Name: הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: למד שיטה מהירה להעברת פלסמידי DNA לאפיתל שלפוחית השתן בעכברים באמצעות קטטריזציה ואלקטרופורציה. שיטה זו מאפשרת יצירת מודלים אוטוכתוניים לחקר סרטן שלפוחית השתן וטיפול גני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים חן סל פרופסור דוקטור יואה ג'אנג, Kendy הואנג לקבלת עזרה בהתקנת מערכת אלקטרופורציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן סנטה קרוז סרטן לטובת קבוצה NIH Z.A.W.

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו בהתאם הנחיות והתקנות מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז.
1. פלסמיד והכנת כלים
<ol><li>עבור כל שלפוחית השתן transfect, להכין µL לפחות עשרים של הדנ א פלסמיד (µg 1/µL).</li>
	<li>להוסיף 1 µL של Trypan Blue µL 20 של פתרון פלסמיד צינור microcentrifuge 1.5 mL. פיפטה לערבב היטב.</li>
	<li>אוטוקלב כירורגי כל כלים ולחטא את סביבת העבודה עם 70% אתנול. לרסס סטריליים, כפפות עם אתנול 70% בתדירות גבוהה או להשתמש מעקר חרוז זכוכית בעת ביצוע השלבים הבאים כדי לשמור על תנאים סטריליים.</li>
</ol>2. anaesthetizing בעלי חיים
<ol><li>השתמש מערכת הרדמה בראש הטבלה כדי עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין. להפעיל את הטנק2 O ולהתאים את זרימה חמצן כדי 1 ליטר/דקה.</li>
	<li>המקום העכבר C57BL/6J הנשי למבוגרים בבית הבליעה אינדוקציה. הפעל והתאם את מאדה איזופלוריין 3% עבור אינדוקציה. העכבר צריך להיות בהרדמה תוך 2 דק מנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously על ההסרה של העכבר מן החדר אינדוקציה על שיכוך כאבים מונעת. הערה: פרוטוקול זה, נקבה עכברים משמשים, כפי שהם יותר קל לעבוד עם במהלך צנתור השופכה. הפרוטוקול פועל גם על עכברים זכר, אך נדרש לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע שלב 3.</li>
	<li>משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים של החיה למניעת יובש. הנח את העכבר anaesthetized פונה כלפי מעלה על משטח חימום עם האף שלה בקונוס האף. תלחץ על המתג מעגל אוויר כדי לאפשר איזופלוריין לעבור את חרוט האף.</li>
	<li>לרסן את הראש והחרוט האף עם דבק. התאם את מאדה איזופלוריין ל-2% לצורך תחזוקה.</li>
	<li>לרסן את הגפיים עם דבק. לבצע הבוהן-קמצוץ בדיקות כדי לוודא החיה בהרדמה עמוקה, ואז מגלחים את אזור הבטן.</li>
</ol>3. שתן דלדול ושטיפה שלפוחית השתן
<ol><li>חלות סיכה הקטטר (G 24, אורך של 2.11 ס"מ, הקוטר החיצוני של ס"מ 0.045) ולהבטיח כי השטח החיצוני שלה מכוסה.</li>
	<li>הכנס את הצנתר לתוך הפתח השופכה, לאט לדחוף אותו עד שהוא מגיע שלפוחית השתן, ובו בזמן השתן צריך לזרום החוצה דרך הקטטר. לחץ בעדינות את הבטן כדי לסייע דלדול שתן.<ol>
<li>בדוק אם הצנתר הוכנס לתוך שלפוחית השתן על ידי התבוננות שתן אוטומטיים יותר זורם. להימנע פירסינג הקיר שופכה ושלפוחית ולהחיל סיכה מספר פעמים במידת הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחוק את השתן עם פיפטה לתוך גביע פסולת.</li>
