Name: תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: למד השתלת בתוך הרחם בדרכים תוך ורידיות ואינטרה-שפיריות במודל עכברים. שיטה זו מאפשרת הזרקת תאים, וקטורים ויראליים וחומרים נוספים לסביבת העובר הסובלנית חיסונית לחקר תרפיות ניסיוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרוטוקולים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית החולים לילדים של פילדלפיה.
1. יצירה של הזרקת סיליקון
<ol><li>שימוש של פולר micropipette אנכי, משוך על פיפטה microcapillary 100 µL (איור 1 א' - ג' 1). כיילו את פולר micropipette כך הסוף מחודדות > 1 ס"מ. הערה: בתחילה, ההגדרות של פולר צריך להיות מותאם לכל אורך האופטימלית. הגדרת חום גבוהה יותר תגרום קצה ארוך יותר, הגדרת משיכה גבוהה יותר תגרום הקוטר של הקצה צר יותר.</li>
	<li>חותכים את הקצה מחודדות כך שזה ≥ 1 ס"מ. ודא כי הקוטר הפנימי בקצה המחט הוא בין 70 מיקרומטר 100 מיקרומטר כי היא ביחס הפוך לאורך הקצה מחודדות. הערה: קוטר פנימי תלויה גם הכיול של פולר micropipette. עיין בהוראות יצרן של פולר micropipette אנכי או כל סוג של פולר micropipette מועדף.</li>
	<li>אחרי שתוודא כי המחט יש בקוטר פנימי הנכון, ליצור שיפוע של 15-20 מעלות על ידי חידוד קצה באמצעות beveller micropipette עם יהלום החידוד גלגל (איור 2 א - ג 2). ודא לנוח בעדינות על הגלגל ללא לחץ רב מדי, כדי להקטין את הסיכויים של שבירת או פיצוח הטיפ העצה. פתק: ניתן להשתמש במכחול לנגב נפולת שנוצרים על קצה המחט.</li>
	<li>להעריך את הטיפ תחת מיקרוסקופ ולהבטיח כי הטיפ הוא עגול בלי צ'יפס או סדקים. להעריך מחדש את קוטר פנימי כדי לוודא שזה בין מיקרומטר 70 100 מיקרומטר (איור דו-ממדי - 2 H).</li>
	<li>לצייר קווים על שאר המחט כדי לייעד µL 5 אמצעי ביניהם (למשל, מחטים בקוטר הפנימי 1.3 מ מ צריך קווים שצוירו בבית בהפרשים קבועים של 3.77 מ מ).</li>
	<li>אוטוקלב המנזר מחטים להשתמש בניתוח, להתמודד איתם בכפפות סטריליות.</li>
</ol>2. בתוך הרחם זריקות
<ol><li>להכין הצורך כלים על-ידי autoclaving אותם מבעוד מועד. כוללים כלים חיוניים כגון microinjector המחט, נהג מחט כירורגית, זוג מלקחיים לאדאמסון, זוג מספריים רקמה רגילה מעוקל, מזרק אינסולין 1 מ"ל, זוג applicators כותנה-עצה, פיפטה העברה, צינור חרוטי 50 מ ל, ו- a חבילת 4-0 polyglactin 910 התפרים.</li>
	<li>באמצעות טכניקה סטרילי, לצרף את המחט למחזיק המחט וחבר אותו לתוך microinjector. הערה: ההגדרות של החנקן דחוס המשמש הן כדלהלן: להזריק 4-6 psi, איזון 0 psi. תלוי מה להיות מוזרק, באופן ספציפי, צמיגות injectate, כמו גם גודל micropipette, הזרקת הזמנים משתנים בין 0.3 - 1.5 s.</li>
	<li>לנקות את קצה המחט נפולת אפשרי על ידי ממלאים 5-10 µL עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ולאחר מכן ניקויו. חזור על זה x 2-3.</li>
	<li>הכן עכברים נקבה בהריון של 2 עד 6-בן חודש לניתוח על ידי גילוח הבטן שלהם עם בטלוויזיה. להיזהר לא לפגוע הפטמות. לנהל משכחי כאבים אוראלי (למשל, 100 µL של 1.5 mg/mL meloxicam השעיה אוראלי לכל העכבר).</li>
	<li>להתחיל למלא את המחט עם החומר הרצוי (תאים וקטור סמים)-לנפח הרצוי. יש להיזהר לא לשבור את מחט בעודם מתדלקים את המחט. הערה: הנפח של הזרקת לכל העובר משתנה בהתאם לעיצוב ניסויים ספציפיים. 20 µL זו פועלת היטב עבור הזרקת מספר רב של תאים (קרי, עד 107 תאים לווריד vitelline. למשל, נמסר לנו עונה 1 פרק 107 תאים במח העצם כולו מבודד OsbY01 C57BL/6TgN(act-EGFP) ["B6 ירוק ניאון חלבון (GFP)"] עכברים דרך הווריד של vitelline לתוך הריונית העוברים Balb/c יום-14. לזריקות וקטור ויראלי, זריקה אחת של 10 µL של הווקטור מדולל 1:1 עם PBS עובד היטב.</li>
	<li>כדי לכייל את הזמן הזרקה, לנקוט בצעדים הבאים.<ol>
<li>לדחוף מצב לחצן x 3 ב- microinjector כדי להגיע למסך כיול הזרקה. שינוי משך הזמן הזרקת על-ידי הוספת במרווחים של 10 או 100 ms ולדחוף מצב לחצן 2 x.</li>
		<li>לחצו על הכפתור איזון ודחף את דוושת רגל פעם אחת. עכשיו תדחפי את דוושת שוב ואני להעריך כמה נפח ריקון החוצה המחט לכל דחיפה. אם לא מכויל כדי לנפח הרצוי של 5-20 µL לכל לדחוף פדלים, חזור על שלבים 2.6.1 ו 2.6.2. הערה: בדרך כלל, זה טוב לכייל כל דחיפה לספק לחצי מנפח היעד הכולל בכל פעם. אמנם זה ניתן להזריק µL יותר מ- 30 או 40 אפילו µL מהנפח הכולל, בדרך כלל נשאר מעל 20 µL לכל העובר, תוך ורידי או מי השפיר-"אינטרה".</li>
	</ol></li>
	<li>למלא את המחט עד הרמה הרצויה.</li>
	<li>להתחיל במתן הרדמה העכבר על-ידי כוונון של זרימה חמצן כדי 1 ליטר/דקה, מאדה את איזופלוריין ל-3%.</li>
	<li>לאשר אם העכבר הוא ומורדמת באמצעות בדיקת היעדר רפלקס פדלים. להעביר את העכבר כרית החימום במצב פרקדן.</li>
	<li>החל ג'ל סיכה העין כדי למנוע לייבוש הקרנית. אבטח את העכבר במקום על ידי מקליטה את הגפיים העליונים והתחתונים כדי לרפד.</li>
	<li>. תכינו את הבטן עם שיחים chlorhexidine ואחריו אלכוהול ולהזריק הרדמה מקומית (למשל, µL 100 של 0.25% נמשך) subcutaneously (איור 3א).</li>
