Name: אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: חקור את תפקידו של MLKL בקרע קרום התא במהלך נקרופטוזה באמצעות מיקרוסקופיה חיה וספקטרוסקופיית NMR. שיטות אלו מאפשרות לחקור מנגנוני מוות תאי ואינטראקציות חלבון-ליפיד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development%2C+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3+mediates+the+embryonic+lethality+of+caspase-8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice.</a> Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudokinase+MLKL+mediates+necroptosis+via+a+molecular+switch+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism.</a> Immunity. 39 (3), 443-453 (2013).</li>
<li>Oberst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+activity+of+the+caspase-8-FLIP%28L%29+complex+inhibits+RIPK3-dependent+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis.</a> Nature. 471 (7338), 363-367 (2011).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+complementation+between+FADD+and+RIP1+in+embryos+and+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes.</a> Nature. 471 (7338), 373-376 (2011).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+necroptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the necroptotic pathway.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).</li>
<li>Newton, K., Manning, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26865533">Necroptosis and Inflammation.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 743-763 (2016).</li>
<li>Kaiser, W. J., Upton, J. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23773332">Viral modulation of programmed necrosis.</a> Current Opinion in Virology. 3 (3), 296-306 (2013).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27177019">RIPK3 deficiency or catalytically inactive RIPK1 provides greater benefit than MLKL deficiency in mouse models of inflammation and tissue injury.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (9), 1565-1576 (2016).</li>
<li>Kearney, C. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inflammatory+Perspective+on+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An Inflammatory Perspective on Necroptosis.</a> Molecular Cell. 65 (6), 965-973 (2017).</li>
<li>Pasparakis, M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25592536">Necroptosis and its role in inflammation.</a> Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (12), 587-593 (2014).</li>
<li>Grootjans, S., Vanden Berghe, T., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+execution+mechanisms+of+necroptosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Initiation and execution mechanisms of necroptosis: an overview.</a> Cell Death & Differentiation. 24 (7), 1184-1195 (2017).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+MLKL+causes+necrotic+membrane+disruption+upon+phosphorylation+by+RIP3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3.</a> Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 55-65 (2014).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Dillon, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+blocks+early+postnatal+lethality+mediated+by+caspase-8+and+RIPK3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3.</a> Cell. 157 (5), 1189-1202 (2014).</li>
<li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3-mediated+necrosis+via+TRIF%2C+RIP3%2C+and+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF, RIP3, and MLKL.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (43), 31268-31279 (2013).</li>
<li>Upton, J. W., Kaiser, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAI+Another+Way%3A+Necroptotic+Control+of+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">DAI Another Way: Necroptotic Control of Viral Infection.</a> Cell Host & Microbe. 21 (3), 290-293 (2017).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+signalling+is+tuned+by+phosphorylation+of+MLKL+residues+outside+the+pseudokinase+domain+activation+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Necroptosis signalling is tuned by phosphorylation of MLKL residues outside the pseudokinase domain activation loop.</a> Biochemical Journal. 471 (2), 255-265 (2015).</li>
<li>Quarato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+Engagement+of+Distinct+MLKL+Phosphatidylinositol-Binding+Sites+Executes+Necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential Engagement of Distinct MLKL Phosphatidylinositol-Binding Sites Executes Necroptosis.</a> Molecular Cell. 61 (4), 589-601 (2016).</li>
<li>Davies, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brace+helices+of+MLKL+mediate+interdomain+communication+and+oligomerisation+to+regulate+cell+death+by+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The brace helices of MLKL mediate interdomain communication and oligomerisation to regulate cell death by necroptosis.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plug+release+mechanism+for+membrane+permeation+by+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A plug release mechanism for membrane permeation by MLKL.</a> Structure. 22 (10), 1489-1500 (2014).</li>
<li>Dondelinger, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+compromises+plasma+membrane+integrity+by+binding+to+phosphatidylinositol+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MLKL compromises plasma membrane integrity by binding to phosphatidylinositol phosphates.</a> Cell Reports. 7 (4), 971-981 (2014).</li>
<li>Llambi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOK+Is+a+Non-canonical+BCL-2+Family+Effector+of+Apoptosis+Regulated+by+ER-Associated+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BOK Is a Non-canonical BCL-2 Family Effector of Apoptosis Regulated by ER-Associated Degradation.</a> Cell. 165 (2), 421-433 (2016).</li>
<li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+secrets+of+fluorescent+proteins%3A+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586(2011).</li>
<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated%2C+selectively+%5B1H%2C13C%5D-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li>
<li>Keller, R. <a target="_blank" href="http://cara.nmr-software.org/downloads/3-85600-112-3.pdf">The computer aided resonance assignment tutorial.</a> Cantina Verlag. , (2004).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+%28RIP3%29+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+%28MLKL%29+interaction+in+necroptotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li>
</ol>

