גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans
30 ביולי 2018
פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום C.elegans, כגון ביולוגיה של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ויעילה לקבל אותות של צביעה גרעינית, GFP ושינויי לוקליזציה תת-תאיים בו זמנית. כדי להתחיל, צור מערך חוץ-כרומוזומלי המתיישר עם מבנה תרגומי של גני מטרה.
לחלופין, השג קווים כאלה מהמרכז הגנטי Caenorhabditis, שהוא משאב ציבורי למחקר C.elegans. או, ממעבדת מחקר שפורסמה בעבר. לאחר חשיפת תולעים לקרינת גמא כדי לשלב את הקווים החוץ-כרומוזומליים בגנום, בחר את הקווים המבוטאים ביציבות כך שכל חיה תבטא חלבון סמן כגון GFP או רולר.
כדי להסיר מוטציות שנוצרו במהלך הקרינה, חצו את הקווים לפחות פעמיים. השתמש בקו הטרנסגני שנוצר כדי לזהות שינויים בדפוס ביטוי החלבון תחת לחץ. לאחר מכן, לאחר הכנת צלחות תולעת NGM על פי פרוטוקול הטקסט, פס שיבוט OP50 ותרבית את החיידקים במרק LB נוזלי למשך הלילה.
זרעו את צלחות ה-NGM בתרבית OP50 נוזלית ודגרו את הצלחות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לגדל דשא חיידקים כמקור מזון לתולעים. מצננים את הצלחות בטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות לפני השימוש. גדל את הקו הטרנסגני ב-20 מעלות צלזיוס ללא רעב, לפחות שני דורות לפני בדיקת מתח החום.
בחרו שמונה עד עשרה בוגרים צעירים וגרגרים לצלחת תולעים חדשה. לאחר מכן הניחו להם להטיל ביצים במשך כשלוש עד חמש שעות, והוציאו את כל הבוגרים מהצלחות. כדי לסנכרן את התולעים, תנו לביצים לבקוע ולגדל את הזחלים במשך כ-48 שעות עד לשלב הזחל הרביעי, או L4.
ניתן לזהות זאת על ידי הפות, שהוא מבנה של חצי ירח. לאחר מכן מפעילים לחץ חום על התולעים על ידי דגירה על הצלחות עם זחלי L4 בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד חמש שעות. כלול מדחום בחממה כדי למדוד במדויק את הטמפרטורה.
פיפטה 10 מיקרוליטר M9 במרכז מגלשת זכוכית. לאחר מכן בחר תולעים בהלם חום והעביר אותן לטיפת החיץ. לחלופין, השתמש ב-M9 כדי לשטוף את התולעים מהצלחת.
לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 1000 בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט ואז הוסיפו את התולעים לשקופית הזכוכית. תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש ברקמה רכה כדי לנקז עודפי נוזלים.
לאחר מכן, בעודם תחת המיקרוסקופ, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של 95% אלכוהול על התולעים והמשיכו להתבונן בהן. מיד לאחר שהאתנול מתייבש, חזור על הוספת אתנול פעמיים נוספות. זה קריטי לתהליך אידוי האתנול מבעלי החיים תחת מיקרוסקופ הניתוח.
לאחר שהאתנול יורד מבעלי החיים, המשך מיד לשלב הבא. הוסף 10 מיקרוליטר DAPI לתולעים. מרחו מיד החלקת כיסוי ואטמו את השקופית בג'ל לק שקוף.
לאחר שאפשרתם ללק להתייצב במשך כ-10 דקות, צפו בבעלי החיים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לתקן בעלי חיים עם אצטון, השתמש ב-M9 כדי לשטוף את הצלחת המולם בחום ולצנטריפוגה את הדגימה בכוח הכבידה פי 1000 בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט והשתמשו במיליליטר אחד של מים מזוקקים כדי לשטוף את הגלולה.
לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסיפו 400 מיקרוליטר של 30% אצטון ודגרו על הדגימה למשך 15 דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינור בכוח הכבידה פי 1000 בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש ב-500 מיקרוליטר מים מזוקקים כדי לשטוף את בעלי החיים פעמיים.
הוסף 200 מיקרוליטר של DAPI לגלולה, או פי ארבעה מכמות הנפח הכולל של התולעים לצינור, ודגר את הדגימה למשך 15 דקות. צנטריפוגה את הדגימה והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן השתמש ב-500 מיקרוליטר מים מזוקקים כדי לשטוף את הגלולה פעמיים לפני ההרכבה וההדמיה כמו קודם.
כדי לבצע הדמיה, הפעל את מקור האור האולטרה-סגול ואת המיקרוסקופ הקרינה. לאחר מכן הפעל את המחשב המחובר למיקרוסקופ. טען את השקופית על מיקרוסקופ הקרינה.
