Name: CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: למדו שיטת CLOuD9 לשליטה ברקמת הכרומטין באמצעות CRISPR-dCas9. טכנולוגיה זו מאפשרת שינוי הפיכה של לולאות כרומטין ומודולציה של ביטוי גנים בצורה סלקטיבית במגוון תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ה צ'אנג, טי אורו, ס' Tavazoie, R. פלין, עמ' בטיסטה, קאלו אי ו המעבדה וואנג כולו עבור תמיכה טכנית וקריאה ביקורתית של כתב היד. S.L.M. נתמכו בעבודה זו דרך של NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028), המכון הלאומי לסרטן (1F99CA222541-01). K.C.W. נתמכת על ידי פרס הקריירה עבור מדענים רפואיים מהקרן Wellcome בורוז, הוא אי דונלד, דיליה ב בקסטר קרן סגל חוקר.

<ol><li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+looping+as+a+target+for+altering+erythroid+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).</li>
<li>Matharu, N., Ahituv, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minor+loops+in+major+folds%3A+Enhancer-promoter+looping%2C+chromatin+restructuring%2C+and+their+association+with+transcriptional+regulation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease.</a> PLoS Genet. 11, e1005640(2015).</li>
<li>Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes%3A+interpreting+chromatin+interaction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).</li>
<li>Kim, A., Dean, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22610406">Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription.</a> Mol Cells. 34, 1-5 (2012).</li>
<li>Petrascheck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+looping+induced+by+a+transcriptional+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).</li>
<li>Ameres, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+DNA-loop+formation+blocks+transcriptional+activation+by+an+SV40+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer.</a> EMBO J. 24, 358-367 (2005).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Long-Range+Genomic+Interactions+at+a+Native+Locus+by+Targeted+Tethering+of+a+Looping+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor.</a> Cell. 149, 1233-1244 (2012).</li>
<li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+developmentally+silenced+globin+genes+by+forced+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping.</a> Cell. 158, 849-860 (2014).</li>
<li>Morgan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+Nuclear+Architecture+through+CRISPR-Mediated+Chromosomal+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping.</a> Nature Communications. 8, 13 July (2017).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17 (1), 148(2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Lipofectamine+2000+Reagent%22">Lipofectamine 2000 Reagent</a>. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNeasy+Blood+%26+Tissue+Kit+Handbook%22">DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook</a>. , QIAGEN. (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Determining+Genome+Targeting+Efficiency+using+T7+Endonuclase+I+%28M0302%29%22">Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302)</a>. , New England BioLabs. (2016).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. , 83-87 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNeasy+Mini+Handbook%22">RNeasy Mini Handbook</a>. , QIAGEN. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+VILO+cDNA+Synthesis+Product+Information+Sheet%22">SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet</a>. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).</li>
<li>Theunissen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+culture+conditions+for+induction+and+maintenance+of+naive+human+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).</li>
<li>Mokry, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genome-wide+analysis+of+transcription+factor+occupancy%2C+RNA+polymerase+II+binding+and+steady+state+RNA+levels+identify+differentially+regulated+functional+gene+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes.</a> Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).</li>
<li>Drier, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oncogenic+MYB+feedback+loop+drives+alternate+cell+fates+in+adenoid+cystic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma.</a> Nat Genet. 48, 265-272 (2016).</li>
<li>Ryan, R. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enhancer-associated+rearrangements+reveals+mechanisms+of+oncogene+dysregulation+in+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma.</a> Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).</li>
<li>Montavon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+archipelago+controls+Hox+genes+transcription+in+digits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits.</a> Cell. 147, 1132-1145 (2011).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