	<li>עם מספריים, עושים חתך בעור 1-2 ס מ כך לגבול התחתון היא לא קרובה יותר 1 ס מ introitus; fascia מתחת הוא דק מאוד שקוף.</li>
	<li>לזהות האמצע של fascia אשר הוא שקוף יותר מאשר האזור הסובב. להיזהר לא לפגוע בכלי הדם הצפק הסובלת משני צדי הקו האמצעי. צריך כלי הצפק נפצע, תחזיק את הלחץ עם כותנה-טיפ applicators כדי לעצור את הדימום.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים לאדאמסון, צבוט fascia מבלי להיעזר באחד האברים המשמשים כבסיס כגון המעיים, שלפוחית השתן, או העוברים. פתח fascia במספריים נזהר שלא לפגוע באחד האברים. פעם בבטחה בבטן, להרחיב את החתך fascial. . לעשות את זה עוד יותר החתך בעור.</li>
	<li>השתמש applicators כותנה-טיפ כדי להעביר את המעיים אל החלק העליון של הבטן, ובכך לחשוף את הרחם gravid. לספק את הרחם מתוך החתך, זיהוי בקפידה את השחלות ימינה ושמאלה כדי להבטיח שכל העוברים ייספרו (איור 3ב).</li>
	<li>המקום הרחם שמאלה בחזרה לתוך הבטן, כך נחשף רק הרחם נכון; זה מונע לייבוש של הרחם, מחממת את העוברים שאינו המוזרק.</li>
	<li>החזק ביותר לרוחב העובר/השפרה בין האגודל לבין האצבע של היד האחרת של המפעיל (איור 3ג'). תמיד להיות עדין כדי לא לגרום נזק העוברים.</li>
	<li>מקם המיקרוסקופ לנתיחה (10 X הגדלה הוא אידיאלי) והתאימו את המוקד כך שהעובר נמצא בתצוגה. להתאים את התאורה עבור פריט חזותי טוב יותר.</li>
	<li>לזהות את זה להיות מוזרק (וריד vitelline, השפיר). לזריקות תוך ורידי, דמיינו את הוורידים vitelline והן השקה שלהם קודם. לזריקות אינטרה-שפיר, אוריינט העובר עם צד ימין בתצוגה.</li>
	<li>להגיע אל המרחב היעד עם מחט כמתואר להלן.<ol>
<li>הזרקה תוך ורידי, לעשות כדלקמן.<ol>
<li>לסובב את הרחם כך הווריד vitelline זה להיות מוזרק, הוא מקביל קצה המחט; זכור כי הזריקות חייבת להתבצע לקראת ההשקה של שני הורידים.</li>
			<li>להניח את המחט על הרחם בזווית של 5°, לחדור את החומה הרחם. העצה היא בין הקיר הרחם השפרה, מקם את הטיפ ישירות על גבי הווריד vitelline.</li>
			<li>בזווית כמעט משיקי, להחליק את המחט על הווריד של עד השיקוע מפלח ומקדמות לתוך הכלי; זו ניכרת על ידי הבזק של דם לראות בקצה המחט (איור 3ד'). הערה: הגישה את הווריד עלול לקחת כמה ניסיונות כפי המחט עשוי לא לנקב את הווריד עם הגלישה הראשונה מעל הווריד.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הזרקת אינטרה-שפיר, לעשות כדלקמן.<ol>
<li>לסובב את שק מי השפיר, מצא את מיקום ללא כלי כדי לחדור.</li>
			<li>הצבע המחט מאונך לדופן הרחם ולאחר לחדור מבעד הרחם, שק החלמון, ולאחר מכן את שק מי השפיר. יש להיזהר לא לחדור מבעד לכל רקמה עוברית. ודא שהמחט עבר בין הגפיים כמו זה מאשר כי המחט נמצא השפרה. לאחר מכן המשך עם הזריקה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>להזריק הנפח המתאים של החומר הרצוי (בדרך כלל 10-20 µL) על-ידי לחיצה על דוושת רגל. הערה: כי מזרק חייב לשמור על הפריט החזותי של קצה המחט דרך המיקרוסקופ-בכל עת, אדם השני חייב לקרוא הסימנים על המחט לכמת את כמות מוזרק וליידע מזרק כמה נפח שנשאר להזריק. דיון לפני הזריקה בין מזרק עוזר חשוב למנוע כל בלבול ועיכוב. זה חשוב במיוחד לזריקות תוך ורידי כי הסרה מושהית של המחט יאפשר זרם של אחורי של דם ורידי לתוך מחט ואת התוצאה מינון לא מדויק.</li>
	<li>למשוך את המחט ההזרקה ברגע מועבר לנפח הרצוי. כי ייתכן דימום מן הספינה לנקב אתר עם זריקות תוך ורידי, החזק לחץ עם הצד של המחט עבור 10-15 s לעצור את הדימום.</li>
	<li>המשך העובר הבא. המשך עד מכל העוברים של הקרן נכון הרחם היה להזריק.</li>
	<li>להסיר הקרן הרחם השמאלי של הבטן ולהחליף הקרן הרחם ממש חזרה בתוך חלל הצפק. הערה: לעיתים, המחט זקוק בכמה זמן עם injectant.</li>
	<li>ברגע שיש הוזרק, כל העוברים, החלף את הרחם לתוך. חלל הבטן (איור 3E). הקפד להימנע של הרחם או מעיים התפתלות המעים.</li>
	<li>עם פיפטה העברה חד פעמיות, מקום בערך 2 מ ל 1 x PBS לתוך. חלל הבטן כדי להחליף את ההפסדים בעלפון חושים.</li>
	<li>סגור את fascia והבטן בשכבת רציף אחד, בעזרת תפרים 910 polyglactin 4-0 כדי להימנע ופצעו את האיברים כבסיס במהלך הסגר (איור 3F - דור 3).</li>
	<li>הוצא את הקלטת, להעביר את העכבר אל כלוב מתחת למנורת חום. להיזהר לא להציב מנורת החימום קרוב מדי העכבר. ודא שהכלוב יש מצעים, מזון ומים. הערה: תא חם thermostatically מבוקרת עשוי גם לשמש. העכבר הוא ער כאשר הוא זקופה והליכה.</li>
	<li>להתבונן העכבר מדי יום ותן משכחי כאבים לפי הצורך. הערה: אנחנו באופן שגרתי לתת meloxicam בימים שלאחר הניתוח 1 ו- 2, לפעמים ביום 3 אם העכבר מראה סימנים של כאב.</li>
	<li>אם עושים ניתוח אצווה עם אותו חומר הזרקה, לנקות את המחט הזרקה עם PBS סטרילי. אם מזריק חומר שונים, תשליך המחט בתוך מיכל שרפ ולהשתמש מחט חדשה. הערה: מומלץ וטיפוח הגורים עם הפונדקאית סכרים מיד לאחר הלידה, למקרה הסכר mounts של התגובה החיסונית נוגדנים injectant והעברות הגורים דרך חלב האם.</li>
</ol>