אנו מספקים פרוטוקולים טכניקות שילבנו ל ערבו MLKL כמו המוציא בשם של קרום פלזמה קרע24. בנוסף לפענח את רשת גנטית המווסת בתיווך MLKL necroptosis, שיטות אלה ניתן באופן עצמאי לאפיון מערכות ביולוגיות מתאימים אחרים. מבחינה מעשית, טכניקות אלה הן כלי גילוי בינונית-נמוכה תפוקה.
באופן שגרתי השתמשנו הדמיה לחיות תאים של NBB140-2xFV-ונוס-לתווך necroptosis, וכי המושרה על ידי בונה MLKL אחרים, לנתח mechanistically ברגולציה של MLKL ב necroptosis דרך מוטגנזה מכוונת ועל -ידי שימו...

זיהוי רכיבים גנטיים של necroptosis הנחתה את השימוש במודלים לבחון את ההשלכה של necroptosis פיסיולוגיה ומחלות1,2,3,4,5. נוקאאוט של RIPK3 או MLKL בעכברים הייתה מינימלית במשתמע הומאוסטזיס מבוגר ופיתוח רומז ש-necroptosis זו אינה חיונית עבור החיים3,6. יתר על כן, מינים מסוימים אינם מכילים גנים או RIPK3 או MLKL, תומך את תפקיד שאינם חיוניים necroptosis של בעלי חיים7,8. מצד שני, מאתגר חייתיים נוקאאוט עם פתולוגיות שונות המושרה במעבדה חשף תפקיד חשוב של necroptosis דלקת, מולדת חסינות, זיהום נגיפי9,10, 11 , 12.
Necroptosis יכול להיות מופעל במספר דרכים על-ידי איתות באמצעות חיישנים שונים מולדת חסינות, כל אילו התוצאה הפעלת13,1,RIPK314. RIPK3 פעיל phosphorylates בתורו ומפעיל MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. למד ביותר, אולי הדרך המורכבים ביותר, שמוביל הפעלה של RIPK3 כרוך מוות קולטן מצדו, אשר bifurcates מבוסס על הרכב במורד הזרם של מתחמי איתות לזירוז או אפופטוזיס או necroptosis1. Necroptosis מתפתח כאשר איתות באמצעות RIPK1 הוא המועדף ותוצאות האירוסין של RIPK319,20. התוצאה היא חביבה עליהם בקלות על עיכוב תרופתי או מחיקה גנטי של קספאז 8, מעכב אנדוגני בשם של necroptosis שמחזיק necroptosis במפרץ. RIPK1 נקשר ומפעיל RIPK3. דרך נוספת להפעיל את necroptosis היא דרך רצפטורים כמו אגרה TLR3/TLR4 איתות, אשר עוסקת ומפעיל RIPK3 דרך טיר-תחום-המכיל בתדר מתאם אינטרפרון-β (TRIF)21. עוד דרך נוספת למות על ידי necroptosis היא על-ידי הפעלת את חיישן ה-DNA דאי, אשר עוסקת ישירות ומפעיל RIPK322.
MLKL הוא חלבון cytosolic מורכב תחום bundle (NB) החורש N-מסוף, תחום pseudokinase C-מסוף (psKD) מקושרים על ידי אזור רגולטוריות מסולסל3. בתאים נורמליים, MLKL נמצא את ציטוזול שבו הוא חשב להיות קומפלקס לא פעיל עם RIPK314. הפעלה של necroptosis מפעיל זרחון RIPK3 של MLKL בתמונה ההפעלה של psKD, וכן אתרים נוספים שעלולים NB ו הסד3,15,23. זרחון גורם בשינוי הסתגלותי MLKL שתוצאתו דיסוציאציה מ RIPK314. ממעטים להבין שינויים הסתגלותי לשחרר את הסוגר המסולסל מ- psKD24. הסוגר, אשר מכיל את 2 helices, ומתווך oligomerization של MLKL לתוך trimer בשם דרך סליל C-מסוף25. הסליל N-מסוף הסוגר מעכב את התחום NB, אשר חיוני ממברנה permeabilization24,26. בבידוד, תחום NB מספיקה לגרום permeabilization קרום פלזמה ו-24,necroptosis16,27. פעילות פרו-necroptotic של NB הוקמה מחדש העכבר מתחלקים fibroblasts בנכונותם MLKL (mlkl- / - MEFs). NB הוא תחום הכריכה השומנים העוסק מעדיפים את diphosphate phosphatidylinositol 4.5 פוספוליפיד (פיפ2). אנחנו הציע מנגנון stepwise של ההפעלה של MLKL, שבו מסולסל oligomerization מקלה על גיוס של MLKL את קרום פלזמה דרך אינטראקציות החלש של NB עם קבוצה ראש קוטב2 24פיפ. -הקרום, NB עובר מוסדר חשיפה של אתר קשירה גבוהה-זיקה נוספים פיפ2, אשר מוסווה על ידי הסוגר המסולסל ב MLKL לא פעיל. בסך הכל, האינטראקציות מרובים של NB עם פיפ2 יציבות קרום פלזמה המוביל שלה קרע, למרות המנגנון המולקולרי של אירועים אלה לא הובהר.
כאן אנו ממחישים שיטות ספציפיות שימוש כדי לאפיין את הפונקציה של MLKL כמו המוציא להורג של necroptosis24. בפרט, אנו מתמקדים התחום הכי מזערי של MLKL, NB ו הסד (NBB), אשר מווסת על ידי עיכוב הסד והוא יכול להיות מופעל דרך dimerization שנאכפת לזירוז necroptosis ולמסמנים של קרום פלזמה. נתאר מערכת ביטוי inducible שלנו בשילוב עם שנאכפת שיכרון בתיווך FKBP dimerization עבור הדמיה לחיות תאים, ואלקטרון מיקרוסקופי של תאים שעברו necroptosis. בנוסף, אנו ממחישים את הניתוח שלנו במבחנה NMR של האינטראקציות של NBB עם phosphatidylinositols (פיפס).

