מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפרוטוקול המיון בתחום תאי הגזע על ידי מתן הליך לטיהור תאי גזע מזנכימליים ישירות מהנוזל הסינוביאלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהקמנו פרוטוקול פשוט וחסכוני לבידוד וטיהור MACS מנוזל סינוביאלי של ארנב. בדרך כלל במחקר, בשל שיטה זו, אנו עושים מאמצים גדולים, מכיוון שריבוי אוכלוסיית התאים תלוי בייצור תרחיף תא בודד.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר שמנו לב שרק שיטת מיון התאים המופעלת מגנטית מאושרת כיום על ידי ה-FDA ליישומים קליניים. התחל הליך זה בהרדמה של בעלי חיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבצע איסוף של נוזל סינוביאלי מפרקי מברך הארנב, בחר אזור בגודל של כחמישה על חמישה סנטימטרים סביב הברך.

גלח את שיער הארנב מאזור זה באמצעות מכונת גילוח חשמלית בטיחותית. לחלופין, יש לחטא את מקום ההליך בתמיסת יוד פובידון ואתנול 75% שלוש פעמים. לאחר מכן, יש למרוח וילונות סטריליים לאחר שהאזור התייבש היטב.

השתמש במזרק היפודרמי סטרילי כדי להזריק מיליליטר עד שניים של תמיסת מלח איזוטונית לחלל מפרק הברך מהחלל המפרקי הרוחבי. הזז את הברך שלוש עד ארבע פעמים, ולאחר מכן שאב את כל הנוזל הסינוביאלי בטמפרטורת החדר. סנן את הנוזל הסינוביאלי דרך מסננת תאי ניילון של 40 מיקרון כדי להסיר כל פסולת, תוך ארבע שעות.

כדי לתרבית את הארנב SF-MSCs, אספו את הנוזל המסונן בצינורות צנטריפוגה של 50 מיליליטר, וצנטריפוגה במהירות של 1,500 סל"ד למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה ושטפו את הגלולה עם PBS. לאחר השעיית הגלולה עם מדיום התרבות השלם, צלחת את המדיום בכלים של 100 מיליליטר.

דגרו את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה המכילה 5% פחמן דו חמצני. לאחר 48 שעות, מלאו את הכלים במדיום טרי כדי להסיר תאים שאינם דבקים. החלף את המדיום פעמיים בשבוע למשך שבועיים כמעבר אפס.

לאחר 14 יום לאחר הציפוי הראשוני, מושבות רבות היו אמורות להיווצר במנות התרבות. בחר את המושבות בקוטר של יותר משני מילימטרים. סמן היכן ממוקמות המושבות שנבחרו, על ידי התחקות אחר היקפן בתחתית המנה.

השליכו את המושבות ברוחב של פחות משני מילימטרים באמצעות מגרדי תאים. עכל את המושבות שנבחרו עם כחמישה מיקרוליטר של 0.25% טריפסין באמצעות גליל שיבוט, והעביר את המושבות לכלי חדש למעבר. כאשר התאים מגיעים לכ-80% מפגש, שאפו את המדיום.

לאחר מכן, הוסף אחד עד שניים מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל מנה. דגרו את הכלים במשך שתיים-שלוש דקות כדי לאפשר ניתוק תאים. לאחר ניתוק התאים, הוסף כמות שווה של מדיום התרבית כדי להשבית את הטריפסין.

העבירו את תרחיף התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרון ואספו את המסנן בצינור של 15 מיליליטר. לאחר מכן סובב את התאים ב 600 פעמים G למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את גלולת התא במאגר הריצה של MACS.

כדי לבצע תיוג מגנטי, קבע את מספר התא באמצעות המוציטומטר. צנטריפוגה את תרחיף התא ב -300 פעמים G למשך עשר דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שאיבת הסופרנטנט לחלוטין, הוסף 80 מיקרוליטר של מאגר השעיה לכל עשרה מיליון תאים בסך הכל.

עבור עשרה מיליון תאים בסך הכל, הוסף 20 מיקרוליטר של מיקרו-חרוזים מצומדים עם נוגדן CD90 חד שבטי נגד ארנב. מערבבים את החרוזים והתאים המגנטיים באופן שווה בצינורות. לאחר מכן דגרו אותם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.

הוסף מיליליטר אחד של חיץ לכל עשרה מיליון תאים לשפופרת, ולאחר מכן צנטריפוגה ב -300 פעמים G למשך עשר דקות בארבע מעלות צלזיוס, כדי לשטוף את התאים. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ לכל עשרה מיליון תאים.

הנח את העמוד, עם כנפי העמוד לפנים, לתוך השדה המגנטי של המפריד המגנטי. שטפו את עמוד המפריד המגנטי עם 500 מיקרוליטר של המאגר לכל עשרה מיליון תאים. העבר את מתלה התא היחיד לעמודה.

