Name: עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: למדו שיטת הזרקה עמוקה עורית של Candida albicans לניתוח היסטולוגי של דלקת עור. הטכניקה שומרת על מבנה העור ומאפשרת זיהוי מיקום תאים חיסוניים במהלך זיהום פטרייתי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

FG נתמכת על ידי Associazione Italiana לכל החיפוש אחר לה סול Cancro (IG 2016Id.18842), קרן Cariplo (גרנט 2014-0655) דל'אנג'לו Regionale לכל la החיפוש אחר Biomedica (FRRB). איז נתמך על-ידי NIH גרנט 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 גרנט, הרווארד בית הספר לרפואה מילטון נמצאו פרסי מחקר בכיר CCFA (412708), אלינור, החוף Miles תכנית העמיתים יום הנישואין ה-50 שלהם, את (קרן Cariplo 2014-0859).

כל ההליכים היו מאושרים תחת טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC) ולא פעלו תחת פיקוחו של המחלקה של משאבים בעלי חיים לילדים חולים (קשת) בבית החולים לילדים בבוסטון או אושרו על-ידי האיטלקי משרד הבריאות והופיע תחת מוסדיים חיה טיפול הוועדה ב האוניברסיטה של מילאנו-ביקוקה.
1. הכנה ג אלביקנס
<ol><li>תרבות ג אלביקנס, זן CAF3-113, צינורות המכילות בינוני עשיר (דקסטרוז peptone תמצית שמרים (YEPD), תמצית שמרים 1% (w/v), 2% (w/v) מה נשארתי Peptone, 2% (w/v) גלוקוז) בתוספת uridine (50 מ"ג/ליטר) ב 25 º C. בתנאים אלה אלביקנס ג גדל כמו שמרים. הערה: זנים אחרים אלביקנס ג יכול לשמש, כגון זן SC5314 אלביקנס ג 13לבודד קליני. מאז לאחרונה הראו כי התהליך כיבית הנגרמת על ידי הפעלת מערכת החיסון המולדת14, תיאורטית כל זן אלביקנס ג המתחזק את רכיבי קיר התא והן המבנה, כמו גם היכולת מקורם ההקרנות hyphal, יכול לשמש.</li>
	<li>נטר את התרבות על ידי ספירת הריכוז הסלולר באמצעות מנתח מונה תא.</li>
	<li>הקציר התרבות כאשר הוא מגיע ריכוז של 8 x 106 תאים למ"ל. לחלופין, השתמש ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את יתר600. הערה: בדרך כלל, ערך של יתר600 = 1 מקביל ריכוז השמרים של 3 x 107 תאים למ"ל, אך מומלץ טיטור.</li>
	<li>Resuspend התרבות YEPD-uridine בינוני, באמצעות HEPES (50 מ מ, pH 7.5) כסוכן מאגר, דגירה התרבות ב 37 ° C כדי לעודד היווצרות hyphae. בדוק היווצרות hyphal תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 100. צורה hyphal היא גלויה 5 שעות לאחר culturing ב 37 מעלות צלזיוס; עם זאת, להשתמש התאים 16 h לאחר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס כאשר האחוז hyphal מגיע כמעט 95% של התרבות הכולל.</li>
	<li>להעשיר עוד את ההכנה בריכוז hyphal, צנטריפוגה aliquots של התרבות-3,300 g x עבור 5 דק. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב- PBS סטרילי-ריכוז של עונה 1 פרק 108 hyphae/mL....</li>
</ol>2. הזרקת עורי עמוק
<ol><li>24 שעות לפני ההליך זיהום, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג), ואז מגלחים את האגף של העכברים באמצעות של קוצץ חשמלי. הערה: לאחר כל נוהל הכרוכים בהרדמה, הנח העכברים תחת מנורת חימום עד הם התאוששו ביעילות.</li>
	<li>שאר העכברים במשך 24 שעות ביממה למנוע כל דלקת עקב תהליך הגילוח.</li>
	<li>24 שעות לאחר הניתוח גילוח, עזים ומתנגד העכברים עם זריקה בקרום הבטן של קטאמין (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג).</li>
	<li>בדוק את רפלקס כפה על מנת להבטיח כי העכברים הם מרדימים עמוקות. להעריך את רפלקס פאו מאת בחוזקה צובט את כף הרגל. אם ההרדמה מושגת, החיה לא להרגיש כאב, לא זזה.</li>
	<li>מזריקים hyphae אלביקנס ג ב למחרת עמוק באמצעות מזרק אינסולין 0.3 mL עם מחט 30 G x 8 מ מ נפח סופי של 50 µL הזרקה, המקביל 5 x 106 hyphae הזרקה.<ol>
<li>משוך את העור של האגף מגולח מתוח בעזרת שתי אצבעות כדי להזריק את עוצמת הקול ישירות בלמחרת היום עמוק. הכנס את המחט עם זווית של 10-15° עם שפוע של המחט פונה כלפי מעלה.</li>
