הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה
May 3rd, 2018
אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעביר פלסמידים של DNA לאורותליום שלפוחית השתן של עכברים חיים in vivo לצורך ביטוי יתר של גנים או עריכת גנום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן שלפוחית השתן, כגון כיצד מוטציות גנטיות שונות מקדמות את התקדמות סרטן שלפוחית השתן? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת דרך מהירה ונוחה להעברת גנים לשלפוחית השתן ללא חששות הבטיחות והמחסומים הטכניים הקשורים לווקטורים ויראליים.
לראשונה עלה לי הרעיון לשיטה הזו לנסות להשתמש בכל וירוס מהונדס הקשור להעברת DNA, מה שלא עבד טוב בשלפוחית השתן. ההשלכה של טכניקה זו יכולה להתרחב גם לכיוון ריפוי גנטי מכיוון שאלקטרופופורציה יכולה להשיג אספקה יעילה של פלסמידים של DNA לתאי השתן. ידגימו את ההליך אופיר סטפנסון ויואליו ליו מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע חיטוי של כל המכשירים הכירורגיים ולעקר את סביבת העבודה עם אתנול 70%. ריססו מכשירים כירורגיים ואת הכפפות עם אתנול של 70% לעתים קרובות בעת ביצוע ההליכים הבאים כדי לשמור על תנאים סטריליים. כדי להתחיל, יש להרדים את העכבר ולגלח את אזור הניתוח.
כדי לרוקן את השתן, יש למרוח חומר סיכה על הקטטר ולוודא שהמשטח החיצוני שלו מכוסה במלואו. לאחר מכן, הכנס את הקטטר לפתח השופכה של העכבר ודחף אותו באיטיות עד שהוא מגיע לשלפוחית השתן. לחץ בעדינות על הבטן כדי לסייע לדלדול השתן.
לאחר מכן, השליכו את השתן עם פיפטה לכוס פסולת, ואז פיפטה 80 מיקרוליטר PBS לקצה החיצוני של הקטטר כשהקצה השני עדיין בשלפוחית השתן. לאחר מכן, חבר בזהירות מזרק מילימטר אחד לקטטר. דחפו בעדינות את המזרק כדי להזריק PBS לשלפוחית השתן.
השאירו מעט PBS בצנתר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בשלפוחית השתן. לאחר מכן, הסר את המזרק והמתן עד ש-PBS יתנקז משלפוחית השתן. לחץ בעדינות על הבטן כדי לפנות PBS, ולאחר מכן השליך את ה-PBS בצנתר עם פיפטה לתוך הפסולת.
חזור על שטיפת PBS פעמיים נוספות. כדי שכל שלפוחית השתן תעבור, הכינו לפחות 20 מיקרוליטר של פלסמיד DNA במיקרוגרם אחד למיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של טריפאן כחול ל-20 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד וצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ופיפטה כדי לערבב היטב.
כדי לספק את הפלסמיד, יש למרוח 70% אתנול על הבטן. בצע חתך אנכי של סנטימטר אחד כדי לפתוח את עור הבטן מעל שלפוחית השתן. לאחר מכן, חתוך את שכבת השריר כדי לחשוף את שלפוחית השתן.
פיפטה לפחות 20 מיקרוליטר פלסמיד בתוספת תמיסת טריפן כחולה לקצה החיצוני של הקטטר ונתקה אותו למזרק. לאחר מכן, הזריק את תמיסת הפלסמיד לשלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופכת לכחולה, ההזרקה מצליחה.
השאירו מעט נוזל בקטטר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בשלפוחית השתן. לאחר מכן, תפוס את פתח השופכה החיצוני והסר את הקטטר והמזרק. השתמש בחוט כדי להדק את פתח השופכה החיצוני.
צרו שתי לולאות עם החוט ואז קשרו עם שני קשרים. זהו צעד מכריע הדורש שיתוף פעולה בין שני אנשים. ודא שהקשרים הדוקים כדי שהפלסמידים לא ידלפו החוצה.
