Name: ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: חקור את השפעת חלבונים פלורסנטיים על שותפי היתוך במערכת שמרים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה וניתנת להרחבה של רעילות הרחבות פוליגלוטמין ודינמיקת צבירת חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמכת של גרנט ההפעלה של מכוני הקנדי למחקר בריאות M.L.D., פ. ל העבודה המוצגת כאן נתמכת על ידי פרס ג'ון ר אוונס מנהיג קרן קרן הקנדית לחדשנות ו קרן תואמות מקרן מחקר אונטריו כדי Y.J. פ. ל הוא נתמך על ידי תואר את PhD העברה מלגה של דיקן בית הספר לכימיה של מ' edicine, רפואת שיניים-מאוניברסיטת מערב אונטריו. S.D.G. נתמך על ידי מלגה לתואר שלישי מקנדה ALS.

1. מהדור החדש Htt מתויג Fluorescentlyex1 כתבים עבור ביטוי בשמרים
הערה: סעיף זה השתנה מן הפרוטוקול על ידי ג'יאנג. et al. 16 ו. Albakri et al. 19.
<ol><li>עיצוב תחל כדי להגביר את רצף קידוד של חלבון פלואורסצנטי או ריבית על-ידי ה-PCR. פריימר לפנים צריכה לכלול רצף מנהיג על מנת לסייע את אנזים הגבלה במהלך העיכול (GATC), ואחריו אתר ההגבלה SpeI (ACTAGT) ו 20 בסיסים downstream של ATG (למעט ATG) של הגן חלבון פלואורסצנטי עניין. ומהצמיגים הפוכה צריכה לכלול את רצף מנהיג (GATC), ואחריו אתר ההגבלה סאלי (GTCGAC), המשלים הפוכה של 20 בסיסי במעלה הזרם stop codon של הרצף FP (כולל הפסקה).</li>
	<li>באמצעות תחל את תוכנן בשלב 1.1, לבצע את תגובת ה-PCR של thermocycler באמצעות ההגדרות הבאות: חום עד 95 ° C 1 דקות, מחזור 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s, ו- 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לכל kB של מוצר ה-PCR. ביצוע מחזורים 18 נמצא בשפע.</li>
	<li>להפעיל את תגובת ה-PCR ג'ל agarose (0.5% בטריס-אצטט-EDTA). שם צריך להקה יחיד התואם לגודל המוצר הצפוי. לבודד את המקטע בעזרת ערכת טיהור ג'ל.</li>
	<li>הפרוטוקול מעסיקה וקטורex1 Htt נושאת 25 (בלתי רעיל), 72 (HD-הקשורים, הצגת צבירה חזק) polyQ חוזר. לעכל את השברים PCR והן את הווקטור עם אנזימי הגבלה SpeI, סאלי עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לטהר את הווקטור מתעכל על ידי פועל זה ג'ל agarose כמו שלב 1.3.</li>
	<li>לטהר את המקטע PCR מעוכל בעזרת ערכת טיהור PCR.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים את השבר שנוצר מתעכל PCR ו- p415 -GAL1-דגל--25/72QpolyQ פלסמידים1 שימוש T4 ליגאז (1h בטמפרטורת החדר). השתמש לתגובה 10 µL (µL 1 של האנזים T4, µL 1 מאגר X 10, 6 µL של קטע ה-PCR ו- 2 µL של וקטור).</li>
	<li>להפוך את 2 µL של התגובה מצדו לתוך 50 µL של Escherichia coli-תאים המוסמכת דגירה אותם על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, חום-הלם התאים ב 42 ° C ל 30 ס' הוסף 1 מ"ל של מדיה תוצר SOC, דגירה ב 37 ° C עבור h 1 ב שייקר. צלחת µL 200 התגובה על צלחת LB-אגר המכיל אמפיצילין µg/mL 100. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>בחר שלוש מושבות חיידקים בודדים, לגדל אותם בן לילה ב- 3 מ ל LB-מרק המכיל אמפיצילין µg/mL 100 ב 37 מעלות צלזיוס ב שייקר ולחלץ את פלסמיד הדנ א באמצעות ערכת טיהור פלסמיד.</li>
	<li>בדוק את פלסמיד באמצעות עיכול 500 ננוגרם של הדנ א בעזרת אנזימי הגבלה SpeI, סאלי עבור h 1 37 ° C ולהריץ התגובה על ג'ל agarose (0.5% בטריס-אצטט-EDTA). צריך להיות שתי להקות בגדלים נכון של וקטור (~ 7 קילו), את תותב (גודל משתנה על פי הגן עניין). לאחר מכן, לאמת את פלסמיד על ידי רצף.</li>