		<li>בזווית זו, המחלה להיות מוזרק עם עומק של 300-500 מיקרומטר. כדי להבטיח שההזרקה מבוצעת טוב, בדוק האחסון מוזרק יוצר בליטה זה נספג כמה דקות לאחר ההזרקה. הערה: בליטה נוצרו לאחר הזריקה יהיה של 1 ס מ.2. זהו האזור יוסר בנקודת הזמן המיועד לבדיקה היסטולוגית או מולקולרית.</li>
		<li>נקודות זמן על פחות מ 24 שעות (מומלץ) לסמן את האזור של זיהום עם עט מרקר, מאז המכשול הקים עם ההזרקה נמשכת לכמה דקות, אחרי אשר נספגות. עבור נקודות זמן של 24 שעות או יותר, שלב זה אינו נדרש, כי אולקוס או ציסטה יהיה גלוי בבירור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. לטעום איסוף והכנה היסטולוגית מכתים
<ol><li>המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים כירורגיים, משוך את העור בגבול של אתר מוזרק, שסומן קודם לכן עם טוש. באמצעות מספריים כירורגיים, לסלק את האתר הנגוע על ידי חיתוך העור אחרי קו מסומן. הערה: להיות זהירים להפריד את העור הצפק בעזרת המספריים עגול.</li>
	<li>לטבול את העור של תבנית הבסיס חד פעמי מלא עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) במתחם, עם הצד הפנימי של העור כלפי מעלה. להקפיא את הדגימה של חנקן נוזלי עד למתחם הופך לבן. לא נותנים החנקן הנוזלי לכסות המדגם לפני זה קפוא לחלוטין כפי שזה היה פוגע. המדגם. הערה: זהירות! במהלך שלב 3.3, ללבוש מגן הפנים להגנה מפני חנקן נוזלי.</li>
	<li>אם הדגימות לא משמשים מיד להכנה שקופיות, במהירות לאחסן אותם ב- 80 ° c הערה: דוגמאות שניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>4. הכנה של שקופיות
<ol><li>לחצי את הדגימה כדי להכין את הפרוסות היסטולוגיה החל המרכז של המדגם.</li>
	<li>חותכים 5-מיקרומטר פרוסות עבות עם cryostat. הערה: עבור דגימות עור, הטמפרטורה של cryostat לא צריך להיות גבוה מ-25 מעלות צלזיוס. טמפרטורה גבוהה יותר תגרום התכה חלקית של ה-H-OCT ומתוחזק ולכן הדגימות לא להיות בתנוחה הנכונה במהלך ההליך חיתוך.</li>
	<li>השתמש שקופיות מיקרוסקופ הטעון חיובית כדי לאסוף את הפרוסות.</li>
	<li>אם הפרוסות שנאספו לא משמשים מיד לאחר ההכנה, לאחסן אותם ב-20 ° C. בשלב זה, פרוסות שניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
</ol>5. hematoxylin & אאוזין מכתים
<ol><li>כתם השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 4 דק לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.</li>
	<li>כתם שהשקופיות על-ידי טבילה אאוזין Y לפתרון מינימלית 1 לשטוף את השקופיות פועל ברז מים במשך 5 דקות יש לשטוף את השקופיות בעזרת מים מזוקקים לפני שתמשיך את הפרוטוקול.</li>
	<li>מייבשים על ידי טבילה באופן סדרתי הגדלת ריכוזי אתנול פתרונות (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). לטבול את השקופיות 15 s בכל הפתרונות אתנול.</li>
	<li>לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.</li>
	<li>לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.</li>
	<li>לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ בהגדלה גדולה-X 40.</li>
</ol>6. חומצה המחזורית-שיף (PAS) מכתים
<ol><li>לתקן השקופיות עם אצטון % ≥99.5 בטמפרטורת החדר במשך דק 1. שטיפת בשקופיות זורמים מהברז עבור 1 דקות.</li>
	<li>כתם השקופיות על-ידי טבילה בפתרון המחזורית חומצה (1 g/dL) עבור 5 דק שטיפת בשקופיות 3 שינויים של מים מזוקקים.</li>
	<li>כתם השקופיות על-ידי טבילה ריאגנט של שיף במשך 15 דקות לשטוף את השקופיות פועל מי ברז למשך 5 דקות.</li>
	<li>כתם על השקופיות על-ידי טבילה hematoxylin של גיל עבור 5 דק. לשטוף את השקופיות מפעיל ברז ל 30 s.</li>
	<li>מייבשים את השקופיות על-ידי טבילה 3 שינויים של 100% אתנול. לטבול את השקופיות 15 s בכל פעם.</li>
	<li>לנקות את השקופיות למשך לפחות 2 דקות על ידי טבילה סוכן סליקה היסטולוגית.</li>
	<li>לטעון את השקופיות בעזרת הרכבה בינונית, שער גולשת.</li>
	<li>לרכוש תמונות של השקופיות עם סורק שקופיות מיקרוסקופ.</li>
</ol>7. לטעום איסוף והכנה החילוץ-RNA