השתמש בעדשת אובייקטיבית פי 10 כדי לאתר את התולעים. לאחר מכן הגדל את עוצמת ההגדלה ל-400X והתמקד בדגימה. לאחר מכן, פתח את התוכנה המצורפת למיקרוסקופ.
לחץ על רכישה, ולאחר מכן לחץ על מצלמה ובחר את המצלמה המחוברת למיקרוסקופ. תחת אותה רכישה, לחץ על רכישה רב-ממדית. פעולה זו פותחת חלון ניווט חדש של רכישה רב-ממדית.
לחץ על כפתור הרב-ערוצי וכל הערוצים הזמינים יופיעו. בחר כחול, ירוק ו-DIC כדי לצפות בדגימה. בחלון הניווט רכישה רב-ממדית, השאר את ערוצי ה- DAPI הכחולים, ה- GFP הירוק וה- DIC האפור דולקים ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על ערוצים אחרים, כגון רודמין אדום וברייטפילד לבן, כדי לסגור אותם.
כדי למדוד את זמן החשיפה עבור כל ערוץ, לחץ לחיצה ימנית על ערוץ ה-DAPI הכחול כדי לבחור אותו ולחץ על "למדוד" כדי לצלם תמונה חיה עם זמן חשיפה אוטומטי. בצד שמאל של חלון התמונה החיה, התאם ידנית את זמן החשיפה אם תרצה, ולאחר מכן לחץ על אישור. הגדר את זמני החשיפה עבור ערוצי GFP ו-DIC באופן דומה. בחלון הניווט רכישה רב-ממדית, לחץ על התחל"כדי לאסוף אוטומטית שלוש תמונות תחת שלושת הערוצים השונים, לפי הסדר, עם זמני החשיפה שנקבעו.
כדי לשמור את הקובץ, בתפריט הראשי, לחץ על קובץ, שמור בשם.הזן את שם הקובץ והתיקיה. שמור את הקובץ כתבנית ברירת המחדל כדי לשמר את פרטי ההדמיה המפורטים לעיון עתידי. כדי לייצא את הקובץ בתבניות אחרות, תחת קובץ, לחץ על ייצוא.
הגדר את שם הקובץ והתיקיה. סמן את צור תיקיית פרויקט "כדי לארגן טוב יותר את הנתונים. לאחר בחירת סוג הקובץ הרצוי מהתפריט הנפתח, לחץ על התחל "כדי לייצא.
ישנם שני הומולוג של חלבון תעלה תוך-תאית כלוריד ב-C.elegans, exl-1 ו-exc-4. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי exl-1 מווסת את ניהול הלחץ של בעלי חיים. כאן, מבנה GFP תרגומי exl-1 שולב בגנום של בעלי חיים, ונוצרו קווים טרנסגניים, המבטאים ביציבות אקסל-1 פלואורסצנטי ירוק.
תחת עומס חום, exl-1 GFP מצטבר בגרעין באזור המעי כאשר אות GFP חזק חופף לגרעין. כדי לאשר את הלוקליזציה התת-תאית של exl-1, צביעת DAPI בוצעה הן בבעלי חיים קבועים באתנול והן באצטון. שתי השיטות מראות גרעינים ברורים בגוף החיה ואותות GFP ו-DAPI החופפים מאשרים כי exl-1 GFP אכן הצטבר בגרעינים באזור המעי.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע קיבוע מהיר כדי לשמר את אות ה-GFP וטרנסלוקציה גרעינית של חלבון תחת לחץ ב-C.elegans.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר תעביר גרעיני של חלבון תחת עקה תרמית באמצעות חלבון היתוך GFP כסמן וצביעת DAPI. השיטה מהירה ויעילה, ומאפשרת תצפית סימולטנית על צביעת הגרעין ועל שינויים במיקום התת-תאי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- גנטיקה
רקע
- הבנת המיקום התאי של חלבונים היא קריטית בביולוגיה של התא.
- עקה תרמית עלולה להשפיע על translocation ומיקום של חלבונים.
- חלבונים מודבקים ל-GFP הם סמנים בעלי ערך למעקב אחר חלבונים.
- צביעת DAPI מספקת שיטה להדמיית הגרעינים.
מטרת המחקר
- מעקב אחר תעתוק גרעיני של חלבון תחת עקה תרמית.
- שימוש ב-GFP כסמן למיקום של חלבונים.
- הדגמה של פרוטוקול מהיר לצביעה ב-DAPI.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קונסטרוקטים תרגומיים.
- חשיפת C.elegans לקרינת גמא לצורך אינטגרציה.
- בחירת שושלות עם ביטוי יציב באמצעות חלבוני סמן.
- תצפית סימולטנית על לוקליזציה גרעינית ותת-תאית.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר translocation גרעינית תחת עקה תרמית.
- ויזואליזציה יעילה של צביעת GFP ו-DAPI.
- הוכחת יעילות הפרוטוקול ב-C.elegans.
- מתן תובנות לגבי דינמיקת הלוקליזציה של חלבונים.