The most נמצאים בשלבים קריטיים CLOuD9 כרומטין לולאה: 1) בעיצוב או באמצעות gRNAs את הנכון, מדיה 2) המשתנים מדי יום על תאים CLOuD9-transduced, לרבות ABA או דימתיל סולפוקסיד, 3) שמירה על הטריות של ABA, וביצוע 4) הערכות מדויקות וזהיר של קונפורמציה כרומטין.
הגבולות של CLOuD9 מתגוררים בעיקר ביכולת לעצב מדריכי לאזור היעד של בחירה. מדריך RNAs לבצע משימה חשובה של הרכיבים dCas9 לאזורי היעד דנ א כדי להיות dimerized ביצעה התאמה לשפות אחרות, היעילות של המדריכים מבוססים על אתר היעד הספציפי שלהם. ללא הרכיבים gRNA הנכון, CLOuD9 המערכת לא תהיה אפשרות ליצור הפיכה המושרה לולאות. לפיכך, על-ידי עיצוב מדריכים מרובים עבור כל אזור בעל עניין שמתפשטת המדריכים באזור של 250-1000 bp, מדריך מוצלח אחד לפחות יובטח. מדריך מיקום הוא גם חלק בלתי נפרד תוצאות מדויקות. חשוב להימנע מכווני הנמצאים ב אתרי הקישור של פקטור שעתוק או אזורים קריטיים אחרים כדי למנוע תופעות רקע כגון למעלה או למטה רגולציה של שעתוק. בנוסף, מיקומו המדוייק של הבונה CLOuD9 עלולה מעט על שעתוק של הגן היעד. זה מדגיש את החשיבות של בדיקות מרובות זוגות של מדריכים לכל אזור היעד, כדי לזהות את זוג החזקה ביותר למטרות ניסוי. עוד, בכל צמד אזורי היעד, הבונה CSA צריך להיות ממוקד עם gRNAs עבור S. aureus, הבונה CSP צריך להיות יעד עם gRNAs הפישחה ינפל תומימת ס הכוונת ירידה לפרטים.
כדי להבטיח תוצאות מדויקות dimerization הנכון, חשוב גם לשמור על הרעננות של סביבות הסלולר בעקבות את התמרה חושית של המבנה CLOuD9. מדיה יומי לשנות ומבטיחה התוספת של dimerizer טרי (או שליטה) כי המבנה משלימים נשארים בסמיכות ולשמר קונפורמציה כרומטין שינו. יתר על כן, המבטיח אבא טרי ולא אוחסן כיאות על-פי הפרוטוקול של היצרן (נפתח בתוך 6 חודשים, כל הזמן קר, מוגנים מפני אור) חיוני להשגת תוצאות אותנטי.
ראוי לציין, dimerizer ABA עבור CLOuD9 שימש עם החלבונים dimerization אסתי, PYL, ולא יותר נפוץ מנוצל FRB ומערכת FKBP. הצורך של rapalog המערכת FRB/FKBP מוגבלת תחולת CLOuD9, בשל רעילות תאים סרטניים. מערכת ABI/PYL חלופי עקפו מגבלה זו, באופן יעיל המאפשר CLOuD9 להיות רחב יותר utilizable.
באופן קולקטיבי, פיתחנו CLOuD9, טכנולוגיה ייחודית וחזק יכול בכפייה אך הפיכה ליצור אנשי קשר בין לוקוסים גנומית היעד לטווח ארוך. דרך גרימת כרומטין לולאות, אנחנו גם להוכיח כי CLOuD9 יכול להיות מנוצל כדי לשנות ביטוי גנים בהקשר הסלולר המתאימה. יכולת ההתאמה של הטכנולוגיה מאפשרת לימוד בלתי מוגבלת של האינטראקציות בין כל שני לוקוסים גנומית, מבלי לדרוש ידע מוקדם של לולאה אזורים או לולאה מנגנונים. בנוסף, הפיכות והפגינו ייחודי של CLOuD9 מאפשר בהמשך בחינת המנגנונים לולאה מחלות ופיתוח. בעוד ההשפעות על המטרה של כרומטין לולאה הוכחו בבירור, יש עדיין להיות נתונים מציע תובנה ההשפעות של לולאה חופש-יעד וההשפעה עוקבות על הלולאות ביעד.
הנתונים שלנו ממחישה רק כמה יישומים של כלי זה, אך מרמז את הרעיון שבבסיס הגדולות כרומטין הסדר היא מעידה על ביטוי גנים. הטכנולוגיה שלנו יכול לשמש כדי לחקור ולחשוף את הדקויות של הכרומטין בהכונה, ובכך לשפר את ההבנה הכוללת של התפקיד של כרומטין מתקפל לתוך שעתוק של גנים. הבנה טובה יותר של הדקויות של דינמיקה תעתיק יכול להוביל את הדרך מחקר וטיפול של סרטן, מחלות תורשתיות, והפרעות מולדות, בכרומטין ברורים אשר הרכבה הפיצולים ללא ספק ביטוי גנים20, 21,22,23. העבודה הבאים ניצול הטכנולוגיה CLOuD9 דולקת עוד פרטים על הסדר ועל הדינמיקה של כרומטין תחומים, איך שמעבידים קיפול כדי לקיים את ביטוי גנים יציב פיתוח והן המחלה.