<ol><li>המתת חסד העכברים על פי הנהלים מוסדיים. הסר את דגימות עור כמו שלב 3.2.</li>
	<li>לטבול את הדגימות צינור כובע הצמד 2 מ"ל עם 1 מ"ל של ריאגנט לחילוץ thiocyanate-פנול-כלורופורם חומצה guanidinium. הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן, ניתן לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לחתוך את הדגימה לחתיכות של 0.2 ס מ2 באמצעות מלקחיים כירורגיים. הערה: זהירות! רוב ריאגנטים עבור בידוד ה-RNA הם רעילים מוטגניות. צעדים 7.3 7.4 חייב להיעשות תחת ברדס fume.</li>
	<li>לרסק את הדגימה עם מפעל חרוז במהירות של תנודות בשנייה 20 על 20 דק. לחלופין, קדר מכני יכול לשמש.</li>
	<li>בדוק את המגון יעיל של הדגימות וחיפש את הנוכחות של חתיכות שלמות של העור. חזור על שלב זה אם הדגימות לא הומוגני לגמרי.</li>
	<li>Centrifuge הדגימות-16,000 x g עבור 1 מינימלית לשמור את supernatants לחילוץ RNA וזורקים בגדר. שלב זה מבוצע כדי לחסל שיער ופסולת יכול לחסום את העמודות החילוץ.</li>
	<li>להמשיך עם החילוץ-RNA באמצעות עמודות טיהור רנ א14.</li>
	<li>השתמש ספקטרופוטומטרים לאמוד ריכוז וטיהור של RNA. אם RNA תמציות לא משמשים מיד להכנה cDNA, אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
<li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178391">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li>
<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14661066">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 4 (1), 11-24 (2004).</li>
<li>Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Candida+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Candida infections.</a> J Am Acad Dermatol. 31 (3), S2-S5 (1994).</li>
<li>MacCallum, D. M., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+events+in+the+intravenous+challenge+model+for+experimental+Candida+albicans+infections+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Temporal events in the intravenous challenge model for experimental Candida albicans infections in female mice.</a> Mycoses. 48 (3), 151-161 (2005).</li>
<li>Dai, T., Kharkwal, G. B., Tanaka, M., Huang, Y. -Y., Bil de Arce, V. J., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+external+traumatic+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of external traumatic wound infections.</a> Virulence. 2 (4), 296-315 (2018).</li>
<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
<li>Florescu, D. F., Brostrom, S. E., Dumitru, I., Kalil, A. C. <a target="_blank" href="https://journals.lww.com/infectdis/Abstract/2010/07000/Candida_albicans_Skin_Abscess_in_a_Heart.6.aspx">Candida albicans Skin Abscess in a Heart Transplant Recipient.</a> Infect Dis Clin Pract. 18 (4), 243-246 (2010).</li>
<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
<li>Cheng, A. G., DeDent, A. C., Schneewind, O., Missiakas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+play+in+four+acts%3A+Staphylococcus+aureus+abscess+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A play in four acts: Staphylococcus aureus abscess formation.</a> Trends Microbiol. 19 (5), 225-232 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנחנו תיאר שיטה של זיהום אלביקנס ג ללמוד תהליך דלקתי שמאותחלת הכניסה פטרייתי ב למחרת היום עמוק.
אף-על-פי להצטברות של העור הוא אירוע נדיר יחסית על זיהום אלביקנס ג 15, הזרקה של הפטרייה ישירות בלמחרת היום עמוק מאפשר לא רק חקר היווצרות מורסה מונחה-פטרייתי, אלא גם הניתוח של החיסון ספציפי תאים להשתתף להכיל פטרייתי להתפשט. עם השיטה המתוארת כאן, זה אפשרי ללמוד את האינטראקציה בין תאים חיסוניים, כמו גם הגיוס של תאים חיסוניים חשובים בהשתלטות על התפשטותה פטריי...

