הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה
3 במאי 2018
אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להעביר פלסמידים של DNA לאורותליום שלפוחית השתן של עכברים חיים in vivo לצורך ביטוי יתר של גנים או עריכת גנום. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן שלפוחית השתן, כגון כיצד מוטציות גנטיות שונות מקדמות את התקדמות סרטן שלפוחית השתן? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת דרך מהירה ונוחה להעברת גנים לשלפוחית השתן ללא חששות הבטיחות והמחסומים הטכניים הקשורים לווקטורים ויראליים.
לראשונה עלה לי הרעיון לשיטה הזו לנסות להשתמש בכל וירוס מהונדס הקשור להעברת DNA, מה שלא עבד טוב בשלפוחית השתן. ההשלכה של טכניקה זו יכולה להתרחב גם לכיוון ריפוי גנטי מכיוון שאלקטרופופורציה יכולה להשיג אספקה יעילה של פלסמידים של DNA לתאי השתן. ידגימו את ההליך אופיר סטפנסון ויואליו ליו מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע חיטוי של כל המכשירים הכירורגיים ולעקר את סביבת העבודה עם אתנול 70%. ריססו מכשירים כירורגיים ואת הכפפות עם אתנול של 70% לעתים קרובות בעת ביצוע ההליכים הבאים כדי לשמור על תנאים סטריליים. כדי להתחיל, יש להרדים את העכבר ולגלח את אזור הניתוח.
כדי לרוקן את השתן, יש למרוח חומר סיכה על הקטטר ולוודא שהמשטח החיצוני שלו מכוסה במלואו. לאחר מכן, הכנס את הקטטר לפתח השופכה של העכבר ודחף אותו באיטיות עד שהוא מגיע לשלפוחית השתן. לחץ בעדינות על הבטן כדי לסייע לדלדול השתן.
לאחר מכן, השליכו את השתן עם פיפטה לכוס פסולת, ואז פיפטה 80 מיקרוליטר PBS לקצה החיצוני של הקטטר כשהקצה השני עדיין בשלפוחית השתן. לאחר מכן, חבר בזהירות מזרק מילימטר אחד לקטטר. דחפו בעדינות את המזרק כדי להזריק PBS לשלפוחית השתן.
השאירו מעט PBS בצנתר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בשלפוחית השתן. לאחר מכן, הסר את המזרק והמתן עד ש-PBS יתנקז משלפוחית השתן. לחץ בעדינות על הבטן כדי לפנות PBS, ולאחר מכן השליך את ה-PBS בצנתר עם פיפטה לתוך הפסולת.
חזור על שטיפת PBS פעמיים נוספות. כדי שכל שלפוחית השתן תעבור, הכינו לפחות 20 מיקרוליטר של פלסמיד DNA במיקרוגרם אחד למיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של טריפאן כחול ל-20 מיקרוליטר של תמיסת פלסמיד וצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ופיפטה כדי לערבב היטב.
כדי לספק את הפלסמיד, יש למרוח 70% אתנול על הבטן. בצע חתך אנכי של סנטימטר אחד כדי לפתוח את עור הבטן מעל שלפוחית השתן. לאחר מכן, חתוך את שכבת השריר כדי לחשוף את שלפוחית השתן.
פיפטה לפחות 20 מיקרוליטר פלסמיד בתוספת תמיסת טריפן כחולה לקצה החיצוני של הקטטר ונתקה אותו למזרק. לאחר מכן, הזריק את תמיסת הפלסמיד לשלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופכת לכחולה, ההזרקה מצליחה.
השאירו מעט נוזל בקטטר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בשלפוחית השתן. לאחר מכן, תפוס את פתח השופכה החיצוני והסר את הקטטר והמזרק. השתמש בחוט כדי להדק את פתח השופכה החיצוני.
צרו שתי לולאות עם החוט ואז קשרו עם שני קשרים. זהו צעד מכריע הדורש שיתוף פעולה בין שני אנשים. ודא שהקשרים הדוקים כדי שהפלסמידים לא ידלפו החוצה.
