סינתזה, אפיון, ויישום של Nanoprobes תחמוצת ברזל Superמגנטית לאיתור שחפת הריאות חוץ

ברחבי העולם, אבחון שחפת extrapulmonary מתעכב לעתים קרובות, כפי שהוא דורש התערבות כירורגית לאישור עקב מצגת קלינית לא ספציפית וביצועים ירודים על בדיקות אבחון. כדי לשפר את בדיקות האבחון הסרולוגיות לאנטיגנים של שחפת Mycobacterium, פיתחנו גשושי נאנו תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטיים לגילוי שחפת חוץ-גולגולתית. גשושי ננו TB-SPIO יכולים לספק תמונות תהודה מגנטית מדויקות בריכוזים נמוכים בשל תכונותיהם הפרמגנטיות מבלי לגרום לתגובה אוטואימונית כלשהי.

גשושי ננו TB-SPIO מאפשרים מיקוד וזיהוי של זיהום שחפת Mycobacterium. הם יכולים גם להיות מיושמים כסוכן ניגוד MRI לגילוי מחלות אחרות. הקפד ללמוד את הפרוטוקול בקפידה לפני שתנסה את הפרוטוקול, גם כאשר כל חלק בניסוי משתמש בטכנולוגיית ליבה ספציפית.

ההדגמה החזותית של השיטה יכולה לעזור לתלמידים להבין כיצד ליישם את התהליך, במיוחד עבור חלק מהניסויים המורכבים יותר. כדי להכין חלקיקים מגנטיים תחמוצת ברזל מצופה דקסטרן, לשלב במרץ חמישה מיליליטר של דקסטראן T40 עם 45 מיליגרם מיוורי ברזל כלוריד hexahydrate ו 32 מיליגרם של פתרונות טטרהידרט ברזלי כלורי בטמפרטורת החדר. מוסיפים במהירות 10 מיליליטר של אמוניום הידרוקסיד ולהשתמש בבר ערבוב כדי לעורר את ההשעיה השחורה וכתוצאה מכך במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה המרגשת, צנטריפוגה הפתרון ולהסיר את אגרגטים. כדי להפריד את מוצרי SPIO הסופיים מ- T40 dextran לא מאוגד, לטעון את כל תערובת התגובה חמישה מיליליטר לתוך 2.5 על ידי 33 ס"מ ג'ל סינון כרומטוגרפיה עמודה וללטף את הדקסטרן עם 0.1 טוחן של נתרן אצטט ו 0.15-טוחן של פתרון חיץ נתרן כלורי. לאחר מכן, לאסוף את חלקיקים מגנטיים תחמוצת ברזל מצופה דקסטרן מטוהרים בנפח החלל ולהסכים את העמוד eluates עבור ברזל dextran ב 330 ו 490 ננומטר על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

כדי ליצור נוגדני משטח שחפת מיקובקטריום SPIO-conjugated, לסנתז תחילה SPIO-EDBE-succinic anhydride על ידי ערבוב 10 מיליליטר של פתרון אלקליין של SPIO-EBDE עם גרם אחד של אדהיד סוציני במשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. למחרת, להשתמש 12, 000 כדי 4, 000 משקל מולקולרי ניתוק צינורות קרום נקבובי מולקולרי כדי דיאליזה הפתרון עם שינויים של 26 שעות של שני ליטר מים מזוקקים לכל שינוי. לאחר השינוי האחרון, להוסיף 100 microliters של הפתרון וכתוצאה מכך 400 microliters של 4.5 מיליגרם למיליליטרים TB פני השטח נוגדן, ואחריו תוספת של 1-הידרוקסיבזוטריאזול בנזוטריאזול-1-yloxy טריפולידינופוספונט hexafluorophosphate כמו זרזים בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות עם stirring.

הפרד את הפתרונות מהנוגדן הלא מאוגד באמצעות כרומטוגרפיה של סינון ג'ל באמצעות PBS כחוצץ. כדי לקבוע את גודל החלקיק הממוצע, מורפולוגיה, ואת התפלגות גודל, טיפה-יצוק הפיזור מרוכבים על רשת נחושת 200-רשת לייבש את המדגם בטמפרטורת החדר לפני טעינה על מיקרוסקופ אלקטרונים שידור להדמיה ב 100 קילו-וולט. כדי למדוד את ערכי זמן ההרפיה של גשושי הנאנו, השתמש במד להירגע תהודה מגנטית גרעינית ב 20 מגה הרץ ו 37 מעלות צלזיוס פלוס או מינוס דרגה אחת.