	<li>להפוך את p415 -GAL1-דגלפלסמידים FP - polyQ לתוך המתח שמרים W303 בעקבות פרוטוקול טרנספורמציה2שמרים רגיל.</li>
</ol>2. איתור Assay
<ol><li>פס השמרים שיבוטים נשיאה 25Q/72Q המתויגת FP של ריבית על צלחת אגר המכילים שמרים בחירת מדיה (סינתטי להשלים-SC ללא לאוצין) עם גלוקוז כמקור פחמן. במקביל, גם פסים 25Q/72Q-ymsfGFP לשמש פקד חיובי. הערה: 25Q/72Q מבנים שאינם מכילים תגית פלורסנט אינם רעילים, יכול לשמש בקרה שלילית.</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 d.</li>
	<li>בחר עד שלוש מושבות יחיד מהצלחת.</li>
	<li>לחסן 5 מ ל SC בתוספת 2% גלוקוז כמקור פחמן.</li>
	<li>גלולה 200 µL של כל תרבות הלילה ולשטוף אותו x 3 עם סטרילי מים מזוקקים.</li>
	<li>Resuspend תאי SC המדיה המכילה 2% גלקטוז כמקור פחמן כדי לעודד את הביטוי של polyQ fusions. דגירה של גלקטוז מדיה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ב rotator הרכבת התחתית. כפקד, חזור על שלב זה באמצעות מדיה המכילה גלוקוז.</li>
	<li>למחרת בבוקר, להשוות הצפיפויות תא כדי צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.2 ל-100 µL של התקשורת SC צלחת 96-ובכן סטרילי.</li>
	<li>להכין ארבעה דילולים למטר של כל מדגם במים סטריליים על-ידי pipetting 20 µL של הדוגמה הקודמת עד 80 µL של התקשורת הבאר הבא.</li>
	<li>להשתמש שמרים הצמדת כלי כדי לזהות את התאים על גבי לוחות סלקטיבית (המכילה גלוקוז או גלקטוז) דגירה ב 30 ° C עבור 2 d.</li>
	<li>תמונה הצלחות עם מכשיר תיעוד התמונה.</li>
</ol>3. כימות של צמיחת תאים בתרבות נוזלי
<ol><li>הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.</li>
	<li>למדוד את יתר600 באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
	<li>לדלל לתאים יתר600 של 0.1 ב 300 µL של התקשורת צלחת 96-ובכן.</li>
	<li>תריץ את דגימת כל דולר.</li>
	<li>דגירה של צלחת צלחת הקורא/חממה עם יכולות חזק. להגדיר את מספר הדגימות, הטמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס, את ספיגת על 600 ננומטר, האורך של הניסויים ל 24 שעות, את המרווחים מדידה 15 דקות ולאחר בחר באופן רציף חזק.</li>
	<li>ליצור את עקומת גדילה ולכמת את השטח מתחת לעקומה באמצעות תוכנה graphing מדעי. 7 פריזמה GraphPad מומלץ. להדביק את הנתונים בתוך טבלת XY עם שלושה ערכים שכפל. עקומת גדילה יוצגו תחת התיקיה תרשימים בצד שמאל. כדי לכמת את השטח מתחת לעקומה, בחר נתח בפינה השמאלית העליונה ולחץ על האזור תחת עקומת ניתוחים XY.</li>
</ol>4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
<ol><li>הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.</li>
	<li>לדלל את התאים 10 x בצמיחה התקשורת והעברת µL 200 של כל מדגם ללשכה הדמיה 8-. טוב.</li>
	<li>תמונה של תאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם מטרה Aprochromoat תוכנית X 63 (1.4 NA) בטמפרטורת החדר. הערה: השימוש של מיקרוסקופ קונפוקלי היא אופציונלית. גם יכול להיות מועסק מיקרוסקופ רגיל של פלורסנט שדה רחב.</li>
	<li>להתאים את הכוח חריר ולייזר עבור רכישת תמונה אופטימלית. מאז מצרפי 72Q בהיר יותר האות 25Q ' מאטום לשקוף ', זה לעתים קרובות נדרש להשתמש הגדרה רכישה שונה בין פלסמידים שונים על מנת למנוע הרוויה של האות פלורסנט.</li>
	<li>לעבד את התמונות באמצעות ImageJ20 או תוכנות עיבוד תמונה. בשלב זה, רצוי האחוז של תאים כי התצוגה צבירה ניתן לחשב באופן ידני.</li>
</ol>5. נקודה חשופה
הערה: ב פרוטוקול זה, נקודה חשופה משמש כדי לבדוק את רמות ביטוי של חלבונים. הכינו את תרביות תאים, להלן השלבים 2.1-2.5 של פרוטוקול זה.