	<li>פיפטה µL 80 תמיסת פוספט buffered (PBS) אל הקצה החיצוני של הקטטר, בקצהו השני עדיין בשלפוחית. בזהירות לצרף מזרק 1 מ"ל הצנתר. דחף בעדינות את המזרק כדי להזריק את החינוכית לתוך שלפוחית השתן. להשאיר קצת PBS הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.</li>
	<li>הסר את המזרק. המתן PBS לנקז החוצה שלפוחית השתן. לחץ בעדינות את הבטן לפנות PBS.</li>
	<li>למחוק את PBS הקטטר עם פיפטה לתוך כשהספל פסולת.</li>
	<li>חזור על PBS שטיפה (שלבים 3.4-3.6) עוד פעמיים. הערה: זה חיוני כדי לעבוד בעדינות במהלך השלבים כביסה. דם קטטר או כשל אוטומטי מחוץ זרימה של נוזל בדרך כלל מצביע על השופכה היא חדרה מבעד. חשוב גם להימנע היכרות עם בועות אוויר, כפי שהם יקטין את היעילות אלקטרופורציה.</li>
</ol>4. פלסמיד משלוח
<ol><li>להחיל 70% אתנול בבטן בעכבר ולהשתמש אזמל לעשות חתך אנכי של 1 ס מ כדי לפתוח את העור בבטן מעל שלפוחית השתן.</li>
	<li>פיפטה µL לפחות עשרים של פלסמיד בתוספת Trypan Blue פתרון אל הקצה החיצוני של הקטטר, ולצרף את המזרק.</li>
	<li>להזריק את הפתרון פלסמיד לתוך שלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופך לכחול, הזריקה הוא מוצלח. יוצאים נוזל הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.</li>
	<li>. תפוס את פתח השופכה חיצוני באמצעות פינצטה ולאחר מכן הסר את הקטטר ואת המזרק. להשתמש במחרוזת כדי להדק את פתח השופכה חיצוניים. להפוך את שתי לולאות עם המחרוזת, ואז לקשור עם שני קשרים. הערה: הידוק של השופכה חשוב למניעת זרם אחורי של נוזל פלסמיד.</li>
	<li>להפעיל את הגנרטור אלקטרופורציה עם הפרמטרים הבאים: 33V, 50 מילישניות זמן עבודה, ו- 950 ms מרווח הזמן.</li>
	<li>להחזיק את השלפוחית עם פינצטה וצבטתי את השלפוחית עם שתי אלקטרודות. ללחוץ על דוושת רגל כדי לבצע את אלקטרופורציה. הערה: פולסים חשמליים מוגדרים יכולה להופיע 5 פעמים עם מרווחי זמן קצר לאחר כל דחיפה פדלים. העכבר עשוי להתעוות בתהליך זה. לוחץ על דוושת רגל יותר מפעם אחת יכול להגביר את היעילות המסירה, אך פולסים חשמליים רבים מדי עלולה לגרום נזק על urothelium שלמות רקמות.<ol>
<li>הימנע מכל מגע בין את הפינצטה האלקטרודות, כמו פעולה זו תיצור ניצוץ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. השבת
<ol><li>תפר פתיחת בטן, עור עם תפירה סטריליים, אטבים. החל יוד לתוך הפצע.</li>
	<li>הסר את החיה המערכת איזופלוריין. לנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously כדי להקל על הכאב לאחר ניתוח.</li>
	<li>לשמור את החיה על כרית חימום ולהחזיר אותה לכלוב הביתה לאחר החלמה מלאה. בדוק את החיה לפחות פעם ביום לניידות נורמלי, השתייה והאכלת התנהגויות, אין סימנים לזיהום עד החתך נרפאה ולאחר מכן הסר את הקליפים. לנהל זריקות עוקבות של הבופרנורפין שיכוך כאב אם החיה מציגה סימפטום כאב כגון מופחתת לטפח, גדל תוקפנות, והניקוד.</li>
</ol>