<table><tbody><tr><td>שיבוט ויצירת קו תאים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transactivator פלסמיד</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td><חזק>כימות מוות תאים ומיקרוסקופיה של תאים חיים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>קלונטק</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B Homodimerizer AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td><חזק>NMR</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N אמוניום כלוריד</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג'</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Deuterated DTT</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (מוח, חזיר) (מלח אמוניום)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (מלח אמוניום) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (מלח אמוניום) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR או ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>הדמיית מיקרוסקופיה של תאים חיים</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Electron microscope</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>ניתוח הדמיה</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>https://www.fei.com/software/maps/ EM ניתוח</td></tr><tr><td>TopSpin v3.2</td><td>Bruker BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td><td>איסוף נתוני NMR</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>ניתוח נתוני תמ"ג</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (חידושי הדמיה חכמים)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>מיקרוסקופיה קונפוקלית</td></tr></tbody></table>

אפיון של קרום פלזמה בתיווך mlkl קרע necroptosis

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis הוא שביל מוות תאים מתוכנת המופעלות על-ידי הפעלה של קולטן אינטראקציה קינאז 3 (RIPK3), אשר phosphorylates ומפעיל את שושלת היוחסין מעורב קינאז כמו תחום pseudokinase, MLKL, קרע או permeabilize קרום פלזמה . Necroptosis הוא מסלול דלקתיות המשויך פתולוגיות מרובות, כולל מחלת חיסון עצמי, זיהומיות ומחלות לב וכלי דם, שבץ מוחי, הקשורים ניוון מוחיים של סרטן. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים יכול לשמש כדי לאפיין MLKL כמו המוציא של קרום פלזמה קרע necroptosis. עלינו לדמיין את התהליך של necroptosis תאים באמצעות הדמיה לחיות תאים עם מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי פלורסצנטיות, וכן תאים קבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, אשר יחד חשף הפצה מחדש של MLKL מ ציטוזול כדי פלזמה ממברנה לפני אינדוקציה של חורים גדולים קרום הפלזמה. אנו מציגים במבחנה תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח באמצעות ליפידים לזיהוי מאפננים בשם של necroptosis בתיווך MLKL. מבוסס על שיטה זו, אנו מזוהות phosphatidyl-אינוזיטול מלחי (פיפס) ונותנת השומנים מחייב כמותיים קלסרים קריטי של MLKL הנדרשים עבור מיקוד קרום פלזמה ו permeabilization ב necroptosis.

להמחיש necroptosis מוסדרים ביצוע בתאים חיים היה אפשר דרך ביטוי inducible של מבנה MLKL קטום מינימלית, NBB140-2xFV-ונוס. את המבנה הזה, שומר על היכולת לגרום permeabilization קרום פלזמה, מופעל באמצעות דים-induced oligomerization בקלטת FKBP (2xFV). עלינו להתבונן, לכמת necroptosis על ידי מיקרוסקופ לחיות תאים הדמיה, ניטור kinetically (כל 5 דקות) ספיגת של צבע הכריכה DNA פלורסצנטיות ירוק אטום (איור 6א) תא. מערכת inducible זו הוא מאוד חזקים,...

. מדווחים שיטות אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע necroptosis כולל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי לחיות תאים הדמיה, סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים, ואיגוד מבוסס-NMR השומנים.

