Name: הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: למד שיטה משופרת להכנת תאי שומר פיוניים עשירים מרקמת עלה צמחית. שיטה זו מאפשרת ניתוחים פיזיולוגיים וביוכימיים מדויקים של תהליכי איתות בתאי הפיוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים דניאל חן מ דיגיטלית וידאו הפקה צוות של בוכהולץ מהתיכון. סיוע בעריכת הוידאו. מחקר זה על תאי המשמר stomatal, פרוטאומיקס, גליקומיקס במעבדה חן היא נתמכה על ידי מענקים אותנו הקרן הלאומית למדע (0818051, 1158000 ו- 1412547). קונג Wenwen נתמך על ידי המועצה מלגה סין. ד ר Qiuying פאנג נתמך על ידי סין מלגת מועצה נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (31570396).

1. גידול צמחים
<ol><li>לנבוט הגרעינים תערובת השתילה. לגדל צמחים בתוך תא הצמיחה של עוצמת האור של 140 µmol פוטונים מ'−2 s − 1 , של photoperiod של 8 שעות אור באורך 22 ° C ו- 16 h כהה ב 18 ° C 2 שבועות</li>
	<li>השתלת שתילים בגדלים דומים באופן אינדיבידואלי לתוך 4 סירים קוטר המכיל את האדמה ולגדול במשך 3 שבועות באותם התנאים נוספים שמתואר בשלב 1.1. הערה: מים צמחים עם ברז מים פעמיים בשבוע כדי לשמור על לחות הקרקע.</li>
</ol>2. הכנת הפיוניות מועשר
<ol><li>להסיר את העלים של צמחי לבנה א 5 - בן שבועיים בודדים עם אזמל.</li>
	<li>לצרף כל עלה שתי חתיכות של דבק ברורה, עם חתיכה אחת הקפדה על הצד (נמוך יותר) abaxial, החלק השני הקפדה על adaxial (עליון) בצד של העלה. עזוב את הקלטת על העלה עבור 5 s.</li>
	<li>עדין קליפת בנפרד שתי חתיכות של קלטות בעזרת האגודל והאצבע על כל יד כדי להפריד בין הצד abaxial עם המדרכה, משמר תאים, הצד adaxial עם תאים mesophyll.</li>
	<li>המקום קליפות מהצד abaxial של העלים ב 60 מ של הפיוניות פתיחת מאגר (50 מ"מ אשלגן כלורי, 10 מ מ MES-KOH, מותאם pH 6.2 עם 1 מ' KOH) בגודל 40 מ מ × 12 מ מ פטרי מנות כפי שהם שנאספו.<ol>
<li>חזור על השלבים שלעיל עד כל מדגם קליפות נאספים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקם את פטרי המכילות את קליפות אל החדר גדילה בתנאים אור הצהיר בשלב 1.1. להשאיר את קליפות תחת אור כבר שעתיים לחלוטין פתוח הפיוניות.</li>
	<li>המקום קליפות לתוך 150 מ מ x 20 מ מ פטרי המכילות 50 מ של דופן התא לעכל תערובת אנזימים (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, פוליוינילפירולידון 0.1% (w/v)-40 ו- 0.25% (w/v) שור אלבומין ב- 55% כתמיסה (0.55 מ' בסורביטול, 0.5 מ מ CaCl2, 0.5 מ מ MgCl2, חומצה אסקורבית 0.5 מ מ, 10 מיקרומטר ח'2PO4, 5 מ מ 4-morpholineethanesulfonic חומצה (MES) ב- pH 5.7 מותאם עם 1 מ' קו).</li>
	<li>לנער את קליפות על מטרף הדדיים בצלחת פטרי ב-50 סל ד כעשרים דקות.</li>
	<li>להסיר קליפות של אנזים פתרון עם פינצטה לאחר 20 דקות להעביר את קליפות 150 מ"מ x 20 מ"מ גודל פטרי המכילות 50 מ ל מים.</li>
	<li>באמצעות פיפטה העברה, לשטוף קליפות 15 s פעמיים עם 10 מ"ל של מים כדי להסיר כל פתרון אנזים שיורית.</li>
	<li>השתמש פינצטה כדי למקם את קליפות בצלחת פטרי בגודל 150 מ מ x 20 מ מ עם 50 מ של הפיוניות טריים פתיחת מאגר משמש בשלב 2.4. תקופת דגירה של h 1 בתנאי אור הצהיר בשלב 1.1 כדי לאפשר הפיוניות להתאושש.</li>
</ol>3. חומצה אבציסית (ABA) טיפול ואת וזמינותו תנועה הפיוניות
<ol><li>בצלחת פטרי בגודל 150 מ מ x 20 מ מ. דגירה של קליפות הפיוניות מועשר ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב 50 מ של המאגר הפתיחה stomatal או ב- 50 מ של המאגר הפתיחה stomatal עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר ABA הפעם הטיפול המתאים.</li>