<ol><li>Loukogeorgakis, S., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+stem+cell+and+gene+therapy%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives.</a> European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).</li>
<li>Vrecenak, J., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+hematopoietic+cell+transplantation%3A+recent+progress+and+the+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application.</a> Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).</li>
<li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+murine+hemoglobinopathies+by+prenatal+tolerance+induction+and+postnatal+nonmyeloablative+allogeneic+BM+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants.</a> Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).</li>
<li>Vrecenak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Long-Term+Mixed+Chimerism+Achieved+in+a+Canine+Model+of+Allogeneic+in+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).</li>
<li>Peranteau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD26+Inhibition+Enhances+Allogeneic+Donor-Cell+Homing+and+Engraftment+after+in+utero+Hematopoietic-Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).</li>
<li>Waddington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+gene+transfer+of+human+factor+IX+to+fetal+mice+can+induce+postnatal+tolerance+of+the+exogenous+clotting+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor.</a> Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).</li>
<li>Stitelman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Stage+Determines+Efficiency+of+Gene+Transfer+to+Muscle+Satellite+Cells+by+in+utero+Delivery+of+Adeno-Associated+Virus+Vector+Serotype+2%2F9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040(2014).</li>
<li>Endo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Transfer+to+Ocular+Stem+Cells+by+Early+Gestational+Intraamniotic+Injection+of+Lentiviral+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector.</a> Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).</li>
<li>Boelig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intravenous+Route+of+Injection+Optimizes+Engraftment+and+Survival+in+the+Murine+Model+of+In+utero+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-amniotic+Transient+Transduction+of+the+Periderm+with+a+Viral+Vector+Encoding+TGF%CE%B23+Prevents+Cleft+Palate+in+Tgf%CE%B23-%2F-.+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos.</a> Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).</li>
<li>Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+gestational+gene+transfer+of+IL-10+by+systemic+administration+of+lentiviral+vector+can+prevent+arthritis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model.</a> Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).</li>
<li>Reay, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-Length+Dystrophin+Gene+Transfer+to+the+Mdx+Mouse+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero.</a> Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).</li>
<li>Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transduction+of+Spinal+Cord+Motor+Neurons+by+Intrauterine+Delivery+of+Integration-Deficient+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors.</a> Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).</li>
<li>Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+Brain-Directed+AAV+Gene+Therapy+Results+in+Rapid%2C+Robust%2C+and+Persistent+Transduction+of+Mouse+Choroid+Plexus+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101(2013).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21307829">A mouse model of in utero transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2303(2011).</li>
<li>Davey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaagsiekte+Sheep+Retrovirus+Pseudotyped+Lentiviral+Vector-Mediated+Gene+Transfer+to+Fetal+Ovine+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung.</a> Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השתלת בתוך הרחם הוא טיפול פוטנציאלי עבור רבים הפרעות מולדות אשר יכול להיות מאובחנים בשלב מוקדם של ההיריון. המודל מאתר דליה מאפשר לחוקרים לחקור את הסביבה עוברית או להתנסות עם טיפולים שונים. תלוי מה להיות מוזרק, מה הוא על הכוונת, השתלת תוך ורידי או אינטרה-שפיר בתוך הרחם יכול לספק משלוח אמין של injectant אל החלל הרצוי.
כשמתכוונים איברים ספציפיים, חשוב לבחור העידן embryological המתאים של העובר, כמו גם את טכניקת ההזרקה. בעוד תוך ורידיות תאים בחלק E14 הינו אידיאלי עבור מיקוד הגומחה...