עבור הדמיית תאים פעימות גשושית, ראשית לטפח מונוציטים THP-1 אנושיים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים של תאים. כאשר התאים הגיעו לשלב המתאים של ההפעלה, קדם-אופן 10 לשבעת המונוציטים עם אחת 10 ליחידות השישיות של מיקובקטריום בוביס BCG למשך שעה אחת. בסוף הדגירה, להעביר את התאים צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר אחד ולהוסיף שני מילימטרים של SPIO Mycobacterium שחפת משטח נוגדנים הוסיף ננו לכל צינור עבור דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש את כדורי 200 microliters של מדיום טרי. לאחר מכן, לסרוק את הדגימות באמצעות רצף דופק הד הדרגתי מהיר דרך הדמיה תהודה מגנטית 3.0-T כדי לקבוע את הספציפיות והרגישות של גשושי הנאנו. כדי לחסן בעלי חיים ניסיוניים עם M.bovis BCG, ראשית להפוך מחדש את החיסון lyophilized או מלאי חיידקי במדיום של סאוטון לדלל את פתרון המלאי מחדש עם מלוחים.

לאחר מכן, לטעון 100 microliters של הפתרון לתוך מזרק אחד מיליליטר לכל בעל חיים ולהזריק את כל נפח החיידקים intradermally לתוך העור השמאלי או הימני הגבי של כל עכבר. עבור הדמיית תהודה מגנטית in vivo של בעלי חיים בעלי גוף ננו-מוזרק, לרכוש בסיסי T2 משוקלל ספין הד תמונות מהירות של כל חיה ניסיונית הרדמה לפני הזרקת שני nanomolar של בדיקות נוגדנים SPIO-TB מושעה לתוך 200 microliters של מלוחים לתוך וריד הזנב של כל עכבר. לאחר מכן, תדמיין את החיות שוב מיד לאחר ההזרקה וכל חמש דקות במשך 30 הדקות הבאות.

בסוף ההדמיה, לנתח כמותית את כל תמונות התהודה המגנטית באמצעות עוצמת האות כמדידה של אזורי עניין מוגדרים במקומות דומים של מרכז גרנולומה M.שחפת ואת השריר האחורי סמוך לאזור granulomatis. לאחר מכן, השתמש בנוסחה כדי לחשב את שיפורי האות היחסיים באמצעות מדידת עוצמת האות לפני ואפס עד שלוש שעות לאחר הזרקת סוכני הניגודיות. חודש לאחר החיסון, לאסוף את הרקמה מאתר החיסון האינטרדרמלי של כל בעל חיים ולהכתים את פרפין קבוע פורמלין מוטבע חמש עד 10 מיקרומטר דגימות רקמה עבה עם hematoxylin ו אאוסין, כתמי Ziehl-Neelsen עבור חיידקים חומצה מהירה, וכחול ברלין עבור ברזל ברזל ברזל.

הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים שידור של גשושיות נוגדנים משטח SPIO-TB מגלה כי גשושי הנאנו להפגין מראה מפוזר היטב עם גודל ממוצע של 3.8 פלוס או מינוס 0.4 ננומטר לכל ליבה. M.bovis BCG וזן חיידקי מהיר חומצה ניתן לזהות באמצעות כתמי Ziehl-Neelsen. לאחר בידוד ותרבות עם בדיקות המכילות ברזל ברזלי, ניתן לזהות את החיידקים באמצעות כתמים כחולים בברלין.

דרגת מיקוד TB של גשושיות נוגדנים משטח SPIO-TB ניתן לקבוע באמצעות הדמיית תהודה מגנטית משוקלל T2 כפי שצוין על ידי ירידה בעוצמת האות בנוכחות גשושי הנאנו המתרחשת באופן תלוי ריכוז. בבעלי חיים שהוזרקו לננו-פקעת, השיפור משוקלל ה-T2 של הפחתת האות באזורי הגרנולומאטיס של השחפת גבוה בערך פי 14 מזה של אתרי הבקרה. חודש לאחר ההדבקה, גרנולומה תת עורית מאורגנת ניתן לראות בננו-גשושית מוזרק C57 שחור 6 עכברים עם כלי דם חדשים כלי דם לימפוציטים ואפיתליואיד מקרופאג אגרגטים ציין בתוך נגעים אלה.

ביטוי חיובי M.שחפת נצפתה גם באזורים גרנולומטוס עם חומצה מהירה bacilli מכתים חיובי באתר הנגע. כחול ברלין, כתם ברזל ברזל חיובי, יכול לשמש גם כדי לקבוע את הרגישות של הגשושים לשחפת. עבור תמונת תהודה מגנטית של החיים, בעלי חיים שהוזרקו לננו רוכשים תמונת ספין-הד מהירה משוקללת T2 בסיסית של כל חיה ניסיונית הרדמה לפני הזרקת בדיקות הנוגדנים SPIO-TB. עכשיו שיש לנו הוקמה טכניקת SOP כדי לזהות שחפת extrapulmonary, נוגדנים אלה יכולים לשמש במיוחד כדי לאבחן שחפת extrapulmonary.