	<li>במקום קליפות על מטרף ב-50 סל ד 5, 15, 30 דקות. לאחר כל מרווח הזמן להסיר את קליפת עם פינצטה, בצע את השלבים הדמיה בשלב 3.3.</li>
	<li>קח תמונות של הפיוניות לפני טיפול ABA, בנקודות זמן שונות לאחר טיפול ABA עם מיקרוסקופ אור.<ol>
<li>. קח את קליפת והנח אותו על משטח זכוכית מיקרוסקופ.</li>
		<li>למקם את השקופית על הבמה מיקרוסקופ ולהתאים את הבמה כך ניתן לאבחן את התמונה של קליפת.</li>
		<li>התאם את הקנס, כמובן המוקד על המיקרוסקופ כדי לקבל תמונה ברורה של תאי המשמר.</li>
		<li>לקחת כמה תמונות של הפיוניות מרובים בהגדלה X 40.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד 60 פתחים stomatal משתמש ImageJ8.</li>
	<li>לחשב את שגיאת התקן והמשמעות -ערך-p < 0.05 את המידות צמצם stomatal 60.</li>
</ol>4. חלבון החילוץ והפרדה מרחביות-דף
<ol><li>לטחון את קליפות 15 s בחנקן נוזלי מספיק כדי לכסות את קליפות באמצעות ומכתש צוננת.</li>
	<li>לכל 50 קליפות, להוסיף 3 מ"ל של טריס רווי פנול (pH 8.8) 3 גרם חלבון החילוץ חיץ (0.9 M סוכרוז, 0.1 M טריס-HCl, 0.01 M EDTA, 0.4% מרקפטואתנול, 10 µL של מעכב פרוטאז, פוספטאז 1 מ"מ) עם פיפטה כדי המליטה ואז לטחון את קליפות של אילן גרינברג 5 דקות אינפורמטיבית בשכונה fume.</li>
	<li>להעביר את תמצית באמצעות פיפטה ואת קליפות באמצעות פינצטה מתכת כדי Oakridge צנטריפוגה tube להתסיס על מטרף ב-50 סל ד עבור h 1-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר את קליפות מהצינור צנטריפוגה Oakridge, centrifuge את התמצית ב g 5,000 x למשך 10 דקות. לאחר מכן העברה בעל תאים פנוליים השלב העליון צינור נקי מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה.</li>
	<li>התמיסה פנול חילצה חלבונים על-ידי הוספת 5 כרכים של קרח אצטט אמוניום 0.1 M ב- 100% מתנול. מערבולת בקצרה דגירה בין לילה ב-20 ° C.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 20,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, decant את תגובת שיקוע על ידי לאט נשפכים זה הצינור ולשמר בגדר חלבון בצינור.</li>
	<li>לשטוף בגדר חלבון פעמיים עם 0.1 M אמוניום אצטט, מתנול, ולאחר מכן פעמיים עם אצטון 80% ופעם אחת עם אצטון 100% קר. הערה: מנקי נעשים על-ידי הוספת 10 מ"ל של ריאגנט מסוים הצינור של חלבון. להתסיס על מטרף ב-50 סל ד במשך 5 דקות, ואחריו צנטריפוגה ב g x 15,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. ואז שופכים הכימית יצאה מהשפופרת שמירה רק בגדר חלבון.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של אצטון 100% קר בגדר והשהה מחדש על ידי לאט pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>להעביר ההשעיה חלבון באמצעות פיפטה שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 2 mL ואז צנטריפוגה ב 20,000 g x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>להסיר אצטון על-ידי decanting זה מהצינור ויבש בגדר בשכונה fume למשך 10 דקות.</li>
	<li>להמיס החלבון של שפופרת מיקרו-צנטרפוגה עם µL 200 התפרקות מאגר (אוריאה 8 מ', 0.5% מרחביות, 30 מ מ טריס-HCl ב- pH 8.5) ו מערבולת במשך 30 דקות צנטריפוגה ב 20,000 g x-15 מעלות במשך 20 דקות ולאסוף תגובת שיקוע צינור חדש.</li>
	<li>לכמת את ריכוז חלבון בעקבות פרוטוקול כימות9חלבון.</li>
	<li>השתמש דגימות חלבון הפרדת חלבונים על ידי אלקטרופורזה בג'ל בעקבות פרוטוקול ה-10.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