התפתחויות אחרונות ההקרנה קדם-לידתית ואבחון הביאו כדי להאיר את האפשרות לטיפול העובר במשך מספר הפרעות מולדות אשר לא קיימות אפשרויות טיפול הולם כמחנכת ולגרום לזיהום משמעותי. באופן ספציפי, בתוך הרחם השתלת תא גזע hematopoietic (IUHCT) ועריכה טיפול/הגנום ג'ין יש את היכולת לנצל נורמלי מאפיינים התפתחותיים של העובר כדי לטפל מולדת המטולוגיות, המערכת החיסונית, גנטי והפרעות ביעילות רבה יותר מאשר השתלת HSC כמחנכת ועריכה טיפול/הגנום ג'ין יכול לעשות1,2. באופן ספציפי, בשל גודלו הקטן של העובר, התורם בתא או מינון וקטור ויראלי יכול להיות מוגדלים לפי המשקל של הנמען. בנוסף, מאפשרת חוסר בגרות אוטואימונית של העובר התורם HSCs כדי להיות מוזרק ללא myeloablative, לדיכוי המערכת החיסונית מיזוג זה נדרשת השתלת כמחנכת בפרוטוקולים. באופן דומה, וקטורים ויראלי נושאת transgene טיפולית או טכנולוגיה העריכה הגנום של יכול להיות מוזרק ללא לתגובה החיסונית המגביל את המוצר transgene או וקטור ויראלי. סוף סוף, הנגישות והטבע המקדימות של גזע עוברי/ובתאים לממן את האפשרות של התמרה חושית יעילה יותר של היעד ובתאים, וכן מסוימים מצבים של הגנום העריכה (מכוון הומולוגיה תיקון) הדורשים רכיבה על אופניים תאים כדי שתתבצע ביעילות. המודל מאתר משמש כאמצעי תובנה ובמחיר להפנות שאלות חשובות של ביולוגיית תאי הגזע ואימונולוגיה לפני ניסויים במודלים של בעלי חיים גדולים ניסויים פרה-קליניים, ככזה, שימש מאמצת את IUHCT, ברחם ריפוי גנטי כבר בחנו1,2,3.
למרות משתנים רבים לשחק תפקיד חשוב להצלחת IUHCT ועריכה בתוך הרחם ג'ין טיפול/הגנום במודלים של בעלי חיים מאתר וגדולים, משתנה מפתח היא שיטת מסירה של HSCs או וקטור ויראלי. המסירה של כמויות גדולות של התורם HSCs עם אפקט כניסה ראשונה המתרחשים בכבד העובר, האיבר hematopoietic בזמן IUHCT, הוכח להיות אינסטרומנטלי להשגת רמות macrochimeric engraftment עכבר, מודלים בעלי חיים גדולים4 ,5. הייתה זו מושגת באמצעות הזרקה של התורם התאים דרך הווריד vitelline במודל עכבר, באמצעות זריקה אינטרה-הלב במודל הכלביים. התוואי של הזרקת גם ממלא תפקיד מהותי המיקוד ובתאים של איברים שונים במהלך הפיתוח. לדוגמה, לעירוי הזרקה דרך הווריד vitelline של הוכח ביעילות מגלי cardiomyocytes, hepatocytes בעקבות בסוף ההיריון הזרקת6,7. לחלופין, זריקה אינטרה-שפיר של וקטורים ויראלי מאפשרת התמקדות האיברים החשופים פיזית המבוססת על עובריים הקיפול/פיתוח בזמנו של הזרקת8. דוגמה לכך הוא הטוב ביותר על ידי מיקוד של אפיתל בדרכי הנשימה באמצעות זריקה אינטרה-שפיר בסוף ההיריון לנצל נורמלי "נשימה" תנועות. עובריות, החושפת את מערכת הנשימה כדי וקטור ויראלי ב- מי השפיר נוזל9. שני מצבים אלה של דליה, תוך ורידי דרך הווריד של vitelline ו- "אינטרה"-מי השפיר, היו הבסיס לניסויים קודמים ומתמשכים מרובים במעבדה שלנו. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט את השיטות לביצוע תוך ורידי, אינטרה-שפיר דליה במודל מאתר.

