הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום נאמנות פולימרי DNA ותיקון DNA כגון שיטות הגהה וניתוח ובהגדרת תיקון ה-DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאוד ספציפית, פשוטה, מהירה וקלה לביצוע. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל שהם עדיין בשכפול DNA ושדה התיקון עשוי שלא להכיר את מכשור ספקטרומטריית המסה ואת פירוש הנתונים.

אני חושב שהחשוב ביותר הוא שההדגמה החזותית היא קריטית מאוד מכיוון שאנו יכולים להראות כיצד ניתן להתאים בנוחות את ספקטרומטריית המסה שפותחה מסחרית ליישומים קליניים כגון מוטציות ושליחות להגהה של DNA ולמחקר התיקון. ידגימו את ההליך סטודנטים לתארים מתקדמים של רונג-סיואן וקואי-צ'ינג מהמעבדה שלי. התחל הליך זה עם הכנת פריימר ותבנית כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כדוגמה, השתמש באי התאמה TG של מצע P21 עם T28 להגהה. מדללים את הפריימר P21 ואת תבנית T28 ל -12.5 פיקומולים למיקרוליטר במים. לאחר מכן, העבירו 12 מיקרוליטר של הפריימר המדולל ו -12 מיקרוליטר של התבנית המדוללת לצינור מיקרו צנטריפוגה מעוקר של 1.5 מיליליטר.

לאחר סגירת הצינור בחוזקה, דגרו את הצינור למשך 30 דקות באמבט מים מקורה של 65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דגרו במשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. ולבסוף, הנח את הצינור על קרח כדי להבטיח חישול תקין.

לצינור מיקרו צנטריפוגה מעוקר של 1.5 מיליליטר, הוסף שמונה מיקרוליטר של תערובת פריימר ותבנית, שני מיקרוליטר של מאגר תגובת הגהה פי 10, ארבעה מיקרוליטר של תערובת 4ddNTPs ומים עד 18 מיקרוליטר. יש לערבב את השפופרת כדי לערבב. לדלל את ה-DNA פולימראז במאגר תגובת הגהה קר כקרח 1x לריכוז הרצוי.

אחסן את האנזים המדולל על קרח כל הזמן. מחממים מראש את צינור המיקרו צנטריפוגה עם תערובת המצע לטמפרטורת התגובה הרצויה. לאחר מכן, העבירו שני מיקרוליטרים של ה-DNA פולימראז המדולל לתערובת המצע המחוממת מראש והזיזו את הצינור כדי לערבב את תוכנו.

צנטריפוגה את הצינורות עם אנזים ומצע למשך מספר שניות בכוח הכבידה פי 3200 בטמפרטורת הסביבה כדי לסובב את מרכיבי התגובות. העבירו מיד את התגובה לגוש חימום או לאמבט מים בטמפרטורת הדגירה הרצויה. כדי לסיים את התגובה, הוסף נפח שווה של פנול חוצץ וערבב את התגובה על ידי מערבולת למשך מספר שניות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התגובה במיקרו-צנטריפוגה בכוח הכבידה פי 3200 בטמפרטורת הסביבה למשך חמש דקות. העבירו את השלב המימי לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי והוסיפו נפח שווה של כלורופורם. לאחר ערבוב על ידי מערבולת של מספר שניות, צנטריפוגה את הדגימה במיקרוצנטריפוגה בכוח משיכה פי 3200 בטמפרטורת הסביבה למשך שלוש דקות.

העבירו את השלב המימי לצינור מיקרו-צנטריפוגה נקי. לאחר דגירה של התגובה ב-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, הנח את הצינור על קרח. לאחר מכן, בצע תוספת שרף כדי למנוע זיהום מלח בצלחת באר 384 כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

הגדר את לוחות הדגימה במתקן הננו-ליטר. מניחים את שבב המטריצה ואת צלחת הבאר המוכנה 384 במגש המתאים. הפעל את מתקן הננו כדי לזהות את תוצרי התגובה לשבב.

לחץ על כפתור ההפעלה במסך המגע של מתקן הננו כדי להתחיל. בדוק את התמונה האוטומטית שצולמה של כתמי הדגימה המכילים מידע רוויה על המסך כדי לוודא שהנפח הכולל המנוקד על השבב הוא בסביבות חמישה עד 10 ננו-ליטר. חזור על איתור הדגימה אם עוצמת הקול אינה מספקת.

הכן קובץ בתבנית Excel המכיל את פרטי האות הצפויים לייבוא. צור והגדר בדיקה חדשה בתוכנית היישום על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על קבוצת ייבוא בדיקה בתבנית מעצב ובחר את קובץ ה- Excel. קבע את לוחית בדיקת היעד באמצעות עץ האפשרויות של לוחית הפרויקט של הלקוח בצד שמאל של המסך על ידי לחיצה ימנית על החלק העליון של העץ ומתן שם קובץ.

