נוק-אאוט (knockout) ללא DNA חיצוני, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בבחירת מטרות מוקדמת. תהליך עבודה זה מאיץ את לוחות הזמנים של הגילוי בתוכניות אונקולוגיות ואימונולוגיות על ידי אספקת שיטה ניתנת להרחבה וכלכלית לגנומיקה פונקציונלית במערכות המטופואטיות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השבתה מהירה של גנים (gene knockout) בתאי אב המטופויים ראשוניים של עכברים ובני אדם.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי השגת יעילות השבתה של עד 98% בקווי תאי AML ו-80% בתאי HSPC ראשוניים מדם חבל טבילה אנושי.
- ערך אסטרטגי: מסייע בביסוס הביטחון במטרה ובמיון תיקי פיתוח על ידי מתן אפשרות להערכה מהירה של פנוטיפים הנובעים מאובדן גנים במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת תאי המטופואזיס בעלי נוק-אאוט (knockout) שעברו תיקוף לצורך סריקת תרכובות ובדיקות פנוטיפיות המשך.
- ערך תפעולי: אספקת שיבוש גנים סטנדרטי וניתן לשחזור באמצעות אלקטרופורציה של RNP, עם קריאות של ציטומטריה של זרימה כמותית ואנדונוקלאז T7.
- ערך אסטרטגי: מאפשר שימוש בפלטפורמה ניתנת להרחבה בתאי מקור, קווי תאים ודגימות ראשוניות של לוקמיה לצורך תיקוף עקבי של המטרה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים השתחא של HSPCs אנושיים ערוכים בעכברי NSG, ובכך תומך ברצף תרגומי משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה יעילה של שלושה ימים התואמת ללוחות זמנים פרה-קליניים למחקרי תיקוף מטרות.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות מכניסטית במטרות המטופוייטיות, מה שמאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון בקווי פיתוח באונקולוגיה ובאימונולוגיה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של התרכובת המובילה, ומאפשרת תיקוף תפקודי מהיר של מטרות המטופלו בהמטופואזה לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות שיבוש גנים יעיל בתאי המטופואז ת הראשוניים.
- סריקה: מספק מודלי knockout מוכנים לבדיקה עם הדירות גבוהה ותוצרי מדידה כמותית להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליזה: מייצר יעילויות עריכה מדידות באמצעות ציטומטריה זרימה ובדיקות T7 endonuclease, המאפשרות ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לאישור פרה-קליני באמצעות הדגמה של השתקעות HSPCs ערוכים in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמת CRISPR/Cas9 RNP לשימוש חוזר, הישמה במגוון מודלים המטופואזיים, ובכך מפחית פיתוח פרוטוקולים כפולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזויי בתיקוף מטרה, הפחתת עמימות מכניסטית, ושיבוש גנים ברמת דיוק גבוהה ללא שילוב DNA.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של עריכת גנים בתאים המטופחים רגילים ומתומרים של מערכת ההמטופוזיס.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות פיתוח תרופות המטולוגיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעודוף וקבלת החלטות על קידום פרויקטים בהתאמה לסיכון, בהתבסס על נתונים מהירים ובעלי יעילות גבוהה של נטרול מטרה (knockout).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשיטות של שיבוט מולקולרי, טיפול ב-RNA ואלקטרופורציה.
- תלוי בגישה לתרמוסייקלר, ספקטרופוטומטר, יחידה לאלקטרופורציה וציטומטריה זרימה לצורך תיקוף.
- מחייב סביבה נטולת RNase וטיפול סטנדרטי בריאגנטים כדי להבטיח את יציבות ה-RNP ואת יעילות העריכה.
- דורש התאמה של תכנון ה-guide RNA ואופטימיזציה עבור מודלים המטופואטיים שונים וגנים מטרים שונים.
- מגבלה מעשית: היעילות עשויה להשתנות בהתאם לסוג התא ולאטוס המטרה, דבר המצריך תיקוף אמפירי עבור כל גן רלוונטי.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
sgRNA Fwd Primer Design, DNA Template Synthesis, and ln Vitro Transcription of sgRNA
3:38
Cas9-sgRNA Complexing and Electroporation
5:45
Results: Use of Cas9-sgRNA Electroporation Protocol to Study Efficient Knockout of Target Gene
7:48
Conclusion