משמר תאים הם מערכת מודל לימוד האות מנגנוני התמרה חושית בצמחים וזה חשוב לוודא כי הכנת דוגמאות השתמשו במחקר הוא המתאים ביותר כדי לענות על שאלות ביולוגיות. למרות העניין הגובר והולך משמר תאים בתוך קהילת המחקר צמח, יש אין שיטה אוניברסלית באיך להכין stomatal תאי המשמר שיאפשר תנועה stomatal והן פיזיולוגיה כמו גם השינויים המולקולריים שילמדו אחד מערכת. האתגר כדי לבודד אותם ניתן לייחס בעיקר שלהם גודל קטן, נמוך לשפע, המבנה הייחודי, אשר מקשות פחות או יותר להסיר אותם מן העלים שלמים.
פרוטוקול זה מספק שיטה כ...

הפיוניות יש תפקיד חשוב ב פיזיולוגיה והכושר הכללי של צמחים. מבנים ספציפיים אלה צמח זעיר נוצרות על ידי שני תאים באפידרמיס מיוחדים המכונה תאי המשמר, מצויים בשפע ביותר על פני השטח abaxial של עלים. הפיוניות נחוצים לצורך עסקת חילופי גזים בין הצמח, האווירה, כמו גם השליטה של אובדן מים באמצעות דיות. תאי המשמר לווסת את הפיוניות צמצם באמצעות שילוב בין חיצוניים שונים (למשל, אור, לחות, קשר הפתוגן, רמות פחמן דו-חמצני) ופנימיים (למשל., הורמונים אנדוגניים) גירויים1,2. ב-20 השנים האחרונות, סוג התא הזה הפך מערכת מודל עבור תא לומד איתות תהליכים במפעלים. תאים אלה מהווים חלק קטן של התאים הכולל עלה; לפיכך, לחקור שלהם סלולרי ייחודי, מאפייני הביוכימי והמולקולרי בצורה מתא בודד, יש צורך לבודד אותם מכל סוגי תאים אחרים עלה. בעבר, מחקרים משמר תא יש לעיתים קרובות מעורבים הכנת משמר תא protoplasts (GCP)3,4,5. זה בדרך כלל דורשת השימוש בכמויות גדולות של דופן התא משפילים אנזימים ו/או שיבושים מכניים באמצעות מיזוג, הוכיחה להיות יקר וארוך כמו בדרך כלל זה לוקח שעות רבות כדי להכין מדגם GCP, לעתים קרובות פעמים עם תשואה קטנה. וחשוב מכך, כי תאי המשמר לשמש מלאה זוגות כדי לווסת את הפיוניות הצמצם, ניתן לראות את השימוש GCP כמערכת מלאכותי ללמוד איתות התא משמר.
. הנה, פיתחנו שיטה להכין הפיוניות בו תאי המשמר שלם מועשרים, לשמור על תגובות פיזיולוגיות לגירויים. שיטה זו בהשראת שיטה שבה השתמשת כדי לבודד mesophyll תא protoplasts6,7. בשיטה שלנו, הפיוניות מוכנות תוך שימוש ברור דבק להפריד תחילה את רוב התאים mesophyll מחובר השכבה adaxial של העלה מהשכבה abaxial המכילות את המדרכה ואת משמר תאים. פעולה זו מתבצעת על ידי הדבקות נייר-דבק לשני הצדדים של העלה פילינג אותם בנפרד. התאים מהשכבה abaxial מותר לשחזר תחת אור במאגר פתיחת הפיוניות. מאוחר יותר תאים המדרכה מוסרות באמצעות כמות קטנה של דופן התא משפילים אנזימים, משאיר מאחורי תא משמר כי הם מועשרים בקלטת.
בשיטה זו פשוטה, התאים משמר stomatal כי הן קיימא מגיב יכולים במהירות, ביעילות תהיה מוכן, לוקח פחות משעה להשיג מועשר בתאי המשמר stomatal מקליפות 50 בעלות מינימלית. השיטה כאן מטיל פחות נזק לתאי הצמח מאשר שיטות קודמות איפה protoplasts מוכנים. בנוסף, החומרים נאספו מ כמויות חלבון רצויה זו שיטת התשואה. והכי חשוב, כי העלה שלא עובר מיזוג או עיכול ממושך פעמים ותאים משמר נותרו ללא פגע, תוצאות ללמודי הדוק יותר יהיו רלוונטיים לזה של הביולוגיה של התא משמר טבעי. בשיטה זו, תנועות stomatal ישויך בזמן אמת עם שינויים ברמה המולקולרית. לפיכך, הידע שנרכש ממחקרים בשיטה זו הכנה יהיה חשוב להבנה מקיפה יותר של איתות התא משמר.
השתמשנו הצמח תודרנית לבנה כמודל; אולם פרוטוקול זה ניתן ליישם את העשרת של stomatal תאי המשמר מינים אחרים כגון כרוב napus עם שינויים קטנים בזמן העיכול. מהווה הוכחה של המושג, הראו כי תאי המשמר stomatal מועשר באמצעות שיטה זו הם קיימא מגיב לגירויים כפי שמוצג על ידי fluorescein diacetate (FDA) assay לימודי ניצול של חומצה אבציסית הורמון צמחי (ABA), בהתאמה. בנוסף, הראו כי חלבונים באיכות גבוהה יכול להיות מבודד תאים אלה משמר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של תהליך זה.