<ol><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li>
<li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li>
<li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li>
<li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li>
<li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Gynecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li>
<li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883(2008).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום עניין מתחרות.

אלקטרופורציה משפר את חדירות קרום התא, טכנולוגיה רבת עוצמה עבור ג'ין electrotransfer16. המסירה הגן לתוך החיים מכרסמים מאת אלקטרופורציה שימש לעתים קרובות נוירוביולוגיה שדות17,18,19,20,21. שלה יישומים אפשריים באיברים רבים אחרים לא נחקרו בהרחבה. הידע שלנו, שלנו בשיטה המתוארת כאן היא לדו ח המסירה הגן בהצלחה על ידי אלקטרופורציה urothelium שלפ...

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יש משחק תפקיד חיוני בהרחבת הידע שלנו על בעלי חיים, ג'ין פונקציות ויווופיתוח מנגנוני המחלה התקדמות1,2. Germline GEMMs מפותחים באופן מסורתי בשתי דרכים. הראשונה היא היצירה של העכברים הטרנסגניים בזריקה pronuclear של הדנ א פלסמיד ואחריו את השתלת של מופרות לתוך נקבות pseudopregnant. השני הוא הדור של עכברים טוק-אאוט/טוק-in על-ידי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים לבין התפתחות כימרות. נוקאאוט מותנה של גנים ספציפיים ברקמות או תא סוג עניין כרוך הרבייה של אללים מהונדסים עם Cre ואתרים flox דורות מרובים. כל התהליך יכול להיות יקר ולא זמן רב, במיוחד אם המטרה היא היעד גנים מרובים רקמות-במיוחד. לאחרונה, עריכת ג'ין טכנולוגיות כגון באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) הוחלו על מספר איברים של העכברים לזירוז רקמות ספציפיות שינויים גנטיים לסרטן autochthonous מידול3, 4,5,6,7 או מוטציות המחלה הנכונה בחיי עיר8,9. במחקרים אלה, המסירה של הווקטורים gRNA הושג בדרך כלל דרך זיהום adenoviral או lentiviral של האיבר או הזרקת וריד הזנב hydrodynamic. הקלות היחסית משלוח של הרכיבים CRISPR ריאות ולכבד השתפרה במידה את הנוחות והיעילות של סרטן מידול באיברים אלה לעומת הדגמים העכבר Cre-לקס המבוסס מסורתית.
Urothelium שלפוחית השתן היא איפה שמקורן רוב גידולים בשלפוחית השתן. המשלוח של ה-DNA וקטורים שלפוחית השתן urothelium לטיפול דוגמנות או ג'ין סרטן היא הקשו על ידי שכבה גליקוזאמינוגליקן על פני השטח urothelial הפסגה, אשר משמש כמחסום ב"זכות של הווירוסים זיהומיות10,11. מספר סוכנים pretreatment כגון Syn3 ו- dodecyl-β-d-maltoside שימשו כדי לשבש את מחסום זה ולשפר אדנו זיהום יעילות12,13,14. אם adeno-הקשורים וירוסים (AAVs) יכול להדביק ביעילות שלפוחית השתן לא דווחה. בסך הכל, שיטת משלוח מבוסס נגיפי יהיה רצוי. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדה למסירה יעיל דנ א פלסמיד urothelium העכבר דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. כי הגישה שלנו אינו כרוך רעלני כימי של השכבה גליקוזאמינוגליקן או וירוס הייצור, שזה משמעותי מפשט את המסירה של ה-DNA פלסמידים לתוך urothelium שלפוחית השתן העכבר, צריך להקל על מחקרים שונים אין ויוו מחלות שלפוחית השתן.