בחר את סוג צלחת הבאר 384 ולחץ על אישור. תופיע צלחת ריקה. בחר את הבדיקה המתאימה בצד שמאל של המסך. הקצה את הבדיקה שנבחרה עבור כל מיקום דגימה מנוקד על השבב על ידי הדגשת הבאר ולחיצה ימנית כדי לבחור הוסף plex.

לאחר מכן, הכינו רשימת עבודה של כל הבדיקות על השבב בפורמט Excel ללא כותרת. ייבא את רשימת העבודה באמצעות האפשרות הוסף פרוייקט לדוגמה חדש. הקצה את הבדיקה ואת רשימת העבודה לכל מיקום בבדיקת P21T28 ובחר בלחיצה ימנית.

קשר את ספקטרומטר המסה לשבב באמצעות תוכנית היישום. בחר את הגדרת ברירת המחדל בצד שמאל של המסך. מלא את שם הבדיקה ואת מזהה השבב בפינת השבב

שמור את ההגדרות והפעל את תוכנית בקרת MS. לחץ על כפתור הכניסה/יציאה והוציא את לוחית הצופים. הנח את השבב המנומר על צלחת הצופה ולחץ על כפתור הכניסה/יציאה כדי שהשבב המנומר ייכנס לספקטרומטר המסה.

לחץ על כפתור הרכישה של תוכנית היישום כדי להתחיל את ספקטרומטריית המסה ולרכוש את הנתונים. פתח את התוכנית לניתוח הנתונים. עיין בעץ מסד הנתונים בפינה השמאלית העליונה ובחר את מזהה השבב.פתח את קובץ הנתונים בצד ימין של המסך.

לחץ על סמל הספקטרום כדי להציג את ספקטרום המסה. כדי לחתוך טווח ספציפי של מסה מעל טעינה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור תיבת דו-שיח להתאמה אישית. בחלון החדש, לחץ על ציר ה- x והגדר את הגבול העליון והתחתון הרצוי ולחץ על אישור כדי להציג את הטווח שצוין של הספקטרום.

ייצא את הספקטרום לשמירת רשומות על ידי לחיצה ימנית על ייצוא. בחר את סוג הקובץ JPEG, לחץ על יעד, בחר עיון בדיסק, הקלד את שם הקובץ ולאחר מכן לחץ על ייצוא. לכימות נתונים, השתמש בסמן ולחץ על השיא כדי להציג את גובה השיא בפינה השמאלית העליונה.

ב-MALDI-TOF MS יש קשר הפוך בין עוצמת שיא במסת אוליגונוקלאוטיד. אוליגונוקלאוטידים מ-17 עד 24 נוקלאוטידים עברו ניתוח MS. עוצמות האות היחסיות חושבו וניתן להשתמש בהן לכימות בדיקת ההגהה או התיקון.

ניתן למצוא גם אותות תבנית וגם אותות פריימר בספקטרום המסה. בגלל הבדלי גודל, אותות מתבניות ותוצרי הפירוק החלקי הלא ספציפיים שלהם הופרדו היטב מהפריימרים ומוצרי ההגהה הלא תואמים. מוצגת כאן הגהה של מסוף של שלושה ראשוניים TG.At חמש דקות, המכפלה המתוקנת הייתה 23% לעומת 17% עבור מכפלת הכריתה.

הבדל זה המשיך לעלות ל-69% לעומת 14% לאחר 20 דקות. שימו לב לרזולוציה הגבוהה של MS המפרידה בבירור בין אותות תת-ישר לאותות מוצר עם הפרש טעינת יתר מסה של 32 בלבד. כמו כן, ניתן היה לפתור בקלות שתי צורות של מוצרי כריתה להגהה אולטימטיבית של TG בעט.

תוצרי כריתת נוקלאוטיד אחד ושני תוצרי כריתת נוקלאוטיד. הגהה של אי-התאמות פנימיות הראתה מגמה ברורה ביעילות ההגהה. כפי שמעיד דיבור גדול של מוצר הגהה, נצפתה יעילות מוגברת כאשר לתת-ישרים היו אי התאמות בנוקלאוטידים האחרון, הלפני אחרון, השלישי והרביעי משלושת הקצה הראשוני, בהשוואה לאי התאמות במיקומים אחרים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע יישומים אחרים כמו הגהה פולימרית של סינון כבד כדי לגלות ולהמציא תרופה חדשה למחקר פרמצבטי. טכניקה זו גם סוללת את הדרך לחוקרים בתחום שכפול ותיקון ה-DNA לקבל תובנה נוספת על רפואת הגמד והשכפול הנאמן שלו לכל האורגניזמים החיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הגהה של DNA ובדיקת התיקון באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסה MADI-TOF. אל תשכח שעבודה עם ספנו-כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ויש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי, בזמן ביצוע ההליך. הפרוטוקול החלופי בטקסט יכול להיחשב כתחליף בטוח יותר.