<table><tbody><tr><td>כפפות</td><td>בריאות קרדינל</td><td>2D73DP65</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של אדסון עם שיניים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים של אדסון ללא שיניים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כבדים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14002-13</td><td></td></tr><tr><td>נהג מחט</td><td>Fine Science Tools</td><td>12005-15</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 2.0</td><td>Ethicon</td><td>JB945</td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטה</td><td>Medline</td><td>GSI135010</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים עם קצה כותנה</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>קלטת</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>חומר סיכה לעיניים</td><td>Major LubriFresh</td><td>0904-6488</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>K& H</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>מזרק</td><td>Narishige</td><td>HI01PK01</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית</td><td>Kimble</td><td>71900-100</td><td></td></tr><tr><td>אנכי מיקרופיפטה חולץ</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>מיקרואלקטרודה Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>IM-300 מזרק מיקרו פנאומטי</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>305935 Filter</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>Compac5 מכונת הרדמה</td><td>VetEquip Compac5</td><td>901812&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal טיפול קריטי</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>N2 גז</td><td>Airgas</td><td>NI 125</td><td></td></tr><tr><td>O2 גז</td><td>Airgas</td><td>OX 125</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP וקטור ויראלי</td><td>Penn Vector Core</td><td>H5'.040.CMV.eGFP</td><td></td></tr></tbody></table>