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידו של תחום קינאז מעורב פסאודו-קינאז או MLKL בנקרופטוזיס כגון טרנסלוקציה של ממברנה וחדירות בקשירת שומנים. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מערבות ישירות את MLKL כמוציא לפועל של קרע בקרום הפלזמה בנקרופטוזיס. הדמיית תאים חיים חוללה מהפכה בתחום חקר מוות תאי, במיוחד עבור נקרופטוזיס בתיווך MLKL.תהודה מגנטית גרעינית היא טכניקה רבת עוצמה לניטור קשירת שומנים לחלבונים כפי שמודגם כאן עבור MLKL. התחל בציפוי חמש פעמים 10 לפיברובלסטים עובריים של עכבר נוקאאוט MLKL או MEFs המבטאים את תחום המוציא להורג של MLKL מאוחה לקלטת אוליגומריזציה וונוס במיליליטר אחד של DMEM בתוספת צלחות של 24 בארות לדגירתם למשך הלילה בחממת תרבית תאים. למחרת בבוקר, טפל בתאים עם דוקסיציקלין במשך 12 שעות כדי לגרום לביטוי של הטרנסגן, ולאחר מכן תוספת של DMEM סטנדרטי בתוספת דימריזר חלבון קושר FK506 וצבע פלואורסצנטי ירוק אטום לממברנה כדי לגרום לנקרופטוזיס.כדי לנטר את מוות התאים, הנח את הצלחת ביחידת הדמיה מתאימה הממוקמת באינקובטור תרבית רקמות יונקים ופתח את תוכנת מערכת ההדמיה. בחר בכרטיסייה תזמון סריקות קרובות ובחר את המגש, הכלי, סוגי הסריקה ותבנית הסריקה בכרטיסייה פריסה פיזית. בחר פלואורסצנטיות מהירה בכרטיסייה מאפיינים ולחץ על חלון ציר הזמן ועל המספר הכולל של נקודות זמן ותדירות הרכישה כדי להוסיף את זמן הסריקה.לאחר מכן, לחץ על החל כדי להתחיל ברכישת התמונה. כדי לכמת את הנקרופטוזיס, בחר חלונית משימות ורחף עם סמן העכבר מעל הרקע של מספר תמונות כדי להגדיר את ספירת האובייקטים ניתוח חדש עם סף פילוח קבוע מעל רמת הרקע. לאחר מכן, בחר תצוגה מקדימה כדי לבחון את העצמים הפלואורסצנטיים בתמונה הנוכחית ולמקד את רמות הסף בהתאם לצורך.ניתן לבצע בחירה קפדנית של הסף תוך התבוננות בבארות מרובות על הצלחת ושימוש בתכונת התצוגה המקדימה בתוכנה. רק שימו לב להשתמש באותה הגדרת סף עבור כל הבארות בצלחת. כדי לשלב את ספירת הקרינה הירוקה, תחת הכרטיסייה הפעל ניתוח חדש, בחר טווח זמן ואת הבארות שיש לנתח והזן את שם משימת הניתוח.לאחר מכן, לחץ על אישור ולחץ פעמיים על שם המשימה כדי לייצא את הנתונים לניתוח נוסף בתוכנת גרפים מתאימה. לקשירת שומנים של ה-MLKL על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית או NMR, השתמש במזרקים אטומים כדי להקצות מיליגרם אחד למיליליטר של הפוספוליפידים המעניינים לבקבוקוני זכוכית נקיים לסדרת טיטרציה בודדת של NMR ולהניח את הבקבוקונים מתחת לזרם גזי של ארגון או חנקן למשך חמש עד 30 דקות. הוצאת שומנים מממיסים נדיפים כגון כלורופורם או מתנול חייבת להתבצע במהירות ממאגרים המוחזקים על קרח יבש על מנת למזער חוסר עקביות בריכוזי השומנים בין הדגימות עקב אידוי ממס.