<table><tbody><tr><td>מזרק שחפת BD 1 מ"ל</td><td>פישר</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין</td><td>סיגמא</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה דומונט</td><td>רובוז כירורגי Instr</td><td>RS-5005</td><td>לטפל ב-70% אתנול לפני שימוש כירורגי</td></tr><tr><td>ECM830 SQ גל אלקטרופורטור</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Safelet IV צנתרים</td><td>פישר Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24 גרם, אורך 2.11 ס"מ, קוטר חיצוני 0.045 ס"מ מספריים</td></tr><tr><td>מיקרו חיתוך עדינים במיוחד</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>לטפל ב-70% אתנול לפני השימוש הכירורגי</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet One</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K& מחצלת מנוחה מחוממת H לבעלי חיים קטנים, 9 על 12 אינץ'</td><td>אמזון</td><td>n/a</td><td>מכסים את מחצלת החום במגבות נייר</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>פישר</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפט 200 ומיקרו; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטים, התאמה אוניברסלית; 0.1 עד 10 ומיקרו; L</td><td>פישר</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>גילסון</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>גילסון</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה פלטינה 5 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>450489</td><td>5 מ"מ קוטר</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>לטפל עם 70% אתנול לפני שימוש כירורגי</td></tr><tr><td>חוט מחרוזת</td><td>אמזון</td><td>n/a</td><td>מנדלה מלאכת יד 150D 210D 0.8 מ"מ תפירת עור 1 מ"מ חוט חוט שעווה שטוח</td></tr><tr><td>חוט חוט קלטת, סקוטש</td><td>פישר</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel חומר סיכה וטרינרי</td><td>PBS בריאות בעלי חיים</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 שולחן מערכת הרדמה</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>תפר סגול ויקריל 18 אינץ' FS-2 חיתוך 5-0</td><td>פישר</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone יוד 10%</td> <td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>קליפ פצע</td><td>פישר</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>קליפ פצע מכשיר פישר</td><td></td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יקרים מאוד בגילוי הרומן ביולוגי תובנות החניכה, התקדמות מנגנוני מחלות אנושיות כגון סרטן. העכברים הטרנסגניים, מותנה נוקאאוט שימשו לעיתים קרובות ביטוי גנים או אבלציה רקמות ספציפיות או תא סוגי בתוך vivo. עם זאת, יצירת מודלים העכבר germline יכול להיות זמן רב ויקרות. הפיתוחים האחרונים בתחום הגן עריכה טכנולוגיות ואת הכדאיות של אספקת פלסמידים DNA על ידי זיהום ויראלי אפשרו דור מהירה של הלא-germline autochthonous העכבר סרטן מודלים עבור מספר איברים. שלפוחית השתן הוא איבר זה היה קשה עבור וקטורים ויראלית לגשת, בשל נוכחותם של שכבה גליקוזאמינוגליקן המכסים את urothelium. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדת לאספקה יעילה של ה-DNA פלסמידים לתוך העכבר שלפוחית השתן urothelium vivo בתוך. דרך intravesical החדרה של pCAG-GFP דנ א פלסמיד אלקטרופורציה השלפוחית בניתוח חשוף, אנו מראים כי פלסמיד דנ א יכולה להיות מועברת במיוחד לתוך התאים urothelial שלפוחית השתן לביטוי ארעית. השיטה שלנו מספק דרך נוחה ומהירה ביטוי נוקאאוט של גנים בשלפוחית עכבר, ניתן להחיל על בניין GEMMs של סרטן שלפוחית השתן ומחלות אורולוגיים אחרים.

כדי להדגים את ההצלחה של המסירה הגן לתוך urothelium שלפוחית השתן, השתמשנו על פלסמיד15 pCAG-GFP עבור אלקטרופורציה. 20 µL של פלסמיד Trypan Blue פתרון הוזרק דרך השופכה, נוהלו 5 פולסים חשמליים. לאחר 48 שעות, אנחנו גזור העכבר שלפוחית השתן ולא נצפתה כתמים של קרינה פלואורסצנטית GFP תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות לנתיחה, ואילו שלילי לשלוט בשלפוחית השתן לא עברה אלקטרופורציה הראה שום אות GFP (איור 1 א'). כאשר ביצענו immunofluorescence מכתים של שלפוחית...

אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעביר פלסמידים של DNA לאורותליום שלפוחית השתן של עכברים חיים in vivo לצורך ביטוי יתר של גנים או עריכת גנום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן שלפוחית השתן, כגון כיצד מוטציות גנטיות שונות מקדמות את התקדמות סרטן שלפוחית השתן? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת דרך מהירה ונוחה להעברת גנים לשלפוחית השתן ללא חששות הבטיחות והמחסומים הטכניים הקשורים לווקטורים ויראליים.לראשונה עלה לי הרעיון לשיטה הזו לנסות להשתמש בכל וירוס מהונדס הקשור להעברת DNA, מה שלא עבד טוב בשלפוחית השתן. ההשלכה של טכניקה זו יכולה להתרחב גם לכיוון ריפוי גנטי מכיוון שאלקטרופופורציה יכולה להשיג אספקה יעילה של פלסמידים של DNA לתאי השתן. ידגימו את ההליך אופיר סטפנסון ויואליו ליו מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע חיטוי של כל המכשירים הכירורגיים ולעקר את סביבת העבודה עם אתנול 70%. ריססו מכשירים כירורגיים ואת הכפפות עם אתנול של 70% לעתים קרובות בעת ביצוע ההליכים הבאים כדי לשמור על תנאים סטריליים. כדי להתחיל, יש להרדים את העכבר ולגלח את אזור הניתוח.כדי לרוקן את השתן, יש למרוח חומר סיכה על הקטטר ולוודא שהמשטח החיצוני שלו מכוסה במלואו. לאחר מכן, הכנס את הקטטר לפתח השופכה של העכבר ודחף אותו באיטיות עד שהוא מגיע לשלפוחית השתן. לחץ בעדינות על הבטן כדי לסייע לדלדול השתן.לאחר מכן, השליכו את השתן עם פיפטה לכוס פסולת, ואז פיפטה 80 מיקרוליטר PBS לקצה החיצוני של הקטטר כשהקצה השני עדיין בשלפוחית השתן. לאחר מכן, חבר בזהירות מזרק מילימטר אחד לקטטר. דחפו בעדינות את המזרק כדי להזריק PBS לשלפוחית השתן.השאירו מעט PBS בצנתר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בשלפוחית השתן. לאחר מכן, הסר את המזרק והמתן עד ש-PBS יתנקז משלפוחית השתן. לחץ בעדינות על הבטן כדי לפנות PBS, ולאחר מכן השליך את ה-PBS בצנתר עם פיפטה לתוך הפסולת.חזור על שטיפת PBS פעמיים נוספות. כדי שכל שלפוחית השתן תעבור, הכינו לפחות 20 מיקרוליטר של פלסמיד DNA במיקרוגרם אחד למיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של טריפאן כחול ל-20 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד וצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ופיפטה כדי לערבב היטב.כדי לספק את הפלסמיד, יש למרוח 70% אתנול על הבטן. בצע חתך אנכי של סנטימטר אחד כדי לפתוח את עור הבטן מעל שלפוחית השתן. לאחר מכן, חתוך את שכבת השריר כדי לחשוף את שלפוחית השתן.פיפטה לפחות 20 מיקרוליטר פלסמיד בתוספת תמיסת טריפן כחולה לקצה החיצוני של הקטטר ונתקה אותו למזרק. לאחר מכן, הזריק את תמיסת הפלסמיד לשלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופכת לכחולה, ההזרקה מצליחה.השאירו מעט נוזל בקטטר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בשלפוחית השתן. לאחר מכן, תפוס את פתח השופכה החיצוני והסר את הקטטר והמזרק. השתמש בחוט כדי להדק את פתח השופכה החיצוני.צרו שתי לולאות עם החוט ואז קשרו עם שני קשרים. זהו צעד מכריע הדורש שיתוף פעולה בין שני אנשים. ודא שהקשרים הדוקים כדי שהפלסמידים לא ידלפו החוצה.כעת, הפעל את מחולל האלקטרופורציה. צבטו את שלפוחית השתן בשתי אלקטרודות ולחצו על דוושת כף הרגל כדי לבצע אלקטרופורציה. כדי לשמור על שלפוחית השתן נתמכת ניתן לצבוט את החלק האחורי של חתך הבטן בעזרת פינצטה.הימנע מכל מגע בין פינצטה לאלקטרודות מכיוון שהדבר עלול ליצור ניצוץ. בסיום, תפר את פתח הבטן והעור בתפר סטרילי כירורגי. הסר את החוט והחל קליפים.מרחו יוד על הפצע ואז הסירו את החיה ממערכת האיזופלורן. יש לתת משכך כאבים בופרנורפין תת עורי כדי להקל על כאבים לאחר ניתוח. שמור את החיה על כרית החימום והחזיר אותה לכלוב הביתי לאחר החלמה מלאה.בדוק את בעל החיים לפחות פעם ביום לניידות תקינה, התנהגויות שתייה והאכלה, וללא סימני זיהום עד להחלמת החתך. ואז, שבוע לאחר מכן, הסר את הקליפים. תן זריקות עוקבות של משכך כאבים בופרנורפין אם החיה מציגה תסמיני כאב כגון טיפוח מופחת, אגרסיביות מוגברת וקולות.כדי להדגים העברת גנים מוצלחת לאורותליום שלפוחית השתן, הוזרקו 20 מיקרוליטר של פלסמיד pCAG-GFP ותמיסה כחולה טריפאן דרך השופכה וניתנו חמישה פולסים חשמליים. מוצגת כאן האלקטרופורציה המוצלחת שהפכה את שלפוחית השתן לירוקה לאחר 48 שעות, בעוד ששלפוחית בקרה שלילית שלא עברה אלקטרופורציה לא הראתה אות GFP. צביעה אימונו-פלואורסצנטית של רקמות שלפוחית השתן החתוכות בוצעה עם נוגדנים CK5, CK18 ו-GFP.אות GFP נצפה נוכח בתאי מטריה, ביניים ובסיס, אך לא בשכבת השריר המצביע על ספציפיות טובה של אספקת פלסמיד לאורותליום. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום סרטן שלפוחית השתן לבנות מודלים חדשים של עכברים אוטוכטוניים לחקר מנגנוני התקדמות המחלה.

novel-method-plasmid-dna-delivery-to-mouse-bladder-urothelium

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

בסרטון זה, אנו מתארים הליך מבוסס קטטר לריקון ושטיפה של שלפוחית השתן של מודל עכבר. לאחר מכן ניתן להשתמש בעכבר המוכן להליכים ניסיוניים נוספים.

