Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה
7 בספטמבר 2018
שיטה correlative מיקרוסקופ אלקטרונים אור (קלם) מוחל על התמונה הנוצרות על-ידי וירוס תאיים מבנים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) בתאים שנבחרו קודם לכן על ידי מיקרוסקופ אור (LM). באימות LM ו- EM משולבים כמו בגישה הדמיה היברידי להשיג תצלום המשולב של וירוס-פונדקאי אינטראקציות.
שיטה זו עוזרת לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה לגבי האופן שבו ביו-חלבונים שנמצאים בממברנות התא יוצרים סביבות המעדיפות שכפול והרכבה ביולוגית. שתי אבני היסוד הטכניות המשולבות כאן הן ראשית, המתאם בין הדמיית תאים חיים למיקרוסקופ אלקטרונים, ושנית, הקפאה בלחץ גבוה. למרות ששיטה זו תוכננה ושימשה בהצלחה להתמודדות עם אינטראקציות עם מקורות וירוסים, ניתן להכליל אותה בקלות למגוון יישומים בביולוגיה של התא. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שישנם שלבים רבים הדורשים ניסיון מעשי בהצלחה, במיוחד קריו-אימוביליזציה על ידי הקפאה בלחץ גבוה והשלבים הבאים. התחל בהנחת דיסקיות ספיר בדוגמת דפוס אלפאנומרי חרוט על אחד ממשטחיהם לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר, ושטיפת הדיסקים היטב באתנול. מניחים את דיסקיות הספיר השטופות בכלי פטרי מרופד בנייר פילטר לייבוש, והשתמשו בפינצטה ארוכה ודקה כדי להעביר את דיסקיות הספיר המיובשות על שקופיות זכוכית. באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 4, ודא שתבנית הקואורדינטות בכל דיסק ספיר ניתנת לקריאה. לאחר מכן, עקרו את הדיסקים בעזרת קישור אולטרה סגול למשך חמש דקות. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו מחצית ממדיום תרבית התאים לצלחת תרבית תאים, והשתמשו בפינצטה ארוכה כדי להעביר בזהירות את דיסקיות הספיר לתוך הצלחת. לאחר מכן, זרע 1x10
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית-אורית קורלטיבית (CLEM) להדמיה של מבנים תוך-תאיים המושרים על ידי נגיפים. באמצעות שילוב של מיקרוסקופיה אורית (LM) ומיקרוסקופיה אלקטרונית (EM), חוקרים יכולים להפיק תובנות לגבי אינטראקציות בין נגיף למארח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
- אינטראקציות וירוס-מארח
רקע
- השיטה משלבת דימוי של תאים חיים עם מיקרוסקופיה אלקטרונית.
- הקפאה בלחץ גבוה היא מרכיב קריטי בטכניקה.
- היא יושמה בהצלחה לחקר אינטראקציות של נגיפים.
- ניתן להכליל את השיטה ליישומים שונים בביולוגיה של התא.
מטרת המחקר
- להדמיית מבנים המושרים על ידי וירוסים בתאים.
- להעמקת ההבנה של אינטראקציות בין חלבונים ביולוגיים בממברנות תאיות.
- לספק מדריך מעשי לחוקרים המשתמשים בשיטה זו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דיסקיות ספיר תבניתיות לצילום.
- שימוש במיקרוסקופיה הפוכה לאישור התבנית.
- סטריליזציה של הדיסקיות באמצעות קשירה צולבת בעזרת אור על-סגול.
- טכניקות תרבית תאים לזריעת תאים על דיסקיות ספיר.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של מבנים תוך-תאיים המושרים על ידי נגיף.
- הדגמת יעילותה של שיטת ה-CLEM בחקר אינטראקציות בין נגיף למארח.
- פירוט של שלבים מעשיים ליישום השיטה.
- יישומים פוטנציאליים בהקשרים רחבים יותר של ביולוגיה של התא.
מסקנות
- שיטת ה-CLEM מספקת תובנות בעלות ערך לגבי ביולוגיה של נגיפים.
- היא מגשרת על הפער שבין מיקרוסקופיה של אור למיקרוסקופיה אלקטרונית.
- מומלץ להרחיב את היישומים של השיטה בביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
מיקרוסקופיה אלקטרונית-אורית קורלטיבית (CLEM) נותנת מענה לבקבוק צוואר קריטי במחקר וירולוגי על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח ממוקד של אוכלוסיות נדירות של תאים שעברו טרנספקציה או זיהום. באמצעות שילוב של דימוי תאים חיים המבוסס על פלואורסצנציה עם שימור אולטרה-מבני ברזולוציה גבוהה באמצעות הקפאה בלחץ גבוה, שיטה זו מגבירה את הביטחון החזוי במחקרים מכניסטיים של אינטראקציות בין וירוס למארח. היא תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובפיתוח בדיקות על ידי אספקת נתונים קורלטיביים המגשרים בין פנוטיפים תפקודיים לארכיטקטורה תת-תאית, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשכיות (go/no-go) במסלולי גילוי של תרופות אנטי-ויראליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור ביטוי של חלבונים ויראליים המסומנים פלואורסצנטית לשינויים אולטרה-מבניים בתאים מקובעים בקירור עמוק (cryo-immobilized).