<table><tbody><tr><td>נוצת אזמל כירורגית מנירוסטה</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>NC9999403 סקוטש טייפ (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>צלולאז (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Yakult תעשיית תרופות ושות', בע"מ</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult תעשיית התרופות ושות', בע"מ</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ DM6000B&nbsp;</td>קוקטיילים מעכבי פרוטאז ופוספטאז של <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>אוק רידג' צינורות צנטריפוגה PPCO במהירות גבוהה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כימות חלבון EZQ</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין דיאצטט (FDA)</td> <td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אבציסית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>מטרו מיקס 500</td><td>חברות BWI&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli מאגר דגימה</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td> פינצטה <td>של המכון הלאומי לבריאות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX ג'ל טרומי</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>פישרברנד</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

המחקר של תאי המשמר חיוני הידע של תרומות ספציפיות מסוג זה תא לתפקוד הכללי של צמחים. עם זאת, לעתים קרובות קשה לבודד, וכך לומד אותם לעתים קרובות מספק אתגר.
מחקר זה יוצר שיטת העשרה תא המשמר stomatal. הפרוטוקול מנצל דבק בידוד תאי המשמר ולחלץ חלבונים מהתאים. שיטה זו משפרת את תקינות ואת התשואה של משמר תא במהלך בידוד ומספק מדגם אמין לחקר תהליכי איתות התא, איך הם תשבחות פנוטיפים התנועה stomatal. בשיטה זו, העלים צמח למחיצות בין שני חלקים של הקלטת, קלוף לחתיכות כדי להסיר את הצד abaxial. פרוטוקול זה הוחל על רקמת העלה תודרנית בידוד תאי המשמר. התאים טופלו עם fluorescein diacetate (FDA) כדי לקבוע את יכולת הקיום ועם חומצה אבציסית (ABA) כדי להעריך את הפיוניות התנועה בתגובה ABA. לסיכום, פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור הכנת תאי המשמר stomatal מועשר ובידוד חלבונים. איכות תאים וחלבונים מתקבל כאן אפשר פיזיולוגיים, מחקרים ביולוגיים אחרים.