גוף האדם מכוסה עם מספר גבוה מאוד של מיקרואורגניזמים. לפני השטח של העור הוא בית הגידול של כמעט מיליון חיידקים לכל סנטימטר מרובע1. מספר זה, עם זאת, אינו משקף על המגוון המלא של מיקרואורגניזמים והצנרות העור. בנוסף חיידקים, גוף האדם הוא התנחלו על ידי מינים פטרייתי רבים, כולל אלביקנס ג, שזה מסוגל לשרוד הן את הרירית והן את העור ברמה2.
בשנים האחרונות גדל מאוד האחוז של אנשים שאובחנו עם זיהומים פטרייתיים. זאת בעיקר בשל העלייה במספר אנשים immunocompromised, קרי, חולי HIV-חיובי. וכלפי מטופלים עברו כימותרפיה או תרופות לדיכוי המערכת החיסונית לאחר השתלת3. במחקר מעקב שנערך בארצות הברית, Wisplinghoff. et al. הראה כי 9.5% של זיהומים nosocomial למחזור הדם שנגרמו על ידי זנים של קנדידה 4. עקב המופע מוגברת של זיהומים פטרייתיים, במיוחד בגלל האחוז מוגברות של קנדידה מינים נמצאו במהלך זיהומים למחזור הדם, הבנת איך הפתוגן הזה בורח השליטה של מערכת החיסון היא מאוד חשוב.
ג אלביקנס הוא בפטריה dimorphic שגדלה בצורות מורפולוגיות שונות כגון שמרים, blastospores, pseudohyphae ו- hyphae בהתאם לתנאים סביבתיים5. בצורתו hyphal, אלביקנס ג מציג את הקיבולת הגבוהה שלו invasiveness ויש לו את היכולת לחדור את אפיתל6.
זיהומים אלביקנס ג נחקרו באמצעות מספר גישות ניסיוניות. המודל הנפוץ ביותר של זיהום הוא הזרקה תוך ורידי של שמרים אלביקנס ג 7. עם זאת, מודל זה לא להתחשב בכל התהליכים זה יקרה לפני הפטריה מצליח להתפשט למחזור הדם. מודל נוסף מנצל היכולת של אלביקנס ג לפלוש האפיתל. בשיטה זו, המכונה גם נייר דגם8, פותחה על ידי Gaspari et al. . ב 19989, מורכב באמצעות נייר חול כדי תשפשפו את העור, וכך למנוע את הקרנית לפני החלת אלביקנס ג. הליך זה מאפשר את הפטרייה לחדור האפיתל, ובכך מאפשר ניתוח פולשני ביכולות של הפתוגן הזה. לבסוף, דגמים אחרים של זיהומים במערכת העיכול10 ו כלי הנשימה11 השתמשו במחקרים שונים.
היווצרות פצע (כמו דגם נייר חול) גורמת את ההפעלה של כמה מסלולים, כולל תא החיסון גיוס והפעלה, על מנת לקדם את תהליך הריפוי12. זה יכול לשנות או להסתיר את התגובה החיסונית במיוחד elicited נגד המחלה, ובכך מוביל משתנה מתערב תוצאות.
כאן נתאר שיטת דלקת עור זה מונע היווצרות פצע הראשונית ואת של אינדוקציה של סביבה דלקתית הבזליים. כדי לשמור על המבנה אפיתל ללא פגע, ישירות נזריק אלביקנס ג בצורתה hyphal ב למחרת היום עמוק. אף-על-פי זריקה אחת יכול להפיק דלקת קלה, הכמות של דלקת מוגבלת, מוגבל לעומת היווצרות פצע פתוח כמו דגם נייר חול. הגישה כי אנו מתארים כאן מאפשר המחקר של התגובה החיסונית לזיהום פטרייתי, התפשטה תוך הימנעות הסביבה דלקתית מוגזמת ולא קיימים נגרם נזק מכני.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט C לפני השימוש</td></tr><tr><td>מעבדות היסטו-קו</td><td>תרכובת H-OCT</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות קו היסטו המטוקסילין של גיל</td><td></td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Eosin Y, מעבדות קו היסטו אלכוהולי</td><td></td><td>09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>אתנול אבסולוט</td><td>שרלאו</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות</td><td></td> <td>קו היסטו של Citro-HISTOCLEARR0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, הרכבה בינונית</td><td>ביו-אופטיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>מערכת צביעה PAS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרי בקטו</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז נטול מים לביולוגיה</td> <td>מולקולריתApplichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה 2 מ"ל</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>רעיל, קורוזיבי ומוטגן. השתמש בכל אמצעי הזהירות הדרושים</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>חנקן</td><td></td><td></td> נוזלי <td>ללבוש מגן עיניים</td></tr> <tr><td><חזק>מכשיר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולטר נגד ספירת חלקיקים</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td> מעבדות <td></td><td></td><td>היסטו-ליין</td></tr><tr><td>רקמותLiser</td><td>QIAGEN</td><חזק>חומרים<<td></td><td></td></tr><tr><td>/חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.3 מ"ל מזרק אינסולין עם מחט 30 גרם x 8 מ"מ&nbsp;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td></td><td></td><td></td>כירורגיים</tr><tr><td>מספריים</td><td></td><td></td><td></td>כירורגיים</tr><tr><td>עובש בסיס מעבדות חד פעמיות</td><td></td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות ביו-מיקרוסקופ טעונות חיובית</td><td>ביו-אופטיקה</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי 24 x 50 מ"מ</td><td>תרמו מדעי</td><td>11911998</td><td></td></tr></tbody></table>

