אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידו של תחום קינאז מעורב פסאודו-קינאז או MLKL בנקרופטוזיס כגון טרנסלוקציה של ממברנה וחדירות בקשירת שומנים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מערבות ישירות את MLKL כמוציא לפועל של קרע בקרום הפלזמה בנקרופטוזיס. הדמיית תאים חיים חוללה מהפכה בתחום חקר מוות תאי, במיוחד עבור נקרופטוזיס בתיווך MLKL.

תהודה מגנטית גרעינית היא טכניקה רבת עוצמה לניטור קשירת שומנים לחלבונים כפי שמודגם כאן עבור MLKL. התחל בציפוי חמש פעמים 10 לפיברובלסטים עובריים של עכבר נוקאאוט MLKL או MEFs המבטאים את תחום המוציא להורג של MLKL מאוחה לקלטת אוליגומריזציה וונוס במיליליטר אחד של DMEM בתוספת צלחות של 24 בארות לדגירתם למשך הלילה בחממת תרבית תאים. למחרת בבוקר, טפל בתאים עם דוקסיציקלין במשך 12 שעות כדי לגרום לביטוי של הטרנסגן, ולאחר מכן תוספת של DMEM סטנדרטי בתוספת דימריזר חלבון קושר FK506 וצבע פלואורסצנטי ירוק אטום לממברנה כדי לגרום לנקרופטוזיס.

כדי לנטר את מוות התאים, הנח את הצלחת ביחידת הדמיה מתאימה הממוקמת באינקובטור תרבית רקמות יונקים ופתח את תוכנת מערכת ההדמיה. בחר בכרטיסייה תזמון סריקות קרובות ובחר את המגש, הכלי, סוגי הסריקה ותבנית הסריקה בכרטיסייה פריסה פיזית. בחר פלואורסצנטיות מהירה בכרטיסייה מאפיינים ולחץ על חלון ציר הזמן ועל המספר הכולל של נקודות זמן ותדירות הרכישה כדי להוסיף את זמן הסריקה.

לאחר מכן, לחץ על החל כדי להתחיל ברכישת התמונה. כדי לכמת את הנקרופטוזיס, בחר חלונית משימות ורחף עם סמן העכבר מעל הרקע של מספר תמונות כדי להגדיר את ספירת האובייקטים ניתוח חדש עם סף פילוח קבוע מעל רמת הרקע. לאחר מכן, בחר תצוגה מקדימה כדי לבחון את העצמים הפלואורסצנטיים בתמונה הנוכחית ולמקד את רמות הסף בהתאם לצורך.

ניתן לבצע בחירה קפדנית של הסף תוך התבוננות בבארות מרובות על הצלחת ושימוש בתכונת התצוגה המקדימה בתוכנה. רק שימו לב להשתמש באותה הגדרת סף עבור כל הבארות בצלחת. כדי לשלב את ספירת הקרינה הירוקה, תחת הכרטיסייה הפעל ניתוח חדש, בחר טווח זמן ואת הבארות שיש לנתח והזן את שם משימת הניתוח.

לאחר מכן, לחץ על אישור ולחץ פעמיים על שם המשימה כדי לייצא את הנתונים לניתוח נוסף בתוכנת גרפים מתאימה. לקשירת שומנים של ה-MLKL על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית או NMR, השתמש במזרקים אטומים כדי להקצות מיליגרם אחד למיליליטר של הפוספוליפידים המעניינים לבקבוקוני זכוכית נקיים לסדרת טיטרציה בודדת של NMR ולהניח את הבקבוקונים מתחת לזרם גזי של ארגון או חנקן למשך חמש עד 30 דקות. הוצאת שומנים מממיסים נדיפים כגון כלורופורם או מתנול חייבת להתבצע במהירות ממאגרים המוחזקים על קרח יבש על מנת למזער חוסר עקביות בריכוזי השומנים בין הדגימות עקב אידוי ממס.