בתום תקופת האידוי, השתמש בפינצטה גדולה כדי לסדר את הבקבוקונים בתחתית בקבוק בוכנר. אטמו את הבקבוק עם פקק גומי והצמידו צינורות פלסטיק המחוברים לקו ואקום כדי לפנות את תכולת הבקבוקון בוואקום עדין למשך הלילה כדי להסיר שאריות אורגניות. למחרת בבוקר, הוסף מאגר NMR בתוספת חומר ניקוי בריכוז הניסוי המתאים לכל בקבוקון זכוכית עם סרט שומני וסוניקציה של הבקבוקון באמבט מים למשך עד 30 דקות, תוך הפסקת הסוניקציה כל 10 דקות כדי לבדוק את המסה של סרט השומנים.בתום הסוניקציה, הניחו לבקבוקונים להתקרר למשך 15 דקות ובצעו דילול סדרתי של מיצלות חומר הניקוי השומני במאגר NMR חיובי לחומר ניקוי, תוך סוניקציה של תערובות 1:1 לסדרת הריכוז הרצויה. הכן דגימות תמ"ג בקרה והתייחסות של חלבון ותוספים במאגרי NMR שליליים לחומרי ניקוי וחיוביים לדטרגנטים בהתאמה, הוספת חלבון ותוספים לכל דילול שומנים במאגר חיובי לחומרי ניקוי. לאחר מכן, העבירו את נפח הדגימות המתאים לצינורות NMR בגודל מתאים וטענו את הדגימות על מכשיר ה-NMR.ניתן לצפות בנקרופטוזיס מלא של MEFs נוקאאוט MLKL תוך שעה אחת מאוליגומריזציה בתיווך דימר של תאים מודגרים מראש של דוקסיציקלין המבטאים את הטרנסגן המאוחד. נקרופטוזיס קינטי מהיר זה תומך בתפקידו של MLKL כמוציא לפועל המשוער של קרע בקרום הפלזמה, וכתוצאה מכך ייצור פונקטה של ונוס הקשורה לקרום פלזמה תוך דקה עד שתיים מהטיפול בקידוד הדימר וונוס של פריפריית התא ועיגול תאים הדרגתי תוך שתיים-שלוש דקות. תחת נקרופטוזיס מהיר, התאים משנים את המורפולוגיה מצורתם המוארכת הרגילה למעוגלת ונפוחה תוך חמש דקות מהאוליגומריזציה, נקרעים חלקית לאחר 10 דקות, ומפורקים באופן נרחב עם ציטוזול נעלם לאחר 20 דקות.ניסויי קשירת שומנים במבחנה המנוטרים על ידי ספקטרוסקופיה NMR חושפים שינויים מבניים גדולים בחלבון תחום הביצוע MLKL בעת קשירת השומנים כדי לעקור את אזור הסד המעכב מה-N-helical הסגור לקונפורמציה הפתוחה והלא מסודרת באופן מהותי, כמו גם מידע לכל שאריות על תערובות של שני הקונפורמרים. ניתן גם לנטר את אחוזי הקונפורמרים הסגורים והפתוחים בדגימה נתונה, מה שמספק ראיות תומכות לאינטראקציה של תחום המוציא להורג MLKL עם פוספוליפידים ומרמז על קשר ישיר בין MLKL לקרום הפלזמה. אז בזמן שמנסים לכמת את מוות התאים באמצעות הליך זה, חשוב לדעת ולזכור שלצבע קושר ה-DNA יש פלואורסצנטיות סף גבוה יותר מאשר חלבון פלואורסצנטי המקודד גנטית בדרך כלל.מסיבה זו, ניתן להשתמש בהם במקביל. שימו לב גם ששומנים מיסלריים רגישים לטמפרטורה ולכן ייתכן שיהיה צורך לייעל את טמפרטורת דגימת ה-NMR. אז בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקה אחרת כמו מיקרוסקופ השתקפות פנימית מלאה ואלקטרומיקרוסקופיה כדי לטפל באיזו מהירות מתרחשת קרע התאים בתאים שעוברים נקרופטוזיס והיכן הקרע ממוקם על קרום הפלזמה.בנוסף, ניתן לבצע תרמופורזיסציה בקנה מידה מיקרו כדי לאמת אורתוגונלית את קשירת MLKL לליפידים מיסלריים. הטכניקות המתוארות בסרטון זה סללו את הדרך לחוקרים בתחום הנקרופטוזיס לחקור את תפקידו של MLKL כמוציא לפועל של קרע בקרום הפלזמה. אל תשכח שעבודה עם כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ועבודה באזור מאוורר היטב בעת ביצוע הליך זה.