דלדול שתן ושטיפת שלפוחית השתן בעכבר מודל: הליך מבוסס קטטר לריקון ושטיפת שלפוחית השתן

סרטון זה מדגים את העברת פלסמיד DNA לתוך השתן של שלפוחית השתן של העכבר באמצעות שילוב של טכניקות צנתור שופכה ואלקטרופורציה. ההליך המתואר מאפשר יצירת מודלים של סרטן שלפוחית השתן של עכבר.

העברת פלסמידים של DNA לתוך אורותל של שלפוחית השתן של עכבר: הליך מבוסס אלקטרופורציה כדי להעביר ביעילות פלסמידים DNA לתוך תאי השתן של שלפוחית השתן כדי ליצור מודלים מהונדסים גנטית

סרטון זה מדגים את העברת הדנ"א של פלסמיד לתאי עצב צרבלריים של עוברי מורין באמצעות אלקטרופורציה ברחם. שיטה זו שימושית כדי להשיג הבנה של תפקוד in vivo של גנים בהתפתחות מוחית תקינה והשינויים בביטוי גנים של תאי נוירון במהלך התקדמות הגידול.

In utero Electroporation Based Gene Delivery: טכניקה להזרקת DNA פלסמיד לתאי המוח הקטן העובריים של עוברי מורין

סרטון זה מדגים את טכניקת האלקטרופורציה המציגה DNA פלסמיד מקודד חלבון פלואורסצנטי למבשרי תאי גרגיר המוח הקטן הראשוניים של עכבר.

Electroporation-Mediated in Vitro Gene Delivery: טכניקת פולס חשמלי להחדרת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטיים לתאים בתרבית

השתלה של תאים סרטניים לתוך האיבר ממוצא יכולה לשמש מודל פרה שימושי כדי להעריך את הטיפולים חדשניים. ניתן לגדל תאי קרצינומה של שלפוחית ​​השתן MB49 בתוך שלפוחית ​​השתן בעקבות החדרת שלפוחית. פרוטוקול זה מדגים צנתור של שלפוחית ​​השתן בעכבר לצורך השתלת גידול ואספקת adenoviral.

סרטן שלפוחית ​​השתן לדגם orthotopic ג&#39;ין משלוח לימודים

מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייצור והאפיון של אורגנואידים אורותליאליים של עכברים, תוך מחיקות בגנים בעלי עניין. השיטות כוללות קצירת תאי אורותל של עכבר, התמרת ex vivo עם אדנו-וירוס המניע את ביטוי Cre עם מקדם CMV, ואפיון in vitro כמו גם in vivo .

אקס ויוו מודל אורגנואידי של מחיקות גנים בתיווך אדנו-וירוס-Cre בתאי אורותל של עכבר

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמידי לתוך שרירי השלד היא שיטה בת קיימא לווסת ביטוי גנים מבלי להתפשר על התכווצות השרירים בעכברים.

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

המאמר מציג שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לאלקטרופורציה של סידן דרך השופכה באמצעות אלקטרודה אנדוסקופית חדשה התואמת לציוד אורולוגי סטנדרטי. המחקר מהווה התקדמות משמעותית לקראת יישום אלקטרופורציה דרך השופכה וסולל את הדרך להרחבת הטיפול החדשני והמינימלי פולשני בגידולי שתן.

אינטגרציה של אלקטרופורציה בפרקטיקה אורולוגית: תכנון והערכה של אלקטרודה טרנס-שופכה חדשה

למד שיטה מהירה להעברת פלסמידי DNA לאפיתל שלפוחית השתן בעכברים באמצעות קטטריזציה ואלקטרופורציה. שיטה זו מאפשרת יצירת מודלים אוטוכתוניים לחקר סרטן שלפוחית השתן וטיפול גני.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

גלה סרטונים נוספים