ללא כיול במבחנה כימות של חלבון ההומו-oligomerization באמצעות מכשור מסחרי ותוכנות אנליזה של בהירות חינם, קוד פתוח

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סינון התרופות, כגון הבהרת ההשפעה של מעכבי מולקולות קטנות על ריכוזים נמוכים מאוד לאינטראקציות חלבון-חלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא נטולת כיול, ניתן ליישם אותה בכל מיקרוסקופ קונפוקלי, ומשתמשת בכמויות קטנות מאוד של חלבונים מסומנים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח תרופות לסרטן, מעכבי מולקולות קטנות ומעכבי היתוך שונים מכיוון שהיא מספקת מידע כמותי על אינטראקציות חלבון-חלבון.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות חלבונים וצבירה במבחנה, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון דינמיקה של חלבון תא חי ואינטראקציות תא-תא. כדי להתחיל, הפוך תאי pLysS עם וקטור pET-22b המכיל תגי FKBP12 אנושיים מונומרים ותגי His6 ו-mVenus אנושיים מונומריים. לאחר שהתאים התאוששו מהדגירה ומהלם החום, יש להניח אותם על אגר LB בתוספת אנטיביוטיקה.

העבירו את המושבות שעברו טרנספורמציה לתרבית התחלה של 100 מיליליטר, וגידלו במשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטולים. לאחר הדגירה, יש לדלל את תרבית המתנע הצפופה מאחד ל-100 במדיום LB בשתי קבוצות של 500 מיליליטר. לאחר מכן, גדל במשך שעתיים-שלוש לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.6 עד 0.8.

לאחר קירור התרביות על קרח, יש לגרום לייצור חלבון עם IPTG של 250 מיקרו-מולאר. גדל את התרביות במשך 16 עד 20 שעות בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס ו -200 סל"ד. לאחר מכן, קצרו תאים על ידי צנטריפוגה בחום של 2, 000 גרם למשך 20 דקות.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-40 מיליליטר של מאגר IMAC A בתוספת מעכבי פרוטאז ללא EDTA. כעת, סוניקציה של התאים ב-500 וואט, 20 קילו-הרץ ו-40% משרעת בתשע שניות דולקות, 11 שניות כבוי למשך 15 דקות על קרח. לאחר סוניקציה, קצרו את החומר המסיס על ידי צנטריפוגה ב -20, 000 גרם למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס.

מעבירים ליזאט מסיס לבקבוק חרוטי, ומוסיפים שני מיליליטר שרף TALON. הניחו למתלה לדגור למשך שעה עם סיבוב של 105 סל"ד. כעת, קצרו את השרף, ושטפו אותו עם 250 מיליליטר של מאגר IMAC A ואחריו 500 מיליליטר של מאגר IMAC B.Elute חלבון מתויג His6 באמצעות מאגר IMAC C.הזרקו את הפליטה לעמודת אי הכללת גודל מאוזנת מראש, ואספו את שיא FKBP12, אשר נפלט בכ-87.7 מיליליטר.

העריכו את טוהר החלבון באמצעות SDS-PAGE, ואגדו והתרכזו לפי הצורך. כדי להגדיר את מערך הלוחות הרב-באר, הכינו תחילה תמיסה של FKBP12 מטוהר של 100 ננו-מולרי באותו מאגר המשמש לכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. סוניקט וצנטריפוגה עם סיבוב מהיר של 13,000 סל"ד למניעת היווצרות אגרגטים.

כעת, פיפטה 100 עד 200 מיקרוליטר מהחלבון המדולל לתוך תא תצפית בן שמונה בארות עם תחתית זכוכית. הוסף את דימריזר BB לריכוזים סופיים של 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 ו-500 ננו-מולר. כהפניה, הכינו תמיסה של mVenus של 100 ננו-מולרית בלבד כדי להעריך את השפעות הצבירה והמשקעים הפוטנציאליות ולשחזר ערך בהירות עבור המונומר עם אותן הגדרות רכישה.

