Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography
August 20th, 2018
הטכניקה myograph החוט משמש כדי לחקור פונקציות השריר החלק בכלי הדם, תרופות חדשות מסך. אנחנו מדווחים על פרוטוקול מפורט עבור מודדים את contractility איזומטרי של עורק מצע המעי העליון העכבר, הקרנת מרפה החדש של השריר החלק בכלי הדם.
המעבדה שלנו משתמשת בשיטת מיוגרף תיל למדידת התכווצות שרירים חלקים בכלי הדם במשך שנים רבות. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לחקור את מנגנון התכווצות השרירים החלקים. אנו משתמשים בשיטה זו כדי לחקור תרופות חדשות לטיפול ביתר לחץ דם.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שקטע הכלי שורד לפחות ארבע שעות לאחר ההרכבה ושומר על ההתכווצות הנגרמת על ידי אשלגן גבוה פעמים רבות. המערכת הרב-ערוצית נותנת הזדמנות להקרנה טיפולית גבוהה של תרופות חדשות. הצמד את גופו של העכבר שהומת כשבטנו פונה כלפי מעלה והרטיב את הבטן באתנול 70%.
לאחר מכן, לאחר שימוש במספריים כדי לחתוך את העור לאורך קו האמצע הגחוני מהמפשעה, בצע חתכים במורד כל רגל מתחילת החתך הראשון. משוך את העור לאחור משני הצדדים, ואז בצע חתכים דומים לפתיחת הצפק. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך את הוושט, המעי הגס ורקמות חיבור אחרות כדי לבודד לחלוטין את מערכת העיכול עם הזנת כלי דם מהגוף.
לאחר שטיפת הדם ממערכת העיכול עם HEPES-Tyrode, או תמיסת H-T, העבירו את המקטע המבודד לצלחת פטרי מצופה לדיסקציה של העורק המזנטרי בטמפרטורת החדר. החליקו את הקיבה, הג'ג'ונום, האילאום והצקום בכיוון השעון והצמידו את הקיבה והצקום בצד שמאל וימין בהתאמה. הפעל את מקור אור השידור של מיקרוסקופ סטריאוסקופי וקבע את המעי בעזרת סיכות כדי לחשוף את העורקים המזנטריים המנותחים.
לאחר מכן מהדקים את רקמות השומן סביב העורקים בעזרת מלקחיים ומבודדים בזהירות את העורקים על ידי ניתוק כל רקמות החיבור בעזרת מספריים לדיסקציה. אחוז בעורק עודף בעזרת מלקחיים והעביר וטבול את עץ העורק המזנטרי בתמיסת H-T קרה ללא יוני סידן. חתכו חלק של 1.4 מילימטר מהעורק הפרוקסימלי לדופן המעי של ארקייד מזנטרי והשתמשו בשני מלקחיים כדי לפתוח את שני צידי קטע העורק הזה בזהירות.
הכינו שני קטעי חוט נירוסטה באורך 2.5 סנטימטרים והניחו אותם באותה צלחת. השתמש במלקחיים כדי להדק בעדינות קצה אחד של העורק. לאחר מכן השתמש במלקחיים נוספים כדי להכניס בזהירות שני חוטים ללומן העורק בזה אחר זה.
ודא שהחוטים נשמרים ישרים ואינם נוגעים באנדותל. בעזרת שני מלקחיים, מהדקים את שני החוטים מחוץ לכלי הברגה בו זמנית ומעבירים בזהירות את הכלי מצלחת הפטרי לתא מיוגרף מלא בתמיסת H-T. הברג את לסתות החדר זו מזו כדי לפנות מקום להרכבה, ולאחר מכן אחוז בשני הצדדים של אחד משני החוטים המוכנסים באמצעות שני מלקחיים והנח את הכלי במרווח הלסת.
עטפו את שני צידי החוט המהודק סביב ברגי הלסת המחוברים למיקרומטר. תקן את הבורג בצד שמאל על ידי סיבוב בכיוון השעון. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי ליישר את החוט.
לאחר מכן, תקן את הבורג הימני על ידי סיבוב בכיוון השעון. ודא שהכלי נמצא תמיד בתוך מרווח הלסת אך אל תיגע בלסת כדי למנוע נזק. סגור את שתי הלסתות באמצעות המיקרומטר.
ודא ששתי הלסתות קרובות מספיק אך שהן לא נוגעות זו בזו, ושהחוט הלא קבוע נמצא על גבי החוט הקבוע. בעזרת המלקחיים הימניים, קפלו בזהירות את החוט הלא מוברג בפינת הלסת המחוברת למתמר כוח ועטפו אותו בכיוון השעון סביב הבורג הימני. לאחר מכן, תקן את הבורג.