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

השתלת בתוך הרחם (דליה) הוא מצב ייחודי ופסיביות של טיפול זה יכול לשמש כדי להציג את תאי גזע, וקטורים ויראלי או חומרים אחרים בשלב מוקדם ההיריון. הרציונל מאחורי דליה למטרות טיפוליות מבוססת על גודל קטן של העובר, חוסר בגרות אוטואימונית עוברית, נגישות הטבע שגשוג של תאי גזע או קדמון עוברית, ואת הפוטנציאל לטיפול במחלה או הופעת התסמינים לפני הלידה. ניצול של מאפיינים התפתחותיים רגילים אלה של העובר, המסירה של תאי גזע hematopoietic (HSC) דרך של דליה יש פוטנציאל לטיפול בהפרעות המטולוגיות מולדות כגון מחלה חרמשית, בלי הדרוש myeloablative או מיזוג לדיכוי המערכת החיסונית הדרושים עבור מועדון הכדורגל מונפלייה כמחנכת השתלת. באופן דומה, הנגישות של ובתאים באיברים רבים במהלך התפתחות פוטנציאל מאפשר מיקוד יעיל יותר של גזע/ובתאים בעקבות של דליה של וקטורים ויראלי ריפוי גנטי או גנום לעריכה. בנוסף, דליה יכול להיות המשמשות ללימוד תהליכים התפתחותיים נורמליים, לרבות, אך מבלי להגביל, הפיתוח של סובלנות אוטואימונית. המודל מאתר מספק אמצעים יקר ומשתלם כדי להבין את הפוטנציאל ואת המגבלות של דליה לפני ניסויים פרה-קליניים מחקרים שנעשו בבעלי חיים גדולים, יישום קליני בסופו של דבר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לביצוע של דליה העובר מאתר דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר. פרוטוקול זה שימש בהצלחה התירי את התנאים הנדרשים ואת מנגנוני מאחורי בתוך הרחם השתלת תא גזע hematopoietic, סובלנות אינדוקציה, ריפוי גנטי בתוך הרחם .

הישרדות engraftment חשוב מדדי הצלחה לניסויים IUHCT בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. בהתאם נקודות הקצה מסוימת של ניסוי, העוברים שקיבלו IUHCT יכול להיות מנותח prenatally על-ידי ניתוח קיסרי או נוצרו אחרי הלידה. בממוצע, שיעורי ההישרדות לאחר זריקות תוך ורידי בטווח של 75-100%. שיעורי ההישרדות לאחר זריקות אינטרה-שפיר נוטים הוגן יותר זריקות תוך ורידי, בסביבות 85-100%.
במעבדה שלנו, תהליך ההכשרה להשגת מיומנות בטכניקות אלו לוקח כ- 8-12 חודשים...