כעת, הפעל את מחולל האלקטרופורציה. צבטו את שלפוחית השתן בשתי אלקטרודות ולחצו על דוושת כף הרגל כדי לבצע אלקטרופורציה. כדי לשמור על שלפוחית השתן נתמכת ניתן לצבוט את החלק האחורי של חתך הבטן בעזרת פינצטה.
הימנע מכל מגע בין פינצטה לאלקטרודות מכיוון שהדבר עלול ליצור ניצוץ. בסיום, תפר את פתח הבטן והעור בתפר סטרילי כירורגי. הסר את החוט והחל קליפים.
מרחו יוד על הפצע ואז הסירו את החיה ממערכת האיזופלורן. יש לתת משכך כאבים בופרנורפין תת עורי כדי להקל על כאבים לאחר ניתוח. שמור את החיה על כרית החימום והחזיר אותה לכלוב הביתי לאחר החלמה מלאה.
בדוק את בעל החיים לפחות פעם ביום לניידות תקינה, התנהגויות שתייה והאכלה, וללא סימני זיהום עד להחלמת החתך. ואז, שבוע לאחר מכן, הסר את הקליפים. תן זריקות עוקבות של משכך כאבים בופרנורפין אם החיה מציגה תסמיני כאב כגון טיפוח מופחת, אגרסיביות מוגברת וקולות.
כדי להדגים העברת גנים מוצלחת לאורותליום שלפוחית השתן, הוזרקו 20 מיקרוליטר של פלסמיד pCAG-GFP ותמיסה כחולה טריפאן דרך השופכה וניתנו חמישה פולסים חשמליים. מוצגת כאן האלקטרופורציה המוצלחת שהפכה את שלפוחית השתן לירוקה לאחר 48 שעות, בעוד ששלפוחית בקרה שלילית שלא עברה אלקטרופורציה לא הראתה אות GFP. צביעה אימונו-פלואורסצנטית של רקמות שלפוחית השתן החתוכות בוצעה עם נוגדנים CK5, CK18 ו-GFP.
אות GFP נצפה נוכח בתאי מטריה, ביניים ובסיס, אך לא בשכבת השריר המצביע על ספציפיות טובה של אספקת פלסמיד לאורותליום. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום סרטן שלפוחית השתן לבנות מודלים חדשים של עכברים אוטוכטוניים לחקר מנגנוני התקדמות המחלה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר שיטה חדשה להעברת פלסמידים של DNA לתאים אורתליים של שלפוחית השתן של עכבר ב-vivo דרך צנרור שלפוחית השתן ואלקטרופורציה. טכניקה זו מספקת דרך מהירה ונוחה ליצירת מודלים עכבריים מקוריים של מחלות שלפוחית השתן.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- טיפול גנטי
- מחקר סרטן שלפוחית השתן
- טכניקות אלקטרופורציה
רקע
- השיטה נועדה להעביר פלסמידים של DNA לאורוטליום של שלפוחית השתן של עכברים חיים.
- היא מתייחסת לשאלות מרכזיות בהתקדמות סרטן השלפוחית.
- ווקטורים ויראליים מסורתיים מעוררים חששות בטיחות ומחסומים טכניים.
- שיטה זו מציעה חלופה להעברת גנים.
מטרת המחקר
- להקל על הבעת יתר של גנים או עריכת גנום בתאי שלפוחית השתן.
- לחקור את ההשפעות של מוטציות גנטיות על סרטן שלפוחית השתן.
- לשפר את היעילות של שיטות העברת DNA.
שיטות ששימשו
- צנרור שלפוחית השתן להעברת פלסמידים.
- אלקטרופורציה להעצמת ספיגת DNA.
- יישום in vivo במודלים של עכברים.
- הדגמה על ידי אופיר סטפנסון ויולי ליאו.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של פלסמידים של DNA לתאים אורתליים.
- שיטה מהירה ויעילה בהשוואה לוקטורים ויראליים.
- יישומים פוטנציאליים בטיפול גנטי ובמחקר סרטני.
- הוכחת היתכנות במודלים חיים של עכברים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חדשנית להעברת גנים לשלפוחית השתן.
- יש לה השלכות על חקר מחלות שלפוחית השתן וסרטן.
- מחקר נוסף עשוי להרחיב את יישומי השיטה בטיפול גנטי.