תמונת הנציגה של תודרנית לשמור תאים לפני ואחרי עיכול של mesophyll, תאים אפידרמיס מוצג באיור1. תא משמר הכדאיות לפני ואחרי הסרת mesophyll, תאים אפידרמיס ניתן לצפות באמצעות ה-FDA כדי למדוד פעילות אנזימטי ותקינות קרום התא (איור 1B וד' 1). איור 2 מדגים stomatal תנועת תודרנית בתגובה טיפול ABA. צמצם stomatal פוחתת יותר מ-50 אחוזים לאחר 30 דקות של טיפול ABA. איור 2A</stro...

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכנת מועשר בתאי המשמר stomatal שימושי עבור מחקרים ביולוגיים פיזיולוגיים ואחרים.

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להכין תאי שמירה מועשרים באיכות גבוהה לניתוחים פיזיולוגיים, ביוכימיים ומולקולריים, כגון טרנסקריפטומיקה, פרוטאומיקה ומטבולומיקה. שלום, שמי שלדון לורנס. אני סטודנטית לתואר שני במעבדה של ד"ר צ'ן במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת פלורידה.היום, אני הולך להראות לכם כיצד לבודד תאי שמירה מרקמת עלי הצמח שהם חומר שימושי לחקר הפיזיולוגיה והביולוגיה של הפיוניות. שיטה זו נחשבת לשיטה חדשה לבידוד תאי שמירה. זה מאפשר במיוחד העשרה של תאי שמירה שלמים ומספק דגימות אמינות לחקר תהליכי איתות של תאי פיוניות.היישום של שיטה זו יכול להתרחב לצמחי Brassicaceae ומיני צמחים אחרים עם שינוי קטן בלבד בפרוטוקול. ההדגמה חשובה מכיוון שהצעד העיקרי להעשרת תאי השמירה יכול להתגלות כמאתגר. כדי להתחיל, בחר צמחי Arabidopsis בוגרים בני חמישה שבועות.הסר בזהירות עלה בעזרת אזמל, חותך את העלה בבסיסו. קח שתי חתיכות סקוטש והניח את העלה הכרות ביניהן. הפעל בעדינות לחץ על שני הצדדים תוך הקפדה על כך שקצה חלקי הסרט לא יידבק.ניתן לעשות זאת על ידי הכנסת אצבע ביניהם. הסר בעדינות את שתי חתיכות הסרט הרחק זו מזו, וצף מיד את הקליפה שנלקחה מהצד האבקסיאלי של העלה לתוך מאגר פתח הפיוניות. לאחר איסוף כל הקליפות, הניחו אותן תחת אור.השאירו אותם שם למשך שעתיים. קח כמה קליפות והניח אותן על שקופיות מיקרוסקופ. בעזרת מיקרוסקופ אור, כוונן את העדשות כדי view תאי השמירה וודא שהם פתוחים.מניחים את הקליפות לתוך 50 מ"ל מתמיסת אנזים העיכול של דופן התא. צפים ודוגרים אותם בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות, יש להסיר את הקליפות מתמיסת האנזים ולשטוף פעמיים לזמן קצר במים נטולי יונים, ולהניח במאגר פתח הפיוניות הטרי.טוחנים את הקליפות במכתש עם חנקן נוזלי, בעזרת עלי. לאחר מכן בצע מיצוי פנול כמתואר בטקסט. לאחר טחינת הקליפות במכתש עם עלי, מעבירים את התמצית, יחד עם הקליפות לצינור צנטריפוגה של אוק רידג', ומערבבים על שייקר במשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.זרז את החלבונים המופקים מהפנול על ידי הוספת חמישה נפחים של 0.1 מול אמוניום אצטט קר כקרח ב-100% מתנול. לאחר זירוז החלבון למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס, קצרו את החלבון על ידי צנטריפוגה ובצעו שטיפות כדורים כמתואר בטקסט. השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של אצטון קר, והעבירו לצינור מיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר.לאחר הצנטריפוגה, השליכו את חומר האצטון וייבשו את הכדור למשך עשר דקות. ממיסים את דגימת החלבון במאגר פירוק. לאחר מערבולת וצנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט ומדדו את ריכוז החלבון.הפעל ג'ל SDS-PAGE. דמיין את רצועות החלבון הנפרדות והתבונן באיכות החלבון היחסית. זוהי תמונה מייצגת של תאי שומר Arabidopsis לפני ואחרי עיכול האנזים של תאי המזופיל והאפידרמיס.ניתן לצפות בכדאיות תאי השמירה לפני ואחרי הסרת תאי מזופיל ואפידרמיס באמצעות פלואורסצאין דיאצטט, המודד פעילות אנזימטית ושלמות קרום התא. כפי שאתה יכול לראות, תאי שמירה עדיין ברי קיימא לאחר קילוף ועיכול אנזימים. דוגמה זו ממחישה תנועת פיוניות של Arabidopsis בתגובה לטיפול ב-ABA.תאי השמירה מגיבים לטיפול וצמצם הפיוניות יורד ביותר מ-50% לאחר 30 דקות של טיפול ב-ABA. הנה מהלך זמן של תנועת הפיוניות. בנוסף, מוצגת תמונה מייצגת של פתח הפיוניות בכל נקודת זמן.זיהוי חלבונים, הפרדה ושפע יחסי נצפה על ידי SDS-PAGE. הרצועות ברורות ומובחנות. ארבעה שכפולים ביולוגיים כלולים כדי להדגיש את יכולת השחזור של מיצוי חלבון משיטה זו.הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשניסינו לתאם שינויים מולקולריים בתאי שמירה בזמן אמת עם תנועת הפיוניות. לאחר השליטה, ניתן להכין דגימת חלבון מתאי שומר פיוניות תוך מספר שעות וניתן להשתמש בה בניסויים מרובים. חשוב לזכור לא לגרום נזק רב לתאי השמירה בזמן הקילוף והטיפול.בעקבות שיטה זו, ניתן ליישם טכניקות אחרות לחקירת איתות תאי שמירה, כגון תיוג איזוברי לחקר תגובת חידוש של חלבונים בצמחים בתנאים רגילים ולחץ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהעשיר תאי שמירה שלמים ובני קיימא, כמו גם לחלץ חלבון באיכות גבוהה המתאים למחקרים במורד הזרם.

