הערכת סוכנים בתדר Hyperpermeability כלי דם בעור עם וזמינותו Miles

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד דליפת כלי דם בדרמיס העכבר הנגרמת על ידי הזרקה תוך-עורית של חומרים מקדמי חדירות. הליך זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי ויסות חדירות כלי הדם in vivo כגון אילו מולקולות יכולות לעורר או לעכב דליפת כלי דם ומהם מסלולי האיתות המעורבים. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא מהיר ופשוט יחסית והוא משתמש בעיקר בריאגנטים וחומרי מעבדה נפוצים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלות עם בצקת פתולוגית. בפרט, חוקרים יכולים להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות מטרות מולקולריות חדשות ולבדוק תרופות רלוונטיות ליכולתן לעכב את חדירות כלי הדם בצורה מהירה ופשוטה יחסית. הכן תמיסות נפרדות של מעכב ההיסטמין פירילמין מלאט וצבע כחול אוונס שניהם בתמיסת מלח של 0.9%.

לאחר מכן עבדו בארון זרימה למינר, עקרו את התמיסות על ידי מעבר דרך פילטר של 0.22 מיקרומטר. טען את שני התמיסות במזרקים נפרדים של מיליליטר אחד המצוידים במחטים בגודל 30. לאחר מכן, קשקש את העכבר.

לאחר מכן הטה את העכבר כך שהראש מופנה לכיוון הקרקע והבטן כלפי מעלה. לאחר מיקום העכבר, יש לתת 10 מיקרוליטר לגרם משקל גוף של תמיסת Pyrilamine Maleate על ידי הזרקה תוך-צפקית. לאחר מכן, על מנת לקדם הרחבת כלי דם, הניחו את העכבר בתא חום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן העבר את העכבר למסננת עכבר. לאחר מכן, שפשפו את הזנב באתנול 70% להרחבת כלי דם נוספת. יש לתת 100 מיקרוליטר של תמיסת Evans Blue Dye דרך הווריד דרך וריד הזנב.

כדי למנוע דימום, החזיקו במהירות את הזנב בין האצבע לאגודל והפעילו לחץ במקום ההזרקה. הזרקה תוך ורידית של Evans Blue Dye לווריד הזנב של העכבר היא שלב קשה וקריטי בהליך זה. בהתאם לכך, חיוני שהחוקרים יהיו מוכשרים לבצע הזרקה זו לפני שתמשיך בשאר ההליך.

ביסוס מיומנות ידרוש תרגול מוקדם. השתמש בתמיסות סטריליות של מי מלח חוצץ פוספט כדי לדלל מגיב VEGF כך שהנפח הסופי של המינון הוא 20 מיקרוליטר. לאחר מכן טען את המגיב המעורר חדירות VEGF ואת בקרת הרכב בשני מזרקים נפרדים של 300 מיקרוליטר המצוידים במחטים בגודל 31

שמור על המחט בזווית של 15 מעלות עם העור והזריק 20 מיקרוליטר של VEGF תוך עורית לתוך צד העכבר. אתר בועה מוגבהת בתוך העור כדי לאמת הזרקה מוצלחת. יש לבצע הזרקות תוך עוריות בשני אתרים נוספים המרוחקים סנטימטר אחד לפחות זה מזה.

לאחר מכן סובב את העכבר כדי לחשוף את הצד השני וחזור על הזרקות משולשות עם תמיסת הרכב. שמור תיעוד עבור כל אחד מאתרי ההזרקה על הנייר והשעה בה מסתיים הליך ההזרקה. לאחר מכן העבירו את העכבר לכלוב הביתי.

המשך לעקוב אחר העכבר עד שהוא חוזר להכרה ומתחיל לנוע סביב הכלוב. תנו לתמיסת ה-VEGF לפעול במשך 20 דקות לפני שאתם קוראים לעכבר. בשלב זה, יש להזריק ברצף VEGFA ורכב לכל העכברים לפי אותו הליך.

לאחר 20 דקות, הניחו כל עכבר שהורדם על גבו והצמידו את רגליו על לוח שעם עטוף ברקמה נקייה. לאחר מכן, בעזרת מספריים קהים, בצע חתך אנכי באורך של שלושה עד ארבעה סנטימטרים מהבטן התחתונה לחזה העכבר המת. לאחר מכן השתמש במלקחיים ובאזמל כדי להקניט את העור משני צידי האגף.

השתמש באזמל כדי להסיר כל שומן אם קיים באזורים סביב אתר הדליפה. לאחר מכן השתמש במלקחיים ובאזמל כדי לכרות את אזורי העור עם צבע כחול של אוונס שדלף. אזורי העור שנכרתו חייבים להיות בגודל דומה.

העבירו את דגימות העור לצינורות של 1.5 מיליליטר ותייגו בהתאם. יבש את הדגימה על ידי הנחת הצינור הפתוח בגוש חום למשך הלילה. לאחר השלמת הייבוש, הוסף 250 מיקרוליטר של פורממיד נטול יונים לדגימה במכסה אדים.

סגור את מכסה הצינור והניח אותו בגוש חום למשך הלילה כדי לחלץ את צבע אוונס. צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 גרם ומעלה למשך 40 דקות בצנטריפוגה על שולחן. לאחר הצנטריפוגה, העבירו 100 מיקרוליטר מכל סופרנטנט המכיל צבע מהדגימה הצנטריפוגתית לבארות של צלחת של 96 בארות הפועלת במכסה אדים.

קרא את ספיגת אוונס בלו באמצעות ספקטרופוטומטר. כדי לחקור דליפת כלי דם הנגרמת על ידי VEGF, מוזרק לעכבר 50 ננוגרם של VEGFA בתמיסת מלח חוצצת פוספט או רק מי מלח חוצץ פוספט כרכב. התמונה מציגה עלייה בהצטברות של צבע כחול אוונס שדלף בדגימות העור שהוזרקו עם VEGFA בהשוואה לבקרת הרכב באתרה.

תמונת צלחת זו של 96 בארות מציגה את הצבע הכחול הטעון של אוונס המופק בפורממיד מדגימת העור. תרשים גרפי זה מציג את ערכי הספיגה המנורמלים של דגימות VEGFA מזווגות ודגימות בקרה לרכב בלבד. העלילה מראה כי הזרקת 50 ננוגרם של VEGFA מגדילה משמעותית את הדליפה של צבע אוונס בהשוואה לרכב בלבד.

גרף זה מתקבל לאחר כימות שינויי הקיפול בצפיפות האופטית של ה-VEGFA לעומת דגימות הרכב. התרשים מראה עלייה ממוצעת של פי שלושה בדליפת כלי הדם לאחר מתן VEGFA בהשוואה לרכב בלבד. לאחר שליטה, ניתן לבצע את הקטע העיקרי של טכניקה זו תוך שעתיים אם מבוצע כראוי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנרמל דליפת כלי דם הנגרמת על ידי סוכן לדליפת כלי דם הנגרמת על ידי רכב כדי להסביר דליפת כלי דם לא ספציפית ושונות בין עכברים. ניתן לשלב הליך זה עם שיטות אחרות כגון מתן תרופות על מנת לענות על שאלות כגון האם ניתן למקד חלבון לעיכוב חדירות כלי הדם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של כלי הדם לחקור את המנגנונים המולקולריים של חדירות יתר של כלי הדם בעכברים מהונדסים גנטית המזהים רכיבי איתות מרכזיים הנדרשים לדליפה של כלי הדם.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום ולמדוד דליפת כלי דם בדרמיס העכבר.