ניתוח רצף גנטי בנוגדנים בלוקמיה לימפוציטית כרונית: מחומר החולה לפרשנות רצף

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום לוקמיה לימפוציטית כרונית, כגון פרוגנוזה מדויקת של חולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, מהירה ומדויקת ביותר. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת prognostication חזק, במיוחד אישורי סיכון עם חולים עם לוקמיה לימפוציטית כרונית כי הפרוגנוזה המדויקת עשויה להגדיר מאוחר יותר ניהול טיפולי של המחלה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כגון בחירת המוצר PCR וסוגי ניתוח רצף עיכול קשה ללמוד כי הם דורשים גם דיוק וניסיון. כדי להתחיל בהליך זה, להוסיף 200 microliters של EDTA לצינור איסוף סטרילי 50 מיליליטר. הוסף 20 מיליליטר של דם היקפי ו 15 מיליליטר של מדיום RPMI לצינור פיפטה למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב.

לאחר מכן, להוסיף 15 מיליליטר של בינוני שיפוע צפיפות לצינור איסוף חדש 50 מיליליטר. שכבה איטית של ת Solution הדם ההיקפי על המדיום שיפוע הצפיפות, מוודא שזה לא לשבש את שיפוע. צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך 20 דקות עם בלם הצנטריפוגה כבוי.

לאחר מכן השתמש פיפטה פסטר סטרילי כדי לאסוף את טבעת התא mononuclear שנוצר בין שכבת טסיות הפלזמה העליונה ואת שכבת בינוני שיפוע צפיפות ולהעביר אותו צינור אוסף סטרילי חדש 15 מיליליטר. הוסף מדיום RPMI כך שהנפח הסופי הוא 12 מיליליטר ו pipette הפתרון למעלה ולמטה לערבב. צנטריפוגה ב 800 פעמים G במשך שמונה דקות.

השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת התא עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI. צנטריפוגה שוב ב 750 פעמים G במשך שמונה דקות. לאחר מכן, להשליך את supernatant ולהמיס את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS.

באמצעות צלחת באואר חדשה, ליצור ספירת תאים על ידי ערבוב 20 microliters של מדגם ו 80 microliters של פתרון טורקי אחד עד 10. אם עיבוד במורד הזרם של המדגם אינו מתוזמן לאותו יום, צנטריפוגה המדגם ב 750 פעמים G במשך שמונה דקות. השליכו את העל-טבעי ואחסנו את גלולת התא במינוס 80 מעלות צלזיוס.

ראשית, הכינו את תערובת הפריים באמצעות כמויות שיווי משקל של כל פריימר תת-קבוצה כדי להבטיח הגברה לא משוחדת. ערבבו את ה- PCR כפי שרשום בטבלה 2 של פרוטוקול הטקסט. הוסף 0.5 מיקרוליטרים של פולימראז TAP לצינור PCR המכיל את רייגנטים PCR מעורבים.

לאחר מכן, להוסיף גם 100 ננוגרם של gDNA או שני microliters של cDNA. הפעל את פרוטוקול PCR התרמי כמפורט בטבלה שלוש של פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, בדוק אם קיימים מוצרי PCR של כ- 500 זוגות בסיס בעת שימוש בפרימרים של ליטר IGHV או 350 זוגות בסיס בעת שימוש בתערובות פריימר IGHPFR1.

כדי להתחיל טיהור מוצר PCR, לטעון את הנפח הכולל של מוצר PCR על שלושה אחוזים נמוך נמס ג'ל אגרוז. אפשר למוצרים PCR לפעול על הג'ל עד שהם נפרדים מן הרקע. Excise להקות PCR בולטות חדות ולאחר מכן לטהר ולחמק מהם.

אם זוהו שני סידורים מחדש, יש ללחוץ את שתי הרצועות ולרצף אותן בנפרד. כדי לבצע ניקוי exo-sap, בצע את הוראות היצרן לגבי אמצעי האחסון הספציפיים לשימוש. בעדינות מערבולת כל מדגם לערבב ולהדגיר אותם על בלוק PCR ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.

להשבית את האנזימים על ידי חימום אותם ל 85 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, לטעון כמות קטנה של מוצרי PCR על ג'ל אגרוז שלושה אחוזים כדי להעריך את הטוהר של המוצר. נקודת הביקורת האחרונה לפני רצף היא קביעת שיבוט המדגם באמצעות ניתוח שברים.

כדי להתחיל לנתח את הרצף, הפעל את התוכנה המתאימה. ציין את המין, כגון הומו ספיינס, ואת סוג הקולטן או לוקוס. קצב הרצפים שיש לנתח בפורמט fasta וכולל מזהים לתוך אזור הטקסט באצוות של עד 50 רצפים לכל ריצה.

לאחר מכן, בחר אחת משלוש אפשרויות התצוגה הבאות לקבלת התוצאות. תצוגה מפורטת:בחר באפשרות זו כדי לקבל את התוצאות עבור כל רצף בנפרד. תצוגת סינתזה:בחר באפשרות זו כדי להרכיב טבלת סיכום שהוזמנה לפי גן IGHV ושם אלל או לפי סדר קלט רצף.

אפשרות זו מספקת גם יישור של רצפים שבאצווה שנשלחה מוקצים לאותו גן IGHV ואלל, ולאחר מכן לקובץ Excel. בחר באפשרות זו כדי לספק את כל קבצי הפלט כגליונות אלקטרוניים המשולבים בקובץ יחיד. רק השימוש פריימרים ליטר IGHV מאפשר הגברה של האורך המלא של IGHV מחדש, ובכך מאפשר את עומס HSM האמיתי להיקבע.

מוצר PCR הצפוי הוא כ 500 זוגות בסיס. במקרים נדירים שבהם פריימרים של ליטר IGHV אינם יכולים להגביר את סידור מחדש של IG קלונוביפיק, ניתן להשתמש בפרימרים של IGHBFR1. מוצר ה-PCR הצפוי הוא כ-350 זוגות בסיסים.

הרצפים שהושגו מנותחים לאחר מכן באמצעות הכלי IMG טלוויזיה Quest. השורה הראשונה בטבלת התוצאות מציינת את הפונקציונליות של הרצף, מכיוון שרצף מסודר מחדש של IG יכול להיות פרודוקטיבי או לא פרודוקטיבי. סידור מחדש של גנים של IGH אינו פרודוקטיבי הוא עצור codons נמצאים בתוך אזור VDJ ו / או אם הסידור מחדש הוא מחוץ למסגרת עקב הוספות / מחיקות.

חשוב לציין כי יש לנתח עוד יותר את הסידורים הפרודוקטיביים ובכך הפונקציונליים. בעת שימוש בפרמטרים ברירת המחדל של IMG TV Quest, הוספות ומחיקות אינן מזוהות באופן אוטומטי, עם זאת אינדיקציות חזקות כי רצף עשוי לשאת שינויים כאלה מסופקים על ידי הכלי והתראת אזהרה מופיעה מתחת לטבלת סיכום התוצאות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להנחית את מוצרי PCR על הג'ל מספיק זמן, כך הקשר שיבוט יכול להיות מופלה מן הרקע הפוליקלונלי.

לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונוגנטיקה של לוקמיה לימפוציטית כרונית כדי לחקור את ההשפעה הפרוגנוסטית של מצב האפימוטציה סומטית בחולים. אל תשכח כי עבודה עם אתיליום ברומיד יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון עבודה מתחת למכסה המנוע בכל עת תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.