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

העור הוא איבר מאוד מורחבת של הגוף, עקב זה משטח גדול, ללא הרף ייחשף מיקרואורגניזמים. נזק לעור יכול בקלות להוביל דלקות הדרמיס והתוצאה בתורו, יכול, להיות הפצת פתוגנים למחזור הדם. הבנת איך מערכת החיסון נלחם זיהומים בשלב מוקדם מאוד, איך המחשב המארח יכול לחסל פתוגנים היא צעד חשוב כדי להגדיר את הבסיס עבור התערבויות טיפוליות עתידיות. כאן נתאר מודל של זיהום קנדידה אלביקנס שיכולים להמחיש את התהליכים המתרחשים מוקדם במהלך זיהום, כולל בעת המחלה עברה את מחסום האפיתל, כמו גם את התגובה החיסונית שהפיק את אלביקנס ג הפלישה. השתמשנו מודל זיהום זה כדי לבצע ניתוח היסטולוגית המציגים את התאים החיסוניים זה לחדור את העור, כמו גם את הנוכחות ואת לוקליזציה של המחלה. הדגימות שנאספו לאחר הזיהום ניתן לעבד לחילוץ RNA.

באמצעות ההזרקה של המחלה ישירות בלמחרת היום עמוק, המורפולוגיה מבנית של רקמת נשאר שלם (איור 1 א').
שמירה על העור המבנית מאפשרת הגילוי של תאים חיסוניים ולוקליזציה שלהם באתר של זיהום. ההגדלה גבוה יותר באיור איור 1B מגלה כי המורסה מורכבת בעיקר מ אורך חייהם לויקוציטים (PMCs) המכילים את התפשטות המחלה על ידי ריתוק שלה באתר של זיהום. גיוס של PMCs, כגון נויטרופילים, מאפשרת היווצר...

כאן נתאר פרוטוקול המאפשר ניתוח היסטולוגית ומולקולרית של דגימות עור לאחר ההזרקה intradermal קנדידה אלביקנס . פרוטוקול זה שומר על שלמות המבנה של העור ומאפשר הלוקליזציה של תאים חיסוניים רקמות-תושב או שזה עתה מגויסים, כמו גם את ההתפלגות הפתוגן.

