השימוש נוגדנים Anti-פוספו-girdin להמחיש אניץ מעיים בתאי עכבר לתרשים מעי צם Cryosections

המטרה הכוללת של הליך צביעה זה היא לדמיין תאי ציצית בהקפאת ג'ג'ונום של עכבר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגסטרואנטרולוגיה, כגון כיצד מתרחשת התפשטות תאי ציצית במעי יונקים במהלך זיהום טפיל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שחוקרים בעלי ניסיון היסטרולוגי מוגבל יכולים להשיג תמונות תאי ציצית באיכות גבוהה.

התחל בחשיפת איברי האגן של גופת עכבר קבועה בפורמלין טרי. חותכים את קצה פי הטבעת מפי הטבעת, ומפרידים את המעיים מהגוף על ידי חיתוך המזנטריה. כדי לבודד את הג'ג'ונום, חתכו את המעיים ארבעה סנטימטרים מהצד האנאלי של אנטרום הקיבה, והשליכו את החצי האנאלי של המעי הדק שנותר.

מהדקים את הג'ג'ונום לשניים כדי להקל על הליך השטיפה. טען 20 מיליליטר של תמיסת פורמלין ניטרלית חוצצת 10% למזרק של 20 מיליליטר, והצמד מחט ישרה בגודל 18 כשהשיפוע הוסר. לאחר מכן, יש להזריק תמיסת פורמלין ניטרלית עם 10% חוצץ מקצה אחד של הג'ג'ונום הקצוץ כדי לשטוף החוצה את תוכן המעי, ולקבע את פני השטח של לומן המעי.

שטפו את לומן המעיים על ידי הזרקת PBS. לאחר מכן, שטפו בתמיסת ג'לטין נוזלית כדי להחליף את ה-PBS. סגור קצה אחד של הג'ג'ונום הקצוץ על ידי קשירת תפרים, באמצעות תפר חתוך ניילון 6-0.

מלאו את הג'ג'ונום בג'לטין נוזלי וסגרו את הקצה הנגדי על ידי קשירת תפרים. לאחר מכן, קשרו ארבעה קשרי תפרים לאורך הג'ג'ונום. משרים את הרקמות ב -50 מיליליטר של 15% סוכרוז בתמיסת פורמלין ניטרלית 10% חוצצת למשך הלילה, ב -4 מעלות צלזיוס.

למחרת, חותכים את הג'ג'ונום בקשרי התפרים כדי לקבל שלוש חתיכות ג'ג'ונם דמויות נקניק כששני הקצוות קשורים. יישר את החלקים בתבנית קריו, ולאחר מכן כסה בתרכובת הטבעה. הצמד להקפיא את הקריומולד באיזופנטן מקורר בחנקן נוזלי.

כדי להכין קטעי ג'ג'ונום, התחל בהגדרת טמפרטורת תא הקריוסטט וטמפרטורת האובייקט למינוס 22 מעלות צלזיוס. הנח את גוש הרקמה הקפוא בקריומולד בתא הקריוסטט למשך 15 דקות לפחות. לאחר 15 דקות, חותכים את הבלוק לשניים בעזרת סכין גילוח כדי לחשוף את החלק הרוחבי של הג'ג'ונום.

הרכיב מחצית מהבלוק על מתאם קריוסטט. חתכו את הג'ג'ונום המלא בג'לטין לחלקים בעובי 30 מיקרון. השתמש במלקחיים קפואים כדי להעביר בעדינות את החלקים לכלי תרבית בגודל 35 מילימטר המכיל 3 מיליליטר PBS.

לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת עם 3 מיליליטר PBS-T, הוסף 3 מיליליטר של תמיסת אחזור אנטיגן שהוכנה טרי לכלי המכיל את החלקים הצפים בחופשיות. לאחר מכן, סגרו את המכסה, אטמו את הפער בין המנה למכסה בעזרת רצועת סרט ויניל, ודגרו בחום של 50 מעלות צלזיוס בחממת הכלאה למשך שלוש שעות, מבלי לרעוד. לאחר צביעה חיסונית, העבירו את צלחת החלקים המוכתמים ב- PBS למיקרוסקופ סטריאוסקופי.

הנח 200 מיקרוליטר PBS בטיפה במרכז שקופית זכוכית לבנה מקודדת MAS. לאחר מכן, השתמש בקצה פיפטה P200 כדי להעביר קטע ג'ג'ונום אחד מהצלחת לתוך הטיפה. לאחר התאמת יישור הקטע, שאפו את כל ה-PBS הנותרים המקיפים את הקטע.

הוסף 20 מיקרוליטר של מדיית הרכבה מימית והנח פתק כיסוי על גבי המדיה. אטום מיד את קצוות החלקת המכסה במדיית הרכבה מבוססת קסילן, ואפשר להתייבש במשך שעתיים-שלוש לפני תחילת המיקרוסקופיה הקונפוקלית. מילוי הג'לטין של הג'ג'ונום שומר על צורת הדיסק העגולה ושומר על מיקום זקוף של הווילי.

בהיעדר מילוי ג'לטין, קטעי הג'ג'ונל נוטים להתעקם, מה שמאפשר לווילי להתנדנד לאחור. pY1798 מתאר באופן שחזורי תאי ציצית שלמים, כולל הממברנה, הציטופלזמה של הסומה בצורת סליל והקצה הלומינלי המוכתם חזק, שבו עיבוי אות חזק מתאים לציצית הבולטת של תא ציצית. לפאלואידין יש זיקה גבוהה לאקטין חוטים, הקיים במיקרוווילי היוצרים את גבול מברשת המעי.

הפלואידין מסמן באופן שחזורי ובולט את גבול המברשת המעובה המתאים למסה של שורשים המשתרעת מהציצית. הלוקליזציה העקבית של אותות pY1798 עם גבול המברשת המעובה והחיובי לפאלואידין מוכיחה כי פרוטוקול זה מזהה בהצלחה תאי ציצית ללא קשר אם הם ממוקמים על וילוס או בקריפטה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

ניתן ליישם את השילוב של ג'לטין נקודתי בעל פליטה נמוכה, חתכים קריולוגיים צפים חופשיים ואחזור אנטיגן בטמפרטורה נמוכה לצביעה חיסונית של רקמות פרויקט אחרות.