בתום תקופת האידוי, השתמש בפינצטה גדולה כדי לסדר את הבקבוקונים בתחתית בקבוק בוכנר. אטמו את הבקבוק עם פקק גומי והצמידו צינורות פלסטיק המחוברים לקו ואקום כדי לפנות את תכולת הבקבוקון בוואקום עדין למשך הלילה כדי להסיר שאריות אורגניות. למחרת בבוקר, הוסף מאגר NMR בתוספת חומר ניקוי בריכוז הניסוי המתאים לכל בקבוקון זכוכית עם סרט שומני וסוניקציה של הבקבוקון באמבט מים למשך עד 30 דקות, תוך הפסקת הסוניקציה כל 10 דקות כדי לבדוק את המסה של סרט השומנים.

בתום הסוניקציה, הניחו לבקבוקונים להתקרר למשך 15 דקות ובצעו דילול סדרתי של מיצלות חומר הניקוי השומני במאגר NMR חיובי לחומר ניקוי, תוך סוניקציה של תערובות 1:1 לסדרת הריכוז הרצויה. הכן דגימות תמ"ג בקרה והתייחסות של חלבון ותוספים במאגרי NMR שליליים לחומרי ניקוי וחיוביים לדטרגנטים בהתאמה, הוספת חלבון ותוספים לכל דילול שומנים במאגר חיובי לחומרי ניקוי. לאחר מכן, העבירו את נפח הדגימות המתאים לצינורות NMR בגודל מתאים וטענו את הדגימות על מכשיר ה-NMR.

ניתן לצפות בנקרופטוזיס מלא של MEFs נוקאאוט MLKL תוך שעה אחת מאוליגומריזציה בתיווך דימר של תאים מודגרים מראש של דוקסיציקלין המבטאים את הטרנסגן המאוחד. נקרופטוזיס קינטי מהיר זה תומך בתפקידו של MLKL כמוציא לפועל המשוער של קרע בקרום הפלזמה, וכתוצאה מכך ייצור פונקטה של ונוס הקשורה לקרום פלזמה תוך דקה עד שתיים מהטיפול בקידוד הדימר וונוס של פריפריית התא ועיגול תאים הדרגתי תוך שתיים-שלוש דקות. תחת נקרופטוזיס מהיר, התאים משנים את המורפולוגיה מצורתם המוארכת הרגילה למעוגלת ונפוחה תוך חמש דקות מהאוליגומריזציה, נקרעים חלקית לאחר 10 דקות, ומפורקים באופן נרחב עם ציטוזול נעלם לאחר 20 דקות.

ניסויי קשירת שומנים במבחנה המנוטרים על ידי ספקטרוסקופיה NMR חושפים שינויים מבניים גדולים בחלבון תחום הביצוע MLKL בעת קשירת השומנים כדי לעקור את אזור הסד המעכב מה-N-helical הסגור לקונפורמציה הפתוחה והלא מסודרת באופן מהותי, כמו גם מידע לכל שאריות על תערובות של שני הקונפורמרים. ניתן גם לנטר את אחוזי הקונפורמרים הסגורים והפתוחים בדגימה נתונה, מה שמספק ראיות תומכות לאינטראקציה של תחום המוציא להורג MLKL עם פוספוליפידים ומרמז על קשר ישיר בין MLKL לקרום הפלזמה. אז בזמן שמנסים לכמת את מוות התאים באמצעות הליך זה, חשוב לדעת ולזכור שלצבע קושר ה-DNA יש פלואורסצנטיות סף גבוה יותר מאשר חלבון פלואורסצנטי המקודד גנטית בדרך כלל.

מסיבה זו, ניתן להשתמש בהם במקביל. שימו לב גם ששומנים מיסלריים רגישים לטמפרטורה ולכן ייתכן שיהיה צורך לייעל את טמפרטורת דגימת ה-NMR. אז בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקה אחרת כמו מיקרוסקופ השתקפות פנימית מלאה ואלקטרומיקרוסקופיה כדי לטפל באיזו מהירות מתרחשת קרע התאים בתאים שעוברים נקרופטוזיס והיכן הקרע ממוקם על קרום הפלזמה.

בנוסף, ניתן לבצע תרמופורזיסציה בקנה מידה מיקרו כדי לאמת אורתוגונלית את קשירת MLKL לליפידים מיסלריים. הטכניקות המתוארות בסרטון זה סללו את הדרך לחוקרים בתחום הנקרופטוזיס לחקור את תפקידו של MLKL כמוציא לפועל של קרע בקרום הפלזמה. אל תשכח שעבודה עם כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ועבודה באזור מאוורר היטב בעת ביצוע הליך זה.