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בהפעלת מערכת החיסון במהלך זיהומי עור על ידי הזרקת קנדידה אלביקנס לשימור ארכיטקטורת העור ולוקליזציה של תאים חיסוניים ולא חיסוניים ספציפיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגי כגון האופי והלוקליזציה של תאי החיסון המגויסים במהלך זיהומי עור והמתווכים העיקריים המעורבים. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שמירה על הארכיטקטורה המבנית של העור לאחר הזרקת פטריות המאפשרת לנו להבין את הלוקליזציה של כל סוג תא חיסוני.תדגים חלק מההליך ג'וליה סטמרה, דוקטורנטית ממעבדתה של פרופסור מרינה ואי. בתור התחלה, יש לחסן את זן C.Albicans CAF3-1 בשפופרות המכילות מדיום עשיר בתוספת 50 מיליגרם לליטר אורידין ותרבית ב-25 מעלות צלזיוס. בתנאים אלה, C.albicans גדל כשמרים.עקוב אחר התרבית באמצעות מנתח מונה תאים או ספקטרופוטומטר למדידת ריכוז התא. כאשר התרבית מגיעה לשמונה פעמים 10 עד שישית תאים למיליליטר, קצרו את הדגימה. השתמש במדיום YEPD-uridine עם Hepes כחומר חציצה כדי להשעות מחדש את התאים ולדגור אותם ב-37 מעלות צלזיוס כדי לגרום להיווצרות קורים.לאחר חמש שעות בתרבית, כאשר הקורים אמורים להיות גלויים, תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 100 בדוק את היווצרות הקור. תרבית התאים במשך 16 שעות בסך הכל, ואז 95% מהתרבית ייצרו קורים. כדי להעשיר עוד יותר את ריכוז הקורים, צנטריפוגות מכילות את התרבית ב -3, 300 פעמים גרם למשך חמש דקות.השליכו את הסופרנטנט והשתמשו ב-PBS סטרילי כדי להשעות מחדש את הגלולה בריכוז של 1 כפול 10 עד הקור השמיני למיליליטר. לאחר הרדמת עכבר מגולח על פי פרוטוקול הטקסט, בדוק את רפלקס הכפות כדי לוודא שהחיה מורדמת עמוק. כדי להזריק קורי C.albicans לדרמה העמוקה, השתמש בשתי אצבעות כדי למשוך את עור האגף המגולח מתוח, ולאחר מכן הכנס מחט בגודל 30 בגודל שמונה מילימטר המחוברת למזרק אינסולין של 0.3 מיליליטר בזווית של 10 עד 15 מעלות, כאשר שיפוע המחט פונה כלפי מעלה, והזריק נפח סופי של 50 מיקרוליטר המתאים לחמש כפול 10 לקורות השישית.אם זווית ההזרקה גבוהה מ-15 מעלות, הפתוגן יוזרק עמוק מדי לתוך הדרמה, תוך סיכון לפגיעה בצפק ובעיקר לאבד את האפשרות לחקור זיהומים במיוחד ברמת העור. בזווית זו, הפתוגן יוזרק בעומק של כ-300 עד 500 מיקרון. כדי להבטיח שההזרקה מבוצעת היטב, בדוק שהנפח המוזרק יוצר בליטה הנספגת לאחר מספר דקות.לנקודות זמן של פחות מ-24 שעות, השתמש בעט טוש כדי לסמן את אזור הזיהום, מכיוון שהבליטה שנוצרה עם ההזרקה נמשכת מספר דקות. עבור נקודות זמן של 24 שעות ואילך, שלב זה אינו נדרש, מכיוון שכיב או ציסטה ייראו בבירור. לאחר המתת חסד של העכברים באמצעות הנחיות מוסדיות, בעזרת מלקחיים כירורגיים מושכים את העור בגבול המקום המוזרק שסומן קודם לכן בעט הסמן, ולאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים, כורתים את המקום הנגוע על ידי חיתוך העור לפי הקו המסומן.טבלו את העור כשהצד הפנימי פונה כלפי מעלה בתבנית בסיס חד פעמית מלאה בתרכובת O.C.T. מקפיאים את הדגימה בחנקן נוזלי עד שהתרכובת הופכת לבנה. אל תתנו לחנקן הנוזלי לכסות את הדגימה לפני שהיא קפואה לחלוטין, מכיוון שהדבר יפגע בדגימה.להכנת שקופיות, החל ממרכז הדגימה חותכים את הדגימה לשניים כדי להכין את הפרוסות להיסטולוגיה, ואז, בעזרת קריוסטט, חותכים פרוסות בעובי חמישה מיקרון. השתמש בשקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובית כדי לאסוף את הפרוסות. כדי לבצע צביעת H&E, טבלו את השקופיות בהמטוקסילין של גיל למשך ארבע דקות, ולאחר מכן שטפו את המגלשות במי ברז זורמים למשך חמש דקות.