אנו מתארים פרוטוקול לביצוע בתוך הרחם השתלת (דליה) דרך מסלולים תוך ורידי, אינטרה-שפיר של הזרקת במודל מאתר. פרוטוקול זה ניתן להציג תאים וקטורים ויראלי, חומרים אחרים לתוך לסביבה הייחודית של העובר החיסון-סובלנית.

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בעוברים, ריפוי גנטי והשתלת תאי גזע. יתרון לטכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח של ההשפעות של טיפולים ניסיוניים שונים על עוברי מורין. הדגמת הליך זה יהיו הרופאים ניקולס אן, וברברה קונס, רופאים ועמיתים מחקר במעבדה שלנו.לפני תחילת ההליך, טיפה חמש עד 10 microliters של PBS סטרילי לתוך ומחוץ קצה המחט כירורגית, פעמיים עד שלוש פעמים כדי לנקות אותו מכל פסולת אפשרית. הבא למלא את המחט עם reagent של עניין בנפח הניסוי המתאים וריכוז. ולחץ על כפתור המצב שלוש פעמים על מזרק מיקרו כדי להתקדם למסך כיול ההזרקה.הוסף מרווחי זמן של 10 או 100 אלפיות שניה כדי להתאים את זמן ההזרקה ולחץ על לחצן המצב פעמיים נוספות. לחץ על כפתור האיזון ולחץ על דוושת הרגל פעם אחת. לאחר מכן לחץ על הדוושה שוב ולהעריך איזה נפח של פתרון מתרוקן מתוך המחט לכל דחיפה.כאשר מזרק מיקרו מכויל לנפח הניסיוני המתאים, למלא את המחט לרמה הנכונה עבור הזריקה. כאשר כל המחטים נוקו, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן של העכבר הנשי בהריון חודשיים עד שישה חודשים. לגלח את הבטן, לדאוג לא לפגוע בפטמות, ולהעביר את החיה כרית חימום בתדר supine.החל משחה על העיניים של החיה ולאבטח את הגפיים על כרית החימום עם סרט הדבקה. ולחטא את העור החשוף. לאחר מכן להזריק הרדמה מקומית כגון 100 microliters של 0.25%Bupivacaine תת עורית.לאחר מכן, בצע חתך

intravenous-intra-amniotic-utero-transplantation-murine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation של E16 עוברים עכברוש

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation E15 של עוברי עכברים

בניתוח הישרדות ברחם אצל עכברים מאפשר מניפולציה המולקולרי של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים את השימוש בתדר גבוה הדמיה אולטרסאונד כדי להנחות את הזריקה של וקטורים retroviral לתוך המוח העכבר ביום עובריים (E) 9.5.

אולטרסאונד מונחה Microinjection לתוך forebrain העכבר בתוך הרחם ב E9.5

במודל עכבר של בתוך הרחם השתלה

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

העברת עובר ברחם, חצוצרות משתמשת בצומת הרחם-חצוצרות כמחסום כדי למנוע את יצוא העובר שעלול להתרחש בעת ביצוע העברה ברחם. זכרים שעוקרו נדרשים להשיג מקבלי pseudopregnant לעוברים. שני הטכניקות הם דנו.

העברת רחם-תובל עובר ועיקור במודל העכבר

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

פיתחנו מודל של chorioamnionitis כדי לדמות חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI) ללא סיבוכים של אורגניזמים חיים כדי לבחון את ההשפעות של FEMI על התפתחות מערכת העיכול של הצאצאים. זה מאפשר מחקר של סיבות מכניות להתפתחות של פגיעה במעיים בעקבות chorioamnionitis.

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להזריק לעכבר את חלל מי השפיר ב-E7.5 עם לנטי-וירוס, מה שמוביל להתמרה אחידה של כל הצלחת העצבית, עם השפעה מזיקה מינימלית על ההישרדות או ההתפתחות העוברית.

מיקוד צלחת עצבית מורין על ידי ננו-הזרקת רחם (NEPTUNE) ביום עוברי 7.5

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

למד השתלת בתוך הרחם בדרכים תוך ורידיות ואינטרה-שפיריות במודל עכברים. שיטה זו מאפשרת הזרקת תאים, וקטורים ויראליים וחומרים נוספים לסביבת העובר הסובלנית חיסונית לחקר תרפיות ניסיוניות.

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

גלה סרטונים נוספים