<ol><li>צור lysates חלבון באמצעות חרוזי זכוכית במאגר פירוק (100 מ מ. טריס, pH 7.5; 200 מ מ NaCl; 1 מ"מ EDTA; 5% גליצרול, 1 מ dithiothreitol [DTT]). מוסיפים מעכבי פרוטאז, 4 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PSMF), מעכבי פרוטאז קוקטייל, ישירות לפני השימוש. גלולה 5 מ של התרבות לילה, resuspend זה µL 200 של חרוזי זכוכית, µL 200 פירוק המאגר. מערבולת 30 s ל-12 סיבובים. צנטריפוגה ב x 12,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאסוף את תגובת שיקוע.</li>
	<li>במקום כמות שווה של חלבונים הכולל על קרום ניטרוצלולוזה באמצעות מנגנון אוסמוזה הפוכה. Prewet את הקרום עם PBS ולהרכיב את המנגנון. להתחבר למקור ואקום ולוודא שהברגים הם הידקו. את הריב ולתת את המסנן מדגם דרך הקרום על ידי הכבידה.</li>
	<li>לחסום את הקרום בחלב דל-שומן Tween/5% PBS - 0.05%.</li>
	<li>דגירה הקרום עם נוגדן נגד דגל הראשי בן לילה ב 4 º C. הדגל אנטי monoclonal ש-m1 מומלץ.</li>
	<li>לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות כל אחד עם Tween PSB - 0.05%.</li>
	<li>דגירה הקרום עם שכותרתו fluorescently משני נוגדנים (אנטי עכבר IgG) לשעה בטמפרטורת החדר ב- PBS - 0.05% Tween/5% חלב ללא שומן.</li>
	<li>רחץ ממברנה 3 x 10 דקות עם Tween PSB - 0.05%.</li>
	<li>תמונות-כתם באמצעות מערכת תיעוד immunoblot.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Thorn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent tags.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+proteins%3A+advanced+imaging+applications+and+future+design%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design.</a> Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).</li>
<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Costantini, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+palette+of+fluorescent+proteins+optimized+for+diverse+cellular+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments.</a> Nature Communications. 6, 7670(2015).</li>
<li>Costantini, L. M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+in+cellular+organelles%3A+serious+pitfalls+and+some+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions.</a> DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).</li>
<li>Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+structure+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The molecular structure of green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Pédelacq, J. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+soluble+proteins+for+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering soluble proteins for structural genomics.</a> Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).</li>
<li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+mutagenesis%2C+and+oligomerization+of+DsRed%2C+a+red+fluorescent+protein+from+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).</li>
<li>Laue, T. M., Stafford, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+applications+of+analytical+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Modern applications of analytical ultracentrifugation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).</li>
<li>Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+characterization+of+a+superfolder+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).</li>
<li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).</li>
<li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).</li>
<li>Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+toxicity+in+yeast+uncovers+phenotypic+variations+between+different+fluorescent+protein+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions.</a> Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).</li>
<li>Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAG+repeat+number+governs+the+development+rate+of+pathology+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington's disease.</a> Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).</li>
<li>Gusella, J. F., MacDonald, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+seeing+the+pathogenic+process+through+a+genetic+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).</li>
<li>Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+toxicity+assays+highlight+the+advantages+of+mScarlet+for+imaging+in+Saccharomyces+cerevisiae+%5Bversion+1%3B+referees%3A+1+approved%2C+1+approved+with+reservations%5D%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations].</a> F1000Research. 7, 1242(2018).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).</li>
<li>Duennwald, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+platform+to+explore+polyglutamine+toxicity+and+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation.</a> Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).</li>
<li>Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+blue%2C+green%2C+and+red+fluorescent+protein+tagging+vectors+for+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae.</a> Plos One. 8 (7), e67902(2013).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e838(2008).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Thomas, B. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+recombination+rates+in+transcriptionally+active+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA.</a> Cell. 56 (4), 619-630 (1989).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
<li>Meriin, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).</li>
<li>Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+vectors+for+the+controlled+expression+of+heterologous+proteins+in+different+genetic+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds.</a> Gene. 156 (1), 119-122 (1995).</li>
<li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במאמר זה, מבחני שונים כדי למדוד את המצבור של Httex1 polyQ הרחבות ואת השפעתם על צמיחת שמרים הועסקו כמודל ללמוד כמה שונה פלורסנט חלבונים לשנות זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט . באמצעות ה-GFP משתנה (ymsfGFP) כפקד חיובית, הראינו כי זה מזהה שינויים משמעותיים polyQ רעילות, צבירת בין תגי שונה פלורסנט, מאפשר השוואה ישירה ומהירה של ההופעה פיוז'ן polyQ-FP נגד מתויג GFP בונה16,19.