טבלו את המגלשות בתמיסת eosin-Y למשך דקה אחת, שטפו את המגלשות במי ברז זורמים למשך חמש דקות, ולאחר מכן השתמשו במים מזוקקים כדי לשטוף את המגלשות. לאחר מכן, ייבשו את הדגימות על ידי טבילתן בסדרת אתנול למשך 15 שניות כל אחת. כדי לנקות את השקופיות, העבירו אותן לחומר ניקוי היסטולוגי למשך שתי דקות לפחות, ולאחר מכן השתמשו במדיום הרכבה ובפתקי כיסוי כדי להרכיב את הדגימות.השתמש בסורק שקופיות מיקרוסקופ בהגדלה של פי 40 כדי לצלם את השקופיות. בצע תמיסת חומצה מחזור או צביעת PAS על ידי שימוש באצטון בטמפרטורת החדר כדי לתקן את השקופיות למשך דקה אחת, ולאחר מכן השתמש במי ברז זורמים כדי לשטוף את השקופיות למשך דקה אחת. טבלו את השקופיות ב-PAS למשך חמש דקות, ולאחר מכן השתמשו בשלושה החלפות של מים מזוקקים כדי לשטוף את הדגימות.לאחר מכן טבלו את המגלשות במגיב של שיף למשך 15 דקות, ולאחר מכן השתמשו במי ברז זורמים כדי לשטוף את המגלשות במשך חמש דקות. טבלו את הדגימה בהמטוקסילין של גיל למשך חמש דקות כדי להכתים אותן, ולאחר מכן שטפו את השקופיות במי ברז זורמים למשך 30 שניות. ייבשו את הדגימות על ידי טבילה בשלושה שינויים של 100% אתנול למשך 15 שניות כל אחד, ולאחר מכן טבלו את השקופיות בחומר ניקוי היסטולוגי.עם מדיום הרכבה ותלושי כיסוי, הרכיב את הדגימות שנוקו ולאחר מכן השתמש בסורק שקופיות מיקרוסקופ כדי לצלם את הדגימות. לאחר המתת חסד של העכברים והסרת דגימות עור כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, טבלו את הדגימות בצינור של שני מיליליטר עם מיליליטר אחד של מגיב למיצוי חומצה גואנידיניום תיוציאנט פנול כלורופורם. השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לחתוך את הרקמה לחתיכות של 0.2 סנטימטר מרובע.בעזרת טחנת חרוזים, מרסקים את הדגימות ב -20 תנודות לשנייה למשך 20 דקות. אם עדיין קיימות פיסות עור שלמות, חזור על הריסוק עד שהדגימה תהיה הומוגנית לחלוטין. צנטריפוגה את הדגימות ב-16,000 פעמים גרם למשך דקה אחת.שמור את חומרי העל למיצוי RNA והשליך את הגלולה. שלב זה מבוצע כדי להעלים שיער ופסולת שעלולים להפריע לתהליך החילוץ. לאחר חילוץ ה-RNA עם עמודת טיהור, השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז ה-RNA והטוהר.שמירה על שלמות מבנית העור מאפשרת זיהוי של תאי מערכת החיסון ומיקומם במקום הזיהום. הגדלה גבוהה זו מגלה כי המורסה מורכבת בעיקר מ-PMCs המכילים את התפשטות הפתוגן על ידי כליאתו לאתר הזיהום. האזורים הסובבים את המורסה מועשרים גם הם ב-PMC.באיור זה, צביעת PAS, המעניקה לפטרייה צבע סגול-מג'נטה, מראה בבירור כי הפתוגן מוגבל בתוך המורסה שנוצרה על ידי גיוס גרנולוציטים. C.albicans נראה בבירור בהגדלה גבוהה יותר ונראה שהוא מוקף בתאים נמקיים וחיסוניים. בתחילת תהליך הזיהום, גיוס תאי החיסון מוביל להיווצרות המורסה.48 עד 72 שעות לאחר ההדבקה, שיבוש מבני העור והיווצרות צלקת הודגמו עקב שלב הריפוי לאחר גירוש הפתוגן. כפי שמוצג כאן, עכברים מסוג בר מציגים תהליך כיבי שמתגבר עם הזמן. על ידי טיפולים ספציפיים או חוסרים גנטיים, ניתן להפחית ו/או לבטל את היווצרות הכיב.במקרים מסוימים, במקום כיב, תיווצר ציסטה כפי שניתן לראות כאן. בעקבות הליך זיהום זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיצוי חלבונים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו הפעלת מסלולים תוך-תאיים ספציפיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הזרקה של C.Albicans בעור כדי לחקור את מעורבות מערכת החיסון במהלך זיהום מיקרוביאלי מבלי לשבש את הארכיטקטורה של האפיתל.אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים למיצוי RNA עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש במכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.