stomata-tape-peel-an-improved-method-for-guard-cell-sample-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

מאמר זה מתאר את השיטות לסינון גני השליטה חדירה plasmodesmal ומכאן שיפוע אוקסין במהלך התגובה טרופית. זה כולל מדידת מידת התגובה הטרופית ב hypocotyl   של ארבידופסיס thaliana ובדיקת חדירות plasmodesmal ידי טעינת חומצה 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic (HPTS) ולבסוף הערכת רמת callose.

אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג

השעון הביולוגי מווסת כשליש של transcriptome ארבידופסיס, אך אחוז הגנים המזינים בחזרה מדידת זמן נותר עלום. כאן אנו להמחיש שיטה להעריך פנוטיפים יממה במהירות בכל קו מוטציה של ארבידופסיס באמצעות הדמיה זורחת של עיתונאי יממה הביע זמני ב פרוטופלאסט.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד לגרום הפיוניות באשכולות בפסיגי הזרע של שתילים תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכר וכיצד להתבונן מבנים תאיים כגון מהכלורופלסט microtubules בתאי המשמר באשכולות באמצעות קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ.

מערכת אינדוקציה מקובצים באשכולות הפיוניות על ידי סוכר פתרון טבילה טיפול בשתילי תודרנית לבנה

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מציג שיטה השוואתית להערכת תכונות סטומטליות ואפידרמליות בשני מינים מובחנים, באמצעות פילינג אפידרמלי, טכניקות ניקוי וניתוח תמונות בעזרת בינה מלאכותית. המטרה היא לאפשר כימות בתפוקה גבוהה וניתנת לשחזור של מבנים תאיים הבסיס לתפקוד הפיוניתי ליישומים חקלאיים ולמחקר צמחי רחב.

אפיון תכונות פטיחות ואפידרמליות באמצעות פילינג, ניקוי וניתוח תמונות מבוסס בינה מלאכותית

למד שיטה משופרת להכנת תאי שומר פיוניים עשירים מרקמת עלה צמחית. שיטה זו מאפשרת ניתוחים פיזיולוגיים וביוכימיים מדויקים של תהליכי איתות בתאי הפיוניות.

הפיוניות הקלטת-פיל: שיטה משופרת עבור הכנת הדוגמא משמר תא

גלה סרטונים נוספים