מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק טכניקה רגישה למדידת פעילות מיטופגיה תאית באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן אנו מדגימים כי שיטה זו שימשה בהצלחה כדי להעריך את העלייה הדרמטית במיטופאגיה של תאי HeLa, לאחר טיפול ב-CCCP, מנתק מיטוכונדריאלי. טכניקה זו מאפשרת למדוד את פעילות המיטופאג' במהירות ובקלות רבה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד ברגישות את פעילות המיטופאג' בתאים חיים ללא כל צביעה נוספת. לכן, טכניקה זו תוכל בסופו של דבר לסייע בהבנת המנגנון והתפקיד הפיזיולוגי של מיטופאג'. המדגימים את ההליך יהיו ג'י-היון אום ויאנג יון קים מהמעבדה שלי.

התחל הליך זה על ידי הכנת mt-Keima, וירוס Keima lentivirus המכוון למיטוכונדריה. זרעים ראשונים HEK293T תאים בצלחת תרבית מצופה פולי-ליזין ותרבית אותם ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה למשך יום אחד. למחרת יש להעביר תאי HEK293T עם DNA לנטי-ויראלי mt-Keima ואריזת DNase באמצעות מגיב טרנספקציה בהתאם להוראות היצרן.

לאחר שמונה שעות של טרנספקציה הסר את אמצעי הטרנספקציה והוסף שמונה מיליליטר של מדיה טרייה. אסוף את המדיה המכילה חלקיקים נגיפיים 48 שעות לאחר מכן והסר פסולת תאית על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, סנן את המדיה המכילה וירוסים עם מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.

צלחת תאי HeLa-Parkin בצלחת תרבית של 60 מילימטר יום אחד לפני קצירת ה-mt-Keima lentivirus ותרבית את התאים עם ארבעה מיליליטר של מצע גידול למשך יום אחד ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור. למחרת, הסירו את מצע הגידול, הוסיפו מילימטר אחד של מצע וירוס mt-Keima, הוסיפו עוד שני מיליליטר של מצע גידול המכיל 3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פוליברן, ודגרו על התאים למשך יום אחד באינקובטור CO2. לאחר 24 שעות לאחר ההדבקה, יש להסיר את אמצעי הווירוס, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהוסיף ארבעה מיליליטר של מצע גדילה.

להסרת תאים לא נגועים יש לטפל בתאים במשך יומיים עם שני מיקרוגרם למיקרוליטר פורומיצין. הכן מדיה טרייה המכילה 10 CCCP מיקרו-מולרי. הסר את המדיה המתורבתת והוסף ארבעה מיליליטר של מצע גידול טרי המכיל CCCP.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 למשך שש שעות. הסר את מצע הגידול ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS. נתק את התאים על ידי טיפול בתמיסת טריפסין EDTA.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשעהם אותם מחדש במיליליטר אחד של PBS. העבירו את התאים בצינור FACS והניחו אותם על קרח. עבור ציטומטריית זרימה הפעל את ציטומטר הזרימה והפעל את תוכנת הניתוח.

צור ניסוי חדש ובחר BV605 עבור הלייזר הסגול ו-PE-CF594 עבור הלייזר הצהוב-ירוק בחלון הפרמטרים. ראשית יש להריץ דגימת ביקורת של תאים שאינם נגועים ב-mt-Keima lentivirus. בתרשים של פיזור קדימה לעומת פיזור צדדי צייר שער, באמצעות סמל המצולע, סביב התאים החיים וחסל תאים מתים ופסולת תאים.

לאחר מכן הפעל תאי HeLa-Parkin הנגועים ב-mt-Keima lentivirus. בתרשים הנקודות של BV605 לעומת פיזור צד התאם את המתח כך שתאי HeLa-Parkin המבטאים mt-Keima נבדלים בבירור מתאי בקרה שאינם מבטאים mt-Keima. הבא בתרשים הנקודות של PE-CF594 לעומת פיזור צד התאם את המתח כך שתאי HeLa-Parkin המבטאים mt-Keima נבדלים בבירור מתאי הבקרה.

לאחר מכן, בתרשים הנקודות של BV605 לעומת PE-CF594, בחר את אוכלוסיית התאים החיוביים ל-mt-Keima על ידי ציור שער באמצעות סמל המצולע. לאחר מכן, צור תרשים נקודות נוסף של BV605 לעומת PE-CF594 המציג רק תאים מגודרים mt-Keima. בתרשים נקודות זה, צייר שער סביב תאים חיוביים mt-Keima לא מטופלים.

שער זה מכונה השער הנמוך. לאחר מכן צייר שער נוסף המכיל את האזור שמעל השער הנמוך. שער זה מכונה השער הגבוה מכיוון שהוא מכיל תאים בעלי פעילות מיטופגיה גבוהה.

לאחר מכן בחר בתפריט הצג היררכיית אוכלוסייה. אחוז ערך ההורה מייצג את אחוז התאים בשער הגבוה בקרב האוכלוסייה החיובית ל-mt-Keima. כעת הריצו כל דגימה והקליטו לפחות 10,000 אירועים בשער העצירה של הר קיימה.

ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי HeLa לא מטופלים המבטאים mt-Keima הראה רמת מיטופגיה נמוכה. טיפול CCCP גרם לעלייה דרמטית בתאי מיטופגיה בשער הגבוה. אחוז תאי המיטופאגיה גדל ביותר מפי 10 לאחר שש שעות לאחר הטיפול ב-CCCP.

עלייה זו במיטופאגיה על ידי טיפול CCCP בוטלה לחלוטין על ידי טיפול משולב עם בפילומיצין A.ברגע שהתאים המבטאים מיטו-קיימה מוכנים, ניתן לבצע מדידת מיטופאג' באמצעות זרימה ציטומטרית תוך שעה אם היא מוכנה כראוי. לניתוח מיטופאג 'מדויק על ידי ציטומטריית זרימה חשוב להגדיר את השערים הגבוהים והנמוכים הנכונים. בעת ניתוח סוגים חדשים של תאים יש צורך להשתמש בתאים ידועים כמו תאי HeLa כבקרה.

בנוסף, חשוב לזכור כי יש לאשר את המיטופאג' באופן מלא על ידי מאפיינים נוספים כגון ירידה בחלבון המיטוכונדריאלי והפחתה ב-DNA המיטוכונדריאלי. ניתן ליישם טכניקה זו על מגוון רחב של סוגי תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח מיטופאג 'על ידי ציטומטריית זרימה.