חזור על הפתיחה והעטיפה של הצד השמאלי של החוט ותקן את הבורג בצד שמאל. לאחר מכן, הרחיקו מעט את הלסתות מבלי למתוח את הכלי על ידי סיבוב זהיר של המיקרומטר כך שהרווח בין שתי הלסתות יוכל להכיל את שני החוטים. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להזיז את החוט בצד המיקרומטר למישור האופקי של החוט בצד המתמר.
לאחר הרכבת עורקים בתאים האחרים, חבר את כל התאים לציוד וכסה את התאים. חבר את אספקת החמצן של 100% ובדיקת טמפרטורה והתחל לחמם ל-37 מעלות צלזיוס. פתח את תוכנת הגרפים.
לחץ על כפתור התחל כדי להתחיל בהקלטה. בחר את ערוץ העניין מתפריט DMT כדי לפתוח את חלון הנורמליזציה של DMT עבור הערוץ המתאים. הזן את הערכים הקבועים הבאים לחלון:נקודות קצה רקמות a1, 0.1; נקודות קצה של רקמות a2, 4; קוטר חוט, 40.
לאחר מכן החלון מציג את אורך הכלי המחושב כ-1.40 מילימטרים. קרא את המיקרומטר של תא הרקמות המתאים. הזן את הערך בתיבת הקריאה של המיקרומטר ולחץ על כפתור הוסף נקודה.
ערך זה הוא הערך ההתחלתי של X.לאחר עיכוב של 60 שניות, החלון מציג את הכוח ואת הלחץ האפקטיבי המתאים לערך מיקרומטר זה. במקביל, תיבת הקריאה של המיקרומטר הופכת לפעילה. מתחו את הכלי המנורמל על ידי סיבוב המיקרומטר נגד כיוון השעון.
הזן את ערך המיקרומטר בתיבת הקריאה של המיקרומטר ולחץ על כפתור הוסף נקודה. המתן שוב לזמן עיכוב של 60 שניות. המשך למתוח את הכלי ולהוסיף ערכי מיקרומטר עד שהחלון יציג את הערך של מיקרומטר X-one, שהיא הגדרת המיקרומטר המחושבת הנדרשת כדי למתוח את הכלי ל-IC-one שלו.
הגדר את המיקרומטר לערך X-one. לאחר הנורמליזציה, יש לאזן את הכלי בתא למשך 15 עד 20 דקות. לאחר שיווי המשקל, אתגר את הכלי בתמיסת אשלגן גבוהה על ידי החלפת תמיסת H-T ב-5 מיליליטר של תמיסת אשלגן גבוהה כדי לגרום להתכווצות למשך 10 דקות.
לאחר חזרה על הדגירה של 10 דקות בתמיסה טרייה עשירה באשלגן, יש לשטוף עם חמישה מיליליטר תמיסת H-T שלוש עד ארבע פעמים. שוב, אתגר את הכלי עם חמישה מיליליטר של תמיסת אשלגן גבוהה כדי לגרום להתכווצות. לאחר חמש דקות, הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Neoliensinine לתוך החדר כדי להרפות את הכלי בריכוז סופי של מיקרו-מולרי אחד Neoliensinine.
כאשר הכוח יציב לאחר מספר דקות, הוסף עוד 0.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי Neoliensinine כדי להגדיל את הריכוז לשתי מיקרומולר. הוסף מיקרוליטר אחד מתמיסת המלאי בכל פעם כדי להגדיל את הריכוז לארבעה, שישה, שמונה ו-10 מיקרומולר כדי ליצור את עקומת תגובת המינון. במהלך הליך הנורמליזציה, כלי השיט נמתח מספר פעמים עד שהגיע לערך של IC-100 וכל מחזור מתוח כלל התכווצות חזקה, הרפיה מהירה ותחזוקת כוח תוך 60 שניות.
התכווצות השריר החלק בכלי הדם הנגרמת על ידי תמיסת אשלגן גבוהה הראתה בדרך כלל שני שלבים, שלב חזק ושלב מתמשך. תיארנו שיטה למדידת התכווצות איזומטרית של עורק מזנטרי של עכבר באמצעות מערכת מיוגרף רב-חוטית. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את תפקודי השריר החלק בכלי הדם ולסנן מרפי שריר חלק.