בעוד בפרוטוקול הנוכחי מתמקד חלבונים פלורסנט, חלקים שו...

מאז פותחו האפיון הראשוני של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ויקטוריה Aequorea1, לוח צבעים רחב של מקודדים גנטית FPs, ומאפשר תא ביולוגים בו-זמנית לשפה ולעקוב מרובים אירועים/החלבונים חי תאים2,3. FPs נגזרות אורגניזמים מרובים, מן המדוזה אלמוגים, ולכן, הצגת מאפייני biophysical ספציפי המסיטים בהרחבה מעבר ספקטרום פלורסנט המתאימים שלהם. מאפיינים אלה כוללים בהירות, פוטוסטביליטי נטייה oligomerize בין היתר2,4. בחירת monomeric FPs היא היבט חשוב בבחירה של תג מתאים בעת עיצוב כתב פלורסנט, על מנת למזער אינטראקציות בלתי הולם והשינויים של הפונקציה של השותף פיוז'ן, למקסם את היעילות כתב עבור בהתחשב תא הסלולר-4,-5,-6. בעוד ה-GFP, לאורך זמן, התפתח כדי לצמצם את ההשפעה של הוספת תגית פלורסנט של פיוז'ן שותף5,7,8, כמה גרסאות חדשות FP לבצע בהשוואה ל GFP נשאר קשה להעריך.
כמה שיטות קיימות כדי לאפיין את אופן הפעולה של FPs. רובן כוללות בדיקת מאפיינים ביופיזיקלי של FPs שימוש בגישות ביוכימיים, כגון ultracentrifugation, ג'ל סינון פרוטוקולים9,10,11,12. שיטות כאלה יש אזהרה של שימוש FPs מטוהרים בפתרון, מציע תובנה קטנה התנהגותם בתאים ללא פגע. הפיתוח של ההצעות assay מאורגן חלקה רשתית תוך-פלזמית (OSER) הערכה הניתנת לכימות של נטייה FPs' oligomerize חי תאים13 על-ידי בדיקת היכולת של overexpressed FPs כדי לארגן מחדש את רשתית תוך-פלזמית בקוריאנית לתוך OSER דורים14. טכניקה זו בהצלחה לזהות שינויים בין גרסאות monomeric ו- oligomeric של ה-GFP, FPs אחרים. עם זאת, זה מסתמך בעיקר על ביטוי בתאים transiently transfected, כימות וניתוח התמונה פקוקה אלא אם הטכניקה מאומצת כמו איסוף נתונים אוטומטי של ניתוח זרימת העבודה.
על מנת להשלים את הגישות האלה, הקמנו וזמינותו כי מנצל את ההשפעה של פלורסנט תגים על רעילות, צבירה של הרחבות polyQ שמרים15,16. הרחבת רצועת polyQ עם יותר מ 36 חוזר בתוך אקסון הראשון של ג'ין קידוד שהחלבון huntingtin (Htt) מזוהה עם מחלת הנטינגטון17,18. הביטוי של Htt המורחבex1 בתוצאות שמרים ב צבירה חזקה של החלבון Htt misfolded מצמידים פגם חמור צמיחה. מעניין, אלה פנוטיפים חריפה מושפעים את רצפי איגוף רצועת polyQ, כולל FPs15,16. זה היה מיוחד כי מאפיינים שונים של FPs יכול להשפיע באופן שונה רעילות polyQ שמרים. ואכן, בהשוואה ל- FPs כמו GFP, חלבונים ניאון אדום וטפסים מפותחת שלהם הראו מופחתת רעילות, צבירת16. כתב יד זה מספק פרוטוקול נתונים היסטוריים כדי להעריך את ההשפעה של הדור הבא של FPs על רעילות polyQ, צבירה של שמרים. Assay זו מאפשרת ניתוח מהיר ולא פוטנציאל גבוה-תוכן של גרסאות FP שיכול לשמש במקביל בעבר מאופיין טכניקות אופטימלית אפיון חדש FPs וניתן להעריך כיצד הם לבצע בהשוואה ל- GFP.