- ערך תפעולי: מגביר את היעילות של חקר אירועי טרנספקציה או זיהום בעלי נצילות נמוכה באמצעות סינון מקדים במיקרוסקופיה של אור.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של שינויים בממברנה המושרים על ידי נגיפים ואתרי הרכבה הרלוונטיים לקומפלקסים של רפליקציה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות מקושרות של פלואורסצנציה וצפיפות אלקטרונים המאפשרות הערכה כמותית של לוקליזציית חלבונים ויראליים ושיבושים מבניים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות באמצעות דיסקיות ספיר תבניתיות, המקלה על השגת קורלציה הניתנת לשחזור בין ניסויים ומשתמשים שונים.
- מוכנות הבדיקה: מייצר דגימות השומרות על המבנה anultrastructural, המתאימות לדימוי המשכי ולניתוח מורפומטרי במסגרת מסעות סריקה.
מחקר תרגומי ופקליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על נאמנות מבנית מדימות של תאים חיים ועד למיקרוסקופיה אלקטרונית, ובכך תומכת בסריקה פנוטיפית המותאמת לסמנים ביולוגיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- מידול פרה-קליני: מאפשרת אפיון מפורט של אפקטים ציטופתיים מושרים על ידי נגיפים במצבים הקרובים למצב הטבעי, ובכך משפרת את הביטחון בהשלכה תרגומית.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת ראיות אולטרה-מבניות לתמיכה או להפרכה של מנגנוני פעולה עבור מועמדים לתרופות אנטי-ויראליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת ה-CLEM משתלבת ברצף הגילוי, החל מיצירת היפותזות בווירולוגיה מוקדמת ועד לתיקוף מכניסטי באופטימיזציה של מועמדים מובילים, במיוחד כאשר נדרשים מתאמים מבניים של תפקוד חלבונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של מבנים הקשורים לחלבונים ויראליים בתתי-אוכלוסיות תאיות מוגדרות.
- סריקה: משפר את מהימנות הבדיקה באמצעות לוקליזציה תאית סטנדרטית ושימור בהקפאה (cryo-preservation), ובכך מפחית את השונות בנתונים המבניים.
- אנליטיקה: מספק מערכי נתונים מתואמים של מיקרוסקופיה אורה ומיקרוסקופיה אלקטרונית המאפשרים השוואה כמותית של תנאים בהתבסס על עוצמת פלואורסצנציה ומאפיינים אולטרה-מבניים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין דימות תפקודי לנתונים מבניים ברזולוציה גבוהה, ותומך ברציפות מבדיקות מבוססות תאים ועד לתיקוף מכניסטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לחקר אינטראקציות בין וירוס למאכסן, הישימה על מטרות רבות ומשפחות ויראליות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת ראיות מתאמות ישירות למיקום של חלבוני נגיף ולשינויים מבניים מושריים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שימוש סטנדרטי במצעים תבניתיים והקפאה בלחץ גבוה, ובכך ממזער ארטיפקטים הנובעים מקיבוע כימי.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות מדויקות יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי תיקוף של מעורבות המטרה ברמה האולטרה-מבנית, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים לאנטי-ויראלים בהתאם לסיכון, בהתבסס על השפעות מאושרות על מדורי השכפול של הנגיף או על אתרי ההרכבה שלו.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימוי פלואורסצנציה של תאים חיים, הקפאה בלחץ גבוה, תחליף הקפאה ומיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM).
- תלוי בגישה למקפיאי לחץ גבוה, אולטרה-מיקרוטומים ומערכות דימוי משולבות של מיקרוסקופיה אופטית ואלקטרונית (CLEM).
- מחייב סטנדרטיזציה של סימני ייחוס (למשל, דיסקי ספיר עם תבנית) ופרוטוקולים של מיפוי קואורדינטות בין צוותים.
- התאמה לסוגי תאים שונים או למערכות ויראליות עשויה לדרוש אופטימיזציה של יעילות הטרנספקציה, סימון פלואורסצנציה ופרמטרי הקפאה.
- מגבלות מעשיות כוללות תפוקה נמוכה בשל הציוד המיוחד והצורך ביישור תוכנה קורלטיבית, כפי שצוין בחומר המקור.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