כעת, הפעל את מחולל האלקטרופורציה. צבטו את שלפוחית השתן בשתי אלקטרודות ולחצו על דוושת כף הרגל כדי לבצע אלקטרופורציה. כדי לשמור על שלפוחית השתן נתמכת ניתן לצבוט את החלק האחורי של חתך הבטן בעזרת פינצטה.
הימנע מכל מגע בין פינצטה לאלקטרודות מכיוון שהדבר עלול ליצור ניצוץ. בסיום, תפר את פתח הבטן והעור בתפר סטרילי כירורגי. הסר את החוט והחל קליפים.
מרחו יוד על הפצע ואז הסירו את החיה ממערכת האיזופלורן. יש לתת משכך כאבים בופרנורפין תת עורי כדי להקל על כאבים לאחר ניתוח. שמור את החיה על כרית החימום והחזיר אותה לכלוב הביתי לאחר החלמה מלאה.
בדוק את בעל החיים לפחות פעם ביום לניידות תקינה, התנהגויות שתייה והאכלה, וללא סימני זיהום עד להחלמת החתך. ואז, שבוע לאחר מכן, הסר את הקליפים. תן זריקות עוקבות של משכך כאבים בופרנורפין אם החיה מציגה תסמיני כאב כגון טיפוח מופחת, אגרסיביות מוגברת וקולות.
כדי להדגים העברת גנים מוצלחת לאורותליום שלפוחית השתן, הוזרקו 20 מיקרוליטר של פלסמיד pCAG-GFP ותמיסה כחולה טריפאן דרך השופכה וניתנו חמישה פולסים חשמליים. מוצגת כאן האלקטרופורציה המוצלחת שהפכה את שלפוחית השתן לירוקה לאחר 48 שעות, בעוד ששלפוחית בקרה שלילית שלא עברה אלקטרופורציה לא הראתה אות GFP. צביעה אימונו-פלואורסצנטית של רקמות שלפוחית השתן החתוכות בוצעה עם נוגדנים CK5, CK18 ו-GFP.
אות GFP נצפה נוכח בתאי מטריה, ביניים ובסיס, אך לא בשכבת השריר המצביע על ספציפיות טובה של אספקת פלסמיד לאורותליום. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום סרטן שלפוחית השתן לבנות מודלים חדשים של עכברים אוטוכטוניים לחקר מנגנוני התקדמות המחלה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה חדשנית להחדרת פלסמידי DNA לתאי האורותל של שלפוחית השתן בעכבר in vivo, באמצעות קטטר של השופכה ואלקטרופורציה. טכניקה זו מספקת דרך מהירה ונוחה ליצירת מודלים אוטוכתוניים של מחלות שלפוחית השתן בעכברים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- תרפיה גנטית
- מחקר על סרטן שלב השפות
- טכניקות של אלקטרופורציה
רקע
- השיטה שואפת להחדיר פלסמידי DNA אל הרוחף (urothelium) של שלפוחית השתן בעכברים חיים.
- היא נותנת מענה לשאלות מרכזיות בהתקדמות סרטן שלפוחית השתן.
- וקטורים ויראליים מסורתיים מעוררים חששות בטיחות ומציבים חסמים טכניים.
- שיטה זו מציעה חלופה להחדרה של גנים.
מטרת המחקר
- כדי להקל על ביטוי יתר של גנים או עריכה גנומית בתאי שלפוחית השתן.
- כדי לחקור את ההשפעות של מוטציות גנטיות על סרטן שלפוחית השתן.
- כדי לשפר את היעילות של שיטות להחדרת DNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוב קטטר לשופכה להעברת פלסמיד.
- אלקטרופורציה לשיפור ספיגת ה-DNA.
- יישום in vivo במודלים של עכברים.
- הדגמה על ידי Ofir Stefanson ו-Yueli Liu.
תוצאות עיקריות
- החדרה מוצלחת של פלסמידי DNA לתאי אורותל של השלפוחית (urothelial cells).
- שיטה מהירה ויעילה בהשוואה לווקטורים ויראליים.
- יישומים פוטנציאליים בטיפול גנטי ובמחקר סרטן.
- הוכחת היתכנות במודלים של עכברים חיים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חדשנית להחדרה של גנים לשלפוחית השתן.