ההבדל העיקרי בין שיטה זו לאחרות הוא בשלבי ההרכבה. שלב זה המשמש כאן קל לביצוע ואינו פוגע ברקמה או במכשיר. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש גם בממריצים אחרים כגון EP ואנגיוטנסין II כדי לעורר התכווצות שרירים חלקים על מנת למצוא כמה תרופות חדשות הרגישות לאגוניסט זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
טכניקת המיוגרף החוטי משמשת להערכת כושר ההתכווצות של השריר החלק הכלילי ולהסקרה של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנוני התכווצות השריר החלק והערכת תרופות חדשות ליתר לחץ דם.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- פיזיולוגיה כלילית
- פרמקולוגיה
- ביולוגיה של השריר החלק
רקע
- שיטת המיוגרף החוטי משמשת במשך שנים למדידת כושר ההתכווצות של השריר החלק הכלילי.
- שיטה זו מאפשרת את חקר מנגנוני התכווצות השריר החלק.
- היא מועילה במיוחד לחקר תרופות חדשות המכוונות לטיפול ביתר לחץ דם.
- קטע הכלי נותר חי לאחר הרכבה למספר שעות, תוך שמירה על יכולת ההתכווצות.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט למדידת ההתכווצות האיזומטרית של העורק המזנטרי של עכבר.
- להסקרה של מרחיבי חדשים לשריר החלק הכלילי.
- לשפר את ההבנה של תפקוד השריר החלק בהקשר של פיתוח תרופות.
שיטות בשימוש
- טכניקת המיוגרף החוטי למדידת ההתכווצות.
- הערכת ההתכווצות הנגרמת על ידי אשלגן גבוה.
- מערכת רב-ערוצית להסקרה של תרופות.
- הכנה של קטעי עורק מזנטרי של עכבר.
תוצאות עיקריות
- המיוגרף החוטי מאפשר את החיוניות הממושכת של קטעי הכלי.
- אשלגן גבוה מעורר באופן יעיל את ההתכווצות בשריר החלק.
- המערכת הרב-ערוצית מאפשרת את הסקרה של מספר תרופות בו זמנית.
- ניתן לזהות מרחיביים חדשים לשימוש טיפולי פוטנציאלי.
מסקנות
- המיוגרף החוטי הוא כלי חשוב לחקר תפקוד השריר החלק הכלילי.
- שיטה זו תומכת בזיהוי של סוכנים טיפוליים חדשים ליתר לחץ דם.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על פרוטוקול זה כדי לחקור עוד את הפרמקולוגיה של השריר החלק.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
The wire myograph technique enables precise measurement of vascular smooth muscle contractility, supporting target validation and mechanistic de-risking in hypertension drug discovery. By providing quantitative, reproducible force measurements in disease-relevant mouse mesenteric arteries, the method enhances predictive confidence for screening novel relaxants and assessing therapeutic potential early in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring isometric contraction in response to GPCR agonists, inhibitors, and depolarizing agents.
- Operational Value: Enables functional validation of vascular targets through dose-response analysis of compounds like neoliensinine.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (force tension) for assessing compound potency and efficacy.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility via normalization procedures and multi-channel capability for parallel compound testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant mouse mesenteric artery to model human vascular pathophysiology and assess translational biomarker alignment.
- Operational Value: Maintains vessel viability for ≥4 hours, enabling time-consuming screening campaigns and repeated contractility challenges.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing contractility data that informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating vascular smooth muscle responses to specific stimuli like high-K+ solution.
- Screening: Enables reliable compound evaluation through cumulative dosing and stable sustained phase measurements.
- Analytics: Delivers quantitative force readouts that allow comparison of drug effects across concentrations and conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical continuity by using genetically tractable mouse models of vascular disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing vascular function across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target engagement and reduces mechanistic ambiguity in smooth muscle pharmacology.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability via wire mounting and normalization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in hypertension programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on dose-dependent relaxant effects in vascular tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular dissection, wire myograph operation, and solution preparation.
- Dependent on myograph chambers, force transducers, micrometers, and temperature-controlled perfusion systems.
- Necessitates cross-team standardization of dissection, mounting, and normalization procedures for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different vessel sizes or species.
- Limited by the need for isolated tissue segments and the technical challenge of wire insertion without endothelial damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:55
Mouse Mesenteric Artery Dissection
2:26
Arterial Mounting
5:30
Normalization
7:03
Artery Contraction Recording
8:18
Results: Representative Tracings Showing the Normalization Procedure, Potentiation by High-K+ Solution, and Contraction
8:47
Conclusion