היחסים בין כרומטין מתקפל לתוך הגרעין וארגון ספציפי של הגנום צברה ריבית משמעותית בשנים האחרונות, כמו זה הוכח יש קשר הדוק עם ג'ין-ביטוי-1,-2. בעוד הקשר המדויק בין פעילות הגן אפנון של הכרומטין נשאר לא ברור, זה יש כבר המשוערות האינטראקציות בין אנשי קשר כרומוזומלית כתוצאה ארגון דינמי כרומטין תלת מימדי לשרת ג'ין פונקציית רגולציה3. אכן, אפקט כזה הוכח טוב-מיקומה ג'ין גלובין האנושי, שבו אזור הבקרה לוקוס (LCR) מסדיר את הפעילות של גנים גלובין באופן התפתחותי מסוים על-ידי יצירת לולאה כרומטין בין שני אזורים4. עם זאת, זה והן באזורים אחרים, לא ברור אם כרומטין לולאה הוא גורם או תוצאה של שינויים בביטוי הגנים.
עד עכשיו, האתגרים בלימוד תופעה זו נותרה בעינה. למשל, ניסיונות אחרים גרימת כרומטין לולאות מעורב שינוי את רצף ה-DNA ליניארי או את הליכים מורכבים הדורשים שפע של ידע רקע על רכיבים ספציפיים המאפשרים לולאה5,6, 7,8. בנוסף, בזמן עבודה קודמות הציע שאת כרומטין לולאות נסיעה ביטוי גנים ב והקשר מסוימים המוגבלת7,8, רמת-כרומטין אילו לולאה משפיע על שעתוק באופן גלובלי אינו ברור. למרות התעניינות ההשפעה של לולאה ארוכי טווח על ביטוי גנים גדל בהתמדה בשנים האחרונות, שאלות שלא נענו על ביסוס ושימור אנשי קשר כרומטין לשנות פעילות הגן נמשכות.
הטכנולוגיה שתכננו מעסיקה נוקלאז לקוי באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) - CRISPR - הקשורים החלבון 9 (dCas9), כדי לאפשר התמקדות בהרחבה ישים כל לוקוסים גנומית9. טכנולוגיה זו מבטלת את סוגיות מורכבות הקשורות שינויים של רצף ה-DNA ליניארי, והוא נגיש בלי ידע מוקדם משמעותית של מרכיבים לולאה מסוים. בעיקר, הכלי הוא אוניברסלי וישימים בקנה מידה נרחב לולאות כרומטין מזוהה בפיתוח באותה מידה כמו מגוון רחב של מחלות, כמו סרטן. הכוח של CLOuD9 מומחש הפיכה משינוי מבנה לולאות לווסת ביעילות ביטוי גנים.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp; מדיה</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>עבור תרבית תאים K562</td></tr><tr><td>DMEM מדיה</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1X, עבור תרבית תאים 293T</td></tr><tr><td>lentiCRISPR v2</td><td>Addgene plasmid</td><td>#52961</td><td>לפיתוח פלסמיד CLOuD9</td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene פלסמיד</td><td>#12253</td><td>לייצור lentivirus</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12259</td><td>לייצור lentivirus</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene plasmid</td><td>#12251</td><td>לייצור lentivirus</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668-019</td><td>לייצור lentivirus</td></tr><tr><td>נוגדנים נגד HA</td><td>איתות תאים</td><td>3724</td><td>עבור אימונו-משקעים</td></tr><tr><td>נוגדן נגד דגל</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td>עבור ערכת</td></tr><tr><td>דם ורקמות DNeasy DNeasy</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>למיצוי DNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td>למיצוי RNA</td></tr><tr><td>ערכת RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>למיצוי RNA</td></tr><tr><td>Superscript VILO</td><td>Life Technologies</td><td>11754-050</td><td>עבור cDNA&nbsp;</td></tr><tr><td>SYBR ירוק I MasterMix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>לניתוח qPCR</td></tr><tr><td>אור Cycler 480II</td><td>Roche</td><td></td><td>לניתוח qPCR</td></tr><tr><td>נוגדן נגד H3K4me3</td><td>AbCam</td><td>ab8580</td><td>עבור ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>אנטי-RNA Pol-II נוגדן</td><td>מוטיב פעיל</td><td>61083</td><td>עבור ChIP-qPCR</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>רוש</td><td>11873580001</td><td>לחלבון מיצוי</td></tr><tr><td>4-12% Tris Glycine ג'ל</td><td>Biorad</td><td></td><td>בכל גודל, עבור כתם מערבי</td></tr><tr><td>נגד ארנב נוגדן HRP</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-2030</td><td>עבור כתם מערבי</td></tr><tr><td>אנטי עכבר נוגדן HRP</td><td>איתות תאים</td><td>7076S</td><td>עבור כתם מערבי</td></tr><tr><td>K562 ו- H3K293 נתוני ChIP-Seq</td><td>קידוד</td><td>ENCSR000AKU</td><td>לניתוח ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 ו- H3K293 נתוני ChIP-Seq</td><td>קידוד</td><td>ENCSR000APE</td><td>לניתוח ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 ו-H3K293 נתוני ChIP-Seq</td><td>קידוד</td><td>ENCSR000FCJ</td><td>לניתוח ChIP-seq</td></tr><tr><td>K562 ו-H3K293 נתוני ChIP-Seq</td><td>GEO</td><td>GSM1479215</td><td>לניתוח ChIP-seq</td></tr><tr><td>חלבון Dynabeads A עבור משקעים חיסוניים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>עבור משקעים חיסוניים</td></tr><tr><td>חלבון Dynabeads G עבור Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10004D</td><td>עבור משקעים חיסוניים</td></tr><tr><td>RNA נקי & רכז-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td>לטיהור RNA</td></tr><tr><td>פירס 16% פורמלדהיד ללא מתנול</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>28908</td><td>לקישור</td></tr><tr><td>צולב PX458 פלסמיד</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>פלסמיד פעיל מוצע לשיבוט gRNA, אך כל פלסמיד Cas9 פעיל יעשה</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>לטיהור</td></tr> <tr>PCR<td>FastDigest BsmBI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0454</td><td>למדריך שיבוט RNAs</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EF0651</td><td>למדריך שיבוט RNAs</td></tr><tr><td>10X FastDigest Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B64</td><td>למדריך שיבוט RNAs</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>למדריך שיבוט RNAs</td></tr><tr><td>10X T4 מאגר קשירה</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>לשיבוט מדריך RNAs</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>לשיבוט מדריך RNAs</td></tr><tr><td>2X מהיר Ligase Buffer</td><td>NEB</td><td>B2200S</td><td>למדריך שיבוט RNA</td></tr><tr><td>מהיר Ligase</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td>למדריך שיבוט RNAs</td></tr> <tr><td><חזק>מאגרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> <td>ליזה פרנהאם1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% תמיסת מים מעכב פרוטאז (non-EDTA), ו-1 מ"מ EDTA במים</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> RIPA שונה <td>1% NP40/Igepal, 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 0.1% SDS, 1 מ"מ EDTA ו-1% תמיסת מים מעכב פרוטאז (non-EDTA) ב-PBS pH 7.8 או 7.4</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> דילול IP <td>0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 מ"מ EDTA, 16.7 מ"מ Tris-HCl pH 8.0, 167 מ"מ NaCl, 0.1x מעכב פרוטאז</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> שטיפה <td>100 מ"מ Tris pH 9, 100 מ"מ LiCl, 1% NP-40 ו-1% נתרן דאוקסיכולט</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> נפיחות <td>0.1 מ"מ Tris pH 7.5, 10 מ"מ אשלגן אצטט, 15 מ"מ מגנזיום אצטט, 1% NP-40</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> דילול <td>0.01% SDS, 1.1% טריטון X-100, 1.2 מ"מ EDTA, 16.7 מ"מ Tris pH 8 ו-167 מ"מ NaCl</td></tr><tr><td>מאגר פליטה IP</td><td></td><td></td><td>1% SDS, 10% NaHCO3 &nbsp;</td></tr></tbody></table>