מסקנות
- הפרוטוקול מהווה כלי בעל ערך לחקר דינמיקה של חלבונים.
- שיטות מהירות ויעילות משפרות את המחקר בביולוגיה של התא.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתנאי עקה אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
פרוטוקול זה מאפשר מעקב מהיר, ללא שימוש בנוגדנים, אחר שינויים במיקום התת-תאי של חלבונים בתגובה למעמס (stress), ובכך תומך בתיקוף יעדים (target validation) בשלבים מוקדמים של תהליכי גילוי. באמצעות שילוב של תיוג GFP עם צביעת גרעין ב-DAPI, הוא מספק אישור ויזואלי וכמותי של אירועי טרנסלוקציה — כגון הצטברות גרעינית תחת מעמס חום — שיכולים לסייע בהסרת סיכונים מנגנונית (mechanistic de-risking) של היפותזות טיפוליות. התאימות של השיטה למיקרוסקופי פלואורסצנציה סטנדרטיים הופכת אותה לנגישה להכנה של סריקות בתפוקה גבוהה (high-throughput screening) ולשימוש של צוותים רב-תחומיים בסביבות מו"פ של ביו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תצפית ישירה על translocation של חלבונים המושרה על ידי סטרס, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות ובבחינת מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בנוגדנים או בסמנים רדיואקטיביים, מה שמפחית את זמן ועלות פיתוח הבדיקה.
- ערך חיזוי: מאשר שינויים במיקום התת-תאי שעשויים להעיד על מנגנון הפעולה או על ויסות של תגובת הסטרס.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר קווים טרנסגניים יציבים המבטאים חלבונים מתויגים ב-GFP עבור פלטפורמות סריקה עקביות וניתנות לשחזור.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה סימולטנית של אות GFP וצביעת DAPI גרעינית לצורך ניתוח קו-לוקליזציה.
- יכולת הרחבה: תואם למיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, מה שמאפשר התאמה לפורמטים של מספר בארות לסריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: עוקב אחר הלוקליזציה של EXL-1, חלבון ממשפחת CLIC בעל הומולוגים ביונקים (למשל CLIC4), ובכך תומך בהערכת מטרות תרגומיות.
- הסרת סיכונים מכניסטיים: מאשר תעתוק גרעיני תחת עקה תרמית אך לא תחת עקה חמצונית, ובכך מסייע להגדיר התנהגות של מטרה בהתאם לתנאים.
- המשכיות פרה-קלינית: מספק מערכת הניתנת לשימוש חוזר להערכת דינמיקת חלבונים תחת תנאי עקה שונים לפני תיקוף in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות על מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ובמיוחד עבור חלבונים המגיבים למעמם (stress-responsive proteins). היא תומכת בקבלת החלטות מוקדמות של המשך או הפסקת תהליך (go/no-go) באמצעות תיקוף של המעורבות במטרה (target engagement) ודינמיקה תת-תאית לפני קמפיינים של סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של שינויים בלוקליזציית חלבונים תחת תנאי עקה מוגדרים.
- סריקה: מכין מערכות תאים מתוקפות לסריקת ספריות תרכובות עם קריאות לוקליזציה מובנות.
- אנליטיקה: מייצר נתוני קו-לוקליזציה (חפיפה בין GFP/DAPI) כפלט כמותי להערכת השפעות תרכובות על תעבורת חלבונים.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאים ב-C. elegans למערכות יונקים באמצעות חלבון CLIC שמור, ובכך תומך בתיקוף מטרות בין-מיני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה (pipeline) מודולרי וניתן לשימוש חוזר למעקב אחר דינמיקה תת-תאית של כל חלבון מתויג ב-GFP תחת עקה או חשיפה לתרכובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת ראיות ויזואליות ישירות של translocation של חלבונים בהקשרים של תאים חיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי קיבוע (fixation) והדמיה בין צוותים, מה שמשפר את השחזוריות ומפחית שונות.
- ערך אסטרטגי: מאיץ את לוחות הזמנים של תיקוף מטרות (target validation), מה שמאפשר מיון מהיר יותר של הפורטפוליו ומפחית השקעה במטרות שהן positive-false.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי אישור התנהגות המטרה במודלים של עקה (stress models) הרלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-C. elegans, יצירת קווים טרנסגניים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מערכות פילטרים של FITC ו-DAPI ואופטיקת Nomarski.
- מחייב סטנדרטיזציה של הקיבוע (אתנול/אצטון) ותזמון הצביעה כדי לשמר את אות ה-GFP ולהבטיח סימון גרעיני עקבי של DAPI.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של עוצמת הפרומוטור, יעילות התיוג ופרדיגמות של דחק.
- מגבלה מעשית: מתאים ביותר לחלבונים עם טרנסלוקציה ניתנת לזיהוי; עשוי שלא לפתור אירועי מעבר מהירים או חולפים ללא דימוי חי.