- יש לה השפעות על חקר מחלות וסרטן של השלפוחית.
- מחקר נוסף עשוי להרחיב את יישומיה בתחום הטיפול הגנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
שיטה זו מטפלת בצוואר בקבוק קריטי במחקר של סרטן השלפוחית על ידי היתרה של העברה מהירה ולא ויראלית של גנים לאורותליום (urothelium) in vivo. היא תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי היתרה של ביטוי יתר או השתקה (knockdown) זמנית של גנים מועמדים במערכת הרלוונטית למחלה. גישה זו מאיצה את יצירת המודלים הפרה-קליניים, ומקטיצה בזמן ובעלויות בהשוואה למודלים של שורת נבט (germline models), תוך שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית למחקרים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי העברת פלסמידים לתאי אורותל של השלפוחית לצורך מודולציה פונקציונלית של גנים.
- ערך תפעולי: מספק חלופה מהירה ונוחה לווקטורים ויראליים, ובכך מונע הגבלות בטיחות ביולוגית ועיקובי ייצור.
- ערך ניבוי: תומך בסינון פנוטיפי בהקשר של רקמה טבעית, ובכך משפר את הביטחון בבחירת מטרות עבור מסלולים של סרטן השלפוחית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תוצאות מדידה כמותיות הניתנות לשחזור (למשל, ביטוי GFP) להערכת יעילות הטרנספקציה ורמות ביטוי הגנים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של העברת פלסמידים באמצעות קטטרציה ואלקטרופורציה, מה שמאפשר סריקה עקבית של תרכובות או הפרעות גנטיות.
- יכולת הרחבה: מקל על הכנת מודלים מאומתים של שלפוחית השתן לצורך בדיקות תגובה לתרופות או בדיקות סממנים ביולוגיים בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: יצירת מודלים אוטוכתוניים בעכברים המשקפים את מנגנוני ההיווצרות וההתקדמות של סרטן שלפוחית השתן.
- ערך תפעולי: מאפשר מודולציה גנטית הניתנת להשראה בעכברים בוגרים, ובכך תומך בבקרה זמנית במחקרים פרה-קליניים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאי גילוי לאימות פרה-קליני על ידי בדיקת השפעות גנטיות במערכת איברים רלוונטית מבחינה קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומאפשרת חזרתיות מהירה מהשערת המטרה ועד לאישור in vivo ברקמת שלפוחית השתן.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים ובאישור של מטרות באמצעות העברה ישירה של גנים למדורים של האורותליום השפכתי.
- סריקה: מספקת תוצרי פלואורסצנציה כמותיים או תוצרי אימונוהיסטוכימיה להערכת יעילות הטרנספקציה והמודולציה הגנטית.
- אנליטיקה: מספקת נקודות קצה מדידות (למשל, עוצמת אות GFP, ספציפיות לסוג תא) להשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מאפשרת מידול פרה-קליני של פנוטיפים של סרטן השפך באמצעות אורותליום שפכתי שעבר מניפולציה גנטית.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להעברת גנים במגוון מטרות ומחקרים בתחום מחקר מחלות אורולוגיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת ההסתמכות על מערכות ביטוי-יתר מלאכותיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של ניתוח ואלקטרופורציה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי האצת יצירת מודלים והפחתת נשירה כתוצאה מבחירת מטרות שגויה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות לסרטן של השלפוחית בהתאם לסיכון, בהתבסס על נתונים תפקודיים in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות ניתוח בעכברים, קיטטרזציה ואלקטרופורציה.
- תלוי במכשור כירורגי סטרילי, גנרטור לאלקטרופורציה ואלקטרודות תואמות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח נפח פלסמיד עקבי, פרמטרי פולס וחשיפה אחידה של השלפוחית.
- שיקולי התאמה כוללים את גודל הפלסמיד, בחירת הפרומוטור וקצב התחדשות התאי urothelium המשפיעים על משך הביטוי.
- מגבלות מעשיות כוללות ביטוי חולף (שיא לאחר 48 שעות) ואתגרים טכניים בשמירה על שלמות השלפוחית במהלך הפרוצדורות.