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת אירועי איתות תוך-תאיים המושרים בתאים ברי קיימא על ידי אינטראקציה פיזית עם תאים מתים או גוססים סמוכים. הפרוטוקול מתמקד באירועי איתות המושרים על ידי זיהוי בתיווך קולטנים של התאים המתים, בניגוד לספיגה הפגוציטית שלהם או שחרור של מתווכים מסיסים.

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

הגברת אות טירמיד במהלך צביעה אימונופלואורסצנטית מאפשרת זיהוי רגיש של RIPK3 ו-MLKL שעברו זרחון במהלך נקרופטוזיס הנגרם על-ידי ZBP1 לאחר זיהום ב-HSV-1.

הגברת אות טירמיד להכתמה אימונופלואורסצנטית של זרחון תלוי ZBP1 של RIPK3 ו- MLKL לאחר זיהום HSV-1 בתאים אנושיים

פרוטוקול זה מבוסס על LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה כדי לנתח צביעה כפולה של Annexin V ו-7-AAD כדי לזהות מוות תאי, תוך שימוש בתא כולו ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לצפות במורפולוגיה של קרום התא.

LPS ומוות כתוצאה מ-ATP של מקרופאגים THP-1 ממוינים ב-PMA ותיקופו

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים לניטור חדירות הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס, תוך שימוש בבדיקות פלואורסצנטיות המזהות שינויים בשלמות הממברנה הליזוזומלית והחמצתה.

הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

אנו מתארים כיצד למדוד ליד קרום והעולמית הדינמיקה סידן תוך תאי בתרבית בתוך האסטרוציטים באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת מיקרוסקופיה epifluorescence.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לכמת את טרנסלוקציה של GLUT4 מן הציטופלסמה אל קרום התא של תאים על ידי cytometry הזרימה.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

חקור את תפקידו של MLKL בקרע קרום התא במהלך נקרופטוזה באמצעות מיקרוסקופיה חיה וספקטרוסקופיית NMR. שיטות אלו מאפשרות לחקור מנגנוני מוות תאי ואינטראקציות חלבון-ליפיד.

אפיון של קרום פלזמה בתיווך MLKL קרע Necroptosis

גלה סרטונים נוספים