תנו לתאים השליליים לעבור דרך השדה המגנטי כדי להשליך את התאים הלא מסומנים האלה. שטפו את העמודה פעם עד פעמיים עם 500 מיקרוליטר של המאגר לכל עשרה מיליון תאים, והשליכו את הזרימה דרכם. העבירו את העמוד לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר.

הוסף מיליליטר אחד של המאגר לכל עשרה מיליון תאים לעמודה. לאחר מכן דחף מיד את הבוכנה לתוך העמודה, כדי לשטוף החוצה את התאים המסומנים מגנטית. חזור על ההליך הנ"ל עם עמודת מפריד מגנטית שנייה, כדי להגביר את הטוהר של תאים חיוביים CD90, שיכולים להעשיר את השבר המנומק.

לאחר צנטריפוגה של תרחיף התא ב-300 פעמים G למשך עשר דקות, שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה עם מדיום התרבית. חסנו את התאים בצלחות של 100 מיליליטר לאחר מיון התאים המופעלים על ידי מגנטית. דגרו את המנות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת תאים לחה עם 5% פחמן דו חמצני.

כאשר מושגת מפגש של 80 עד 90% של התרבית הראשונית, לאחר כשבעה עד עשרה ימים, עכל את התאים הדבקים עם 0.25% טריפסין EDTA והעביר אותם בדילול אחד עד שניים כדי לבצע מעבר שני. השתמש באותה שיטה כדי להעביר את התאים למעבר שלוש, שניתן להשתמש בו לבדיקות במבחנה. מוצגת כאן, המורפולוגיה של הארנב החד-שכבתי SF-MSCs לפני ואחרי MACS, תחת מיקרוסקופ הפוך.

לפני המיון, אוכלוסיות תאי הנוזל הסינוביאלי של הארנב הדבוק מציגות הטרוגניות. הם מכילים סוגי תאים וגדלים מגוונים כגון מורפולוגיה אליפסה, ציר ארוך, ציר קצר וכוכבית. המורפולוגיה העיקרית של מעבר 2 ו-6 היא מורפולוגיה של ציר.

בעקבות MACS עם CD90, אוכלוסיות התאים מציגות מורפולוגיה הומוגנית. עם תת-התרבית, מספר התאים גדל. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה שתאי SF-MSC של ארנב היו חיוביים לסמני MSC CD44 ו-CD105.

בעוד שלילי לסמן תאי האנדותל CD34, ולסמן התאים ההמטופויאטיים CD45. התוצאות הראו שלפני MACS, אוכלוסיית הארנב SF-MSC הייתה מורכבת מכ-40% תאי MSC. לאחר MACS, האוכלוסייה המועשרת הכילה יותר מ-99% תאי MSC.

מוצג כאן, ניתוח ציטומטריית זרימה של הסמן החיובי CD90 לפני ואחרי מיון MAC. צביעת אליזרין אדום הדגימה כי גושים מינרליים נוצרו באינדוקציה אוסטאוגנית במשך שלושה שבועות. לאחר שלושה שבועות של אינדוקציה אדיפוגנית, הצטברות של ואקואולים עשירים בשומנים זוהתה על ידי צביעת שמן אדום O תוך תאית.

לאחר שבועות של אינדוקציה כונדרוגנית, כדור התא נבדק היסטולוגית עם צביעה כחולה טולואידין. הפרוטאוגליקן החומצי החיובי אפיין את התאים דמויי הכונדרוציטים. לאחר שלושה שבועות של אינדוקציה, התגלה ביטוי ה-mRNA היחסי של סמן האוסטאובלסטים, הסמן האדיפוגני והסמן הכונדרוגני.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את הבידוד הישיר קדימה ואת הטיהור של תאי גזע מזנכימליים מנוזל סינוביאלי של ארנב לבן בניו זילנד. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחור את המושבות הגדולות משני מיליליטר בקוטר.

כמו כן, לייצר תרחיף תא בודד לפני מיון אימונומגנטי, שכן תאים לא רצויים המחוברים לתא מסומן יישארו על החרוז המגנטי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיון תאים מופעל פלואורסצנטי על מנת לענות על שאלות נוספות המתייחסות לבטיחות ויעילות הטיהור של תאי גזע מזנכימליים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום התחדשות הסחוס המפרקי לחקור את תאי ה-CD האידיאליים בתיקון סחוס מפרקי.

אל תשכח שהפעולות בוצעו על ספסל קירור קשת, ויש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות כגון כפפות, בעת ביצוע הליך זה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בפגיעה בסחוס מפרקי, מכיוון ש-MASC שמקורו בנוזל סינוביאלי הם מועמדים מבטיחים להתחדשות סחוס מפרקי.