crispr בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו בבירור כי כרומטין ארוכי טווח, תלת מימדי לולאה אינטראקציות לשחק תפקיד חשוב בוויסות של ביטוי גנים, אבל אם לולאה הוא אחראי או תוצאה של שינויים בביטוי הגנים הוא עדיין לא ידוע. עד לאחרונה, איך כרומטין לולאה משפיע על ויסות פעילות הגן ואת תפקוד התאים גישתה יחסית, מגבלות שיטות קיימות לתמרן מבנים אלה מנעו חקר מעמיק של אינטראקציות אלה. כדי לפתור את חוסר הוודאות הזה, אנחנו מהונדסים שיטה לארגון מחדש של לולאה כרומטין סלקטיבית ולא הפיכים באמצעות CRISPR-dCas9 (CLOuD9). הדינמיות של מערכת CLOuD9 הוכח על ידי לוקליזציה מוצלחת של בונה CLOuD9 למטרה לוקוסים גנומית לווסת קונפורמציה כרומטין מקומיים. חשוב מכך, היכולת להפוך את הקשר המושרה ולשחזר את קונפורמציה כרומטין אנדוגני גם אומת. אפנון של ביטוי גנים בשיטה זו מבססת את היכולת לווסת את ביטוי גנים הסלולר ואת מדגישה את פוטנציאל גדול עבור יישומים של טכנולוגיה זו ביצירת יציב דה נובו לולאות כרומטין המשפיעים במידה ניכרת על ג'ין ביטוי בהקשרים סרטן ופיתוח.