ניתן להשתמש בכל מערכת קונפוקלית של מיקרוסקופ סריקת אור המצוידת בגלאים דיגיטליים או גלאים אנלוגיים מאופיינים היטב ומסוגלים לשמור על זמן שהייה קבוע עבור כל פיקסל שנרכש. בחר את מטרת הטבילה במים לתיקון הצווארון המיועדת לספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי. כעת, הוסף טיפת מים למטרת טבילת המים לתיקון הצווארון.

הרכיבו את תא התצפית בן שמונה הבארות אל הבמה. הגדר את נתיב אלומת העירור על ידי הפעלת הלייזר של 514 ננומטר והגדרתו בהספק של 20 עד 100 ננו-וואט ביציאה מהמטרה. הפעל גלאי HyD אחד.

עדיפים גלאים המסוגלים לספירת פוטונים. בחר את חלון הפליטה בין 520 ל-560 ננומטר. עבור מצב הרכישה, השתמש ב-16 על 16 פיקסלים.

הגדר את זמן השתהות הפיקסלים כך שזמן המסגרת יהיה ארוך יותר מדיפוזיה של החלבון וזמן השהייה של הפיקסלים קצר בהרבה. זה תואם להגדרת זמן השהות לכ-13 מיקרו-שניות עבור המערכת המשמשת בהדגמה זו. הגדר את חור הסיכה ביחידת Airy אחת לפליטה מתאימה של כ-545 ננומטר.

בחר את מצב רכישת הזמן xy, ובחר את מספר הפריימים שיש לרכוש לכל רכישה ובכן. כעת, הגדר את גודל הפיקסלים לכ-120 ננומטר. אם המערכת מצוידת במצב תפוקה גבוהה, הצג את הקואורדינטות של כל באר ואת מספר הרכישות לבאר כדי להפוך את התהליך לאוטומטי.

אם המערכת מצוידת במערכת זלוף, טען את תמיסת ה-BB ותכנת את הזלוף כך שיתחיל מיד לאחר המסגרת ה-5, 000 כדי להעריך את הקינטיקה של הדימריזציה תוך רכישת 10,000 תמונות. בחר את הבאר הנכונה והתמקד בפתרון. לאחר מכן, התחל את הרכישה ושמור את ערימת התמונות המתקבלת בפורמט TIFF.

רצפים של 20,000 תמונות של FKBP12 mVenus מטוהר בתמיסה של 100 ננומטר נרכשו כמפורט בסעיף הפרוטוקול. עוצמת המסגרת הראשונה מוצגת יחד עם פרופיל העוצמה הממוצע של התמונה המנותקת. הבהירות ללא ועם סינון חלק מוצגת גם כן.

לאחר שנרכשו 10,000 פריימים, נוספה לתמיסה תרופת ההומודימריזר BB תוך כדי רכישה. כל סדרה רצופה של 5,000 פריימים נותחה. הבהירות הממוצעת חמש דקות לאחר הוספת BB הייתה 1.010, שהיא עלייה כפולה, המצביעה על דימר FKBP12.

הקינטיקה של התהליך מראה עיכוב בין הוספת BB לדימריזציה מלאה של FKBP12 של כשתי דקות. היבט מרכזי להערכת אינטראקציות חלבון-חלבון במבחנה הוא ייצור וטיהור החלבון המסומן. ודא שיש לך כמויות קטנות של החלבון המסומן כמעניין ושהחלבון שלך אינו מצטבר לפי הניתוח שלך.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תהודה פלזמון פני השטח או ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו קבועי דיסוציאציה או מקדמי דיפוזיה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביופיזיקה לחקור בפירוט אינטראקציות חלבון-חלבון בתאים חיים. אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים לטיהור חלבון עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון משקפי בטיחות, כפפות, בעת ביצוע הליך זה.