deep-dermal-injection-as-model-candida-albicans-skin-infection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל עכבר in vivo לחקר היווצרות ביופילם של קנדידה אלביקנס ברקמה תת-עורית. הניסוי כולל השתלת מכשירים נגועים בקנדידה באזור הגב של החיה לצורך פיתוח ביופילם.

קנדידה אלביקנס היווצרות ביופילם במודל עכבר In Vivo

in vivo אינטראקציות מרחביות-זמניות של פתוגן והגנות חיסוניות ברמת הרירית אינן ניתנות להדמיה בקלות במארחים קיימים של בעלי חוליות. השיטה המוצגת כאן מתארת פלטפורמה רב-תכליתית לחקר קנדידה רירית בבעלי חוליות חיים תוך שימוש בכיס השחייה של דג הזברה הצעיר כאתר זיהום.

דוגמנות רירית פטרת בזחל דג הזברה על ידי הזרקת Swimbladder

אנו מציגים הליך ניסיוני של התפתחות ביופילם של קנדידה אלביקנס במודל תת עורי של עכבר. ביופילמים פטרייתיים כומתו על ידי קביעת מספר היחידות היוצרות מושבה ועל ידי הדמיית ביולומינסנציה לא פולשנית, כאשר כמות האור המופקת תואמת את מספר התאים הקיימאים.

קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

Mellonella גלריה (galleria) משמש מודל הגעה עבור המופץ קנדידה. כאן, אנחנו מפרטים את הזיהום פרוטוקול ולספק נתונים התומכים לאפקטיביות של הדגם.

לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש את הצורה של קנדידה אלביקנס תא ולוקליזציה במערכת העיכול היונקים.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

כתב יד זה מתאר שיטה לסינון ספריות מוטנטיות בגודל בינוני של קנדידה אלביקנס עבור פנוטיפים של מורפוגנזה במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

זיהום מפרק פריפרוסתטי (PJI) הנגרם על ידי פתוגנים מסוכנים נפוץ באורתופדיה קלינית. מודלים קיימים של בעלי חיים אינם יכולים לדמות במדויק את המצב האמיתי של PJI. כאן, הקמנו מודל עכבר PJI הקשור לביופילם קנדידה אלביקנס כדי לחקור ולפתח טיפולים חדשים עבור PJI.

מודל זיהום במפרק פריפרוסתי קנדידה אלביקנס בעכבר

אנו מבססים מודל עכברי של זיהום הקשור לצנתר C.albicans (CRI), שבו נוצר ביופילם על הצנתר, והאינטראקציה בין C.albicans למארח מתואמת היטב עם CRI הקליני. מודל זה מסייע לסנן טיפולים עבור CRI הקשור לביופילם של C.albicans , ומניח בסיס לשינוי קליני.

מודל זיהום קנדידה אלביקנס הקשור לצנתר בעכבר

פרוטוקול זה מתאר את היישום של טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) במודל מורין של קנדידה אוראלית. aPDT בוצע באמצעות תערובת מסיסה במים של כורכומינואידים ואור LED כחול.

טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי בתיווך כורכומינואיד על מודל מורין של קנדידאזיס פומי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל עכבר המשתמש בהשתלת גב תת עורית כדי לחקור זיהומים הקשורים לשתל, המאפשר חקירה מקיפה של מנגנונים פתופיזיולוגיים ותומך בפיתוח קריטריונים אבחנתיים עם אסטרטגיות טיפוליות ממוקדות.

מודל בעלי חיים של זיהומים הקשורים לשתלים בעכברים

למדו שיטת הזרקה עמוקה עורית של Candida albicans לניתוח היסטולוגי של דלקת עור. הטכניקה שומרת על מבנה העור ומאפשרת זיהוי מיקום תאים חיסוניים במהלך זיהום פטרייתי.

עמוק עורי הזרקת כמו מודל של קנדידה אלביקנס דלקת עור עבור ניתוחים היסטולוגית

גלה סרטונים נוספים