כרומטין לולאה משחק תפקיד משמעותי הכונה; עם זאת, היו לא הפיתוחים הטכנולוגיים המאפשרים שינוי סלקטיבית ולא הפיכים של לולאות כרומטין. כאן נתאר מערכת חזקה לארגון מחדש של לולאה כרומטין באמצעות CRISPR-dCas9 (CLOuD9), הדגימו באופן סלקטיבי ובלתי הפיכה לווסת ביטוי גנים-ממוקד לוקוסים.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח הקשורות ביטוי גנים מראה לנו בדיוק איך מבנה כרומטין משפיע על ביטוי גנים וכיצד ארגון כרומטין מווסת את הדינמיקה שעתוק. פיתחנו את הטכנולוגיה הזו כי רצינו להיות מסוגלים לשנות את הארכיטקטורה הכרומוזומלית כדי לאפשר יצירה של לולאת כרומטין ארוכת טווח. אמנם באותו זמן יש את היכולת להפוך את ההקשר כרומטין כדי לשחזר את המבנה כרומוזומלי אנדוגני.שיטה זו תוכננה לנוחות השימוש וליישום רחב. ניצלנו דימרייזר לא רעיל, כמו גם מינים אורתוגונליים של dcas9 על מנת לאפשר למערכת לשמש באופן רחב יותר. פיתחנו שיטה זו מכיוון שרצינו להיות מסוגלים לענות על השאלה ארוכת השנים של תרנגולת וביצה האם ביטוי גנים מביא לארכיטקטורה כרומוזומלית או האם מבנה הכרומוזום מוביל לשינויים בביטוי הגנים.עיצוב רצפי ה- RNA של מדריך CRISPR ותחזוקת תרבות התא מתוארים בפרוטוקול הטקסט. מפות פלסמיד והתווכים מנוצלים רשומים שם. התחל את ההכנה פלסמיד על ידי ערבוב חמישה מיקרוגרם של פלסמיד CRISPR lentiviral עם שלושה microliters של BsmB1 שלושה microliters של phosphatase אלקליין שישה microliters של חיץ עיכול 10x ו 0.6 microliters של טרי מוכן 100 מילימול של DTT.מביאים את הנפח הכולל ל-60 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים ומדירים את התערובת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לעכל ולרסן את הפלסמיד. לאחר מכן, ג'ל לטהר את פלסמיד מתעכל בלולאה פלסמיד ומים מזוקקים כפול. לאחר מכן, הכינו תגובות חישול לזוגות ה-RNA המדריכיים.שלב מיקרוליטר אחד של כל מדריך RNA ב 100 micromolar עם microliter אחד של חיץ קשירה 10x T4 6.5 microliters של מים מזוקקים כפולים ו 0.5 microliters של T4 PNK עבור נפח התגובה הכולל של 10 microliters. כדי anneal את המדריך RNA זוגות לרצפי היעד שלהם דגירה את תערובות ב 37 מעלות צלזיוס ב 30 דקות ואחריו דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ואז בהדרגה להפחית את הטמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס על ידי הפחתתו על ידי חמש מעלות צלזיוס לדקה. לאחר מכן, לדלל את RNAs מדריך annealed ב 1 עד מאתיים במים מזוקקים כפולים.עכשיו, הכינו את שתי התגובות לרצועות. מערבבים מיקרוליטר אחד של הפלסמיד המתעכל עם 0.5 מיקרוליטרים של מדריך פריוונלי מדולל RNAse 2.5 מיקרוליטרים של מאגר רצועות 2x מיקרוליטר אחד של מים מזוקקים כפולים ו-0.5 מיקרוליטרים של רצועות. הדגירה את התגובות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כדי ligate המדריכים BsmB1 מתעכל פלסמיד.לאחר מכן להפוך את פלסמיד קשירה חדש לתוך יציב שלושה חיידקים להגביר את החיידקים באמצעות כל שיטת הכנה פלסמיד. על צלחת שש בארות, לגם, זרע 750, 000 2n3 Tcells ב DMEM עם 10% FBS ו 1% עט סטרפטוקוקוס. השתמש באר אחת עבור כל מבנה דגירה התאים במשך 24 שעות.למחרת, לשנות את המדיום לאנטיביוטיקה טרי חינם DMEM עם 10%FBS. מיד לאחר שינוי המדיום עבור כל באר של תאים מצופים להכין צינור של תערובת ייצור Lentivirus. לכל תגובה, לדלל 11 microliters של ריאגנט transfection בסיס השומנים עם 150 microliters של מדיום Opti-MEM עבור כל תגובה.ואז בצינורות נפרדים להכין את ה-DNA. שלב שני מיקרוגרם של פלסמיד לוקטור lentiviral CLOud9 עם שני מיקרוגרם של רכיבי האריזה האחרים lentiviral. מדללים את התערובת ב-150 מיקרוליטרים של מדיום Opti-MEM.לאחר מכן לשלב כמויות שוות של תערובת פלסמיד lentiviral מדולל בריג'נט transfection מבוססי השומנים מדולל להדגיר את תערובות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לכל באר של תאים להוסיף צינור אחד של תערובות מוכן ולהמשיך את הדגירה. 48 שעות לאחר מכן, להעביר את התקשורת הפקה ויראלי מ בארות הצלחת לתוך חרוט ולסובב אותם למטה ב 300 גרם במשך חמש דקות.ואז להעביר את supernatant לצינורות טריים כדי להשליך את הפסולת גלולה. עכשיו, מיד להשתמש במדיה הייצור הנגיפי כדי להתמר את תאי היעד או להקפיא אותו ב 80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. התחל עם הוספת 250 microliters של כל מבנה ויראלי של עניין, אשר במקרה זה, מורכב פלסמידים CLOud9 משלימים צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 80, 000 תאים.לאחר מכן להוסיף מספיק פוליברין כך שהוא בין אחד לשמונה מיקרוגרם למיליליטר בתסרון. לאחר מכן התאימו את הנפח הכולל בכל צינור למיליליטר אחד באמצעות מדיה נטולת אנטיביוטיקה. עכשיו כדי להגביר את המגע בין חלקיקי הנגיף והתאים לסובב את התאים ב 800 גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.ואז להשעות מחדש את התאים ב supernatant על ידי צינורות. לאחר מכן, לטעון את ההשעיה של התאים על צלחות תרבות דגירה אותם במשך 24 שעות. למחרת, לאסוף את התאים.צנטריפוגה אותם ב 300 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר מחדש להשעות אותם במדיום רגיל. למחרת, מוסיפים puromycin ו hygromycin למדיום כדי לבחור עבור תאים מתומרים כפליים. הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה צריך להיקבע מראש עבור כל סוג תא.לאחר מכן, הדגירה את התאים במדיה הבחירה לפחות שלושה ימים לפני שתמשיך עם יישומים במורד הזרם ולהמשיך לשמור על התאים ומדיית הבחירה. כדי לעמעם את התאים הנבחרים והתומרים של CLOud9, הוסף ABA מילימולרי אחד לצלחת התרבות. עבור פקדים, הוסף DMSO ולאחר מכן שמור את התאים עם ABA או DMSO למשך הניסוי.כדי להפוך את העמעום, לשטוף את התאים עם מספיק PBS כדי לכסות את פני השטח של הצלחת פעמיים. לאחר מכן, תאי תרבות במדיה נטולת ABA כדי לשמור עליהם במצב לא מומר. שימוש הולם במערכת CLOud9 גורם למגע הפיך של מבני CSA ו- CSP CLOud9 משלימים באמצעות הוספה או הסרה של ABA למדיית תרבות תאים.מבני CSA ו- CSP מותאמים לאזורים גנומיים מתאימים באמצעות מדריך CRISPR סטנדרטי RNAse. אימונופרציפציה כרומטין ואחריו PCR כמותי נוצל כדי להבטיח לוקליזציה מדויקת בפילוח של כל רכיב CLOud9. בנוסף coimmunoprecipation עם ובלי ABA מאומת CSA ו CSP עמעום בנוכחות הליגנד, כמו גם את הפיך בהעדר הליגנד.לאחר עמעום ABA, מגע גדול יותר בין בטא גלובין לבין LCR נמדד על ידי לכידת אישור כרומוזום. עם זאת, זה לא נצפה בפקדים המכילים רק את CSA או רק את מבנה CSP. יצירת אינטראקציית בטא גלובין LCR לא לחלוטין לחסל את מגע גלובין LCR אנדוגני.זה רק הוסיף איש הקשר המקורי. העלייה במגעי בטא-גלובין LCR נצפתה באמצעות 72 שעות של עמעום ללא קשר לאזור המדויק בתוך LCR ממוקד או אזור מקדם בטא גלובין. לבסוף, ההפיכה של המערכת אושרה עם לכידת אישור כרומוזום לאחר הסרת ABA.זה הביא לחידוש מלא של האישור אנדוגני. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשנות מדיה ולהוסיף תאים מתומרים CLOud9 מעומעמים טריים מדי יום. אל תשכח לעבוד עם lentivirus יכול להיות מסוכן מאוד וכל אמצעי הזהירות המשמשים ב BSL 2 תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליך זה.

crispr-mediated-reorganization-of-chromatin-loop-structure

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

הגנום מאורגן במרחב הגרעיני למבנים שונים שניתן לגלות באמצעות טכנולוגיות לכידת קונפורמציה כרומוזומית. שיטת Hi-C בגרעין מספקת אוסף רחב של אינטראקציות כרומטין בקווי תאים של Drosophila, אשר מייצר מפות מגע שניתן לחקור ברזולוציית מגה-בסיס ברמת שבר ההגבלה.

In-Nucleus Hi-C בתאי דרוסופילה

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

הפרוטוקול מתאר שיטות לעריכת אפיגנום מבוססת Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) בקווי תאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של DNA פלסמיד ונוקלאופקציה של mRNA.

עריכת אפיגנום CRISPR בתאים אנושיים באמצעות טרנספקציה של DNA פלסמיד והעברת נוקלאופקציה של mRNA

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

אינטראקציות DNA חלבון חיוניים עבור תהליכים ביולוגיים מרובים. במהלך הערכה של פונקציות הסלולר, ניתוח של אינטראקציות DNA חלבונים הוא הכרחי להבנת הרגולציה הגנטית. Chromatin immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות כאלה in vivo.

ניתוח של C-KIT ליגנד האמרגן באמצעות Immunoprecipitation הכרומטין

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

למדו שיטת CLOuD9 לשליטה ברקמת הכרומטין באמצעות CRISPR-dCas9. טכנולוגיה זו מאפשרת שינוי הפיכה של לולאות כרומטין ומודולציה של ביטוי גנים בצורה סלקטיבית במגוון תאים.

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

גלה סרטונים נוספים