<table><tbody><tr><td>5-אלפא מוכשר E. coli (יעילות גבוהה)</td> <td>New Englanfd Biolab</td><td>C2987</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>R3133</td><td>אנזימים בנאמנות גבוהה מועדפים</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New Englanfd Biolab</td><td>R0138</td><td>אנזימים בנאמנות גבוהה עדיפים</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600382</td><td></td></tr><tr><td>EPOCH2 ספקטרופוטומטר מיקרופלייט</td><td>BioTek Instruments inc</td><td>EPOCH2TC</td><td></td></tr><tr><td>משכפל סיכות שמרים</td><td>V& פי סיינטיפיק בע"מ</td><td></td><td></td>VP407AH</tr><tr><td>SPI imager</td><td>S& פי רובוטיקס בע"מ</td><td>spImager-M</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 800 קונפוקלי עם AryScan</td><td>Carl Zeiss מיקרוסקופיה</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>8 באר תאי הדמיה Lab-Tek</td> מכשיר <td>פישר סיינטיפיק</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Chemi Doc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד FLAG M1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3040</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר IgG alexa 555 נוגדן משני</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>A32727</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Plasmid MiniPrep Fisher</td><td>Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל פלסמיד</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0831</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0702</td><td></td></tr><tr><td>Prizm</td><td>GraphPad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TAE (TRIS-ACETATE-EDTA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP13354</td><td></td></tr></tbody></table>

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות polyglutamine שמרים

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

עבור החקירה של לוקליזציה חלבון וסחר באמצעות הדמיה תא חי, החוקרים מסתמכים בדרך כלל על פיוזינג חלבון שלהם לעניין כתב פלורסנט. הרשימה מתפתחת ללא הרף של חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית (FPs) מציג משתמשים עם מספר חלופות כשמדובר עיצוב פיוז'ן פלורסנט. FP כל בעלת תכונות אופטי ו biophysical ספציפיים שיכולים להשפיע על מאפייני הביוכימי, סלולר ופונקציונלי fusions פלורסנט וכתוצאה מכך. למשל, כמה FPs נוטים ליצור oligomers לא ספציפית כי הם רגישים כדי להכשיל על הפונקציה של הזוג פיוז'ן. למרבה הצער, רק כמה שיטות קיימות כדי לבחון את ההשפעה של FPs על ההתנהגות של הכתב פלורסנט. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת את ההערכה המהירה של ההשפעה של FPs באמצעות מבחני רעילות polyglutamine (polyQ) בשמרים ניצני האפייה. חלבונים huntingtin מורחב-PolyQ קשורים עם תחילתה של מחלת הנטינגטון (HD), איפה huntingtin המורחב אגרגטים לתוך oligomers רעילים וגופים הכללה. צבירה של רעילות polyQ הרחבות בשמרים הם תלויים במידה רבה רצפי איגוף באזור polyQ, כולל הנוכחות של תגיות פלורסנט, ובכך מספק פלטפורמה ניסיוני אידיאלי לחקור את ההשפעה של FPs על התנהלות שלהם שותף פיוז'ן.

FPs יש biophysical מאפיינים שונים, כולל שלהם נטייה oligomerize, אשר יכולים להשפיע על ההתנהגות של זוגם היתוך בהקשר של כתבים פלורסנט. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה היכן FPs מרובים יכולים נכרכים להרחבות polyQ רעילים. מאז polyQ רעילות תלויה מאוד רצפי איגוף למתוח את polyQ15, וזמינותו זו מאפשרת השוואה מהירה וישירה של כתבים פיוז'ן polyQ פלורסנט (איור 1). אורך-הקשורים HD polyQ (25Q) משמש פקד שלילי, מציג רעילות משמעותיות או צבירת<sup class="xref"...

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום החלבונים הפלואורסצנטיים כגון כיצד חלבונים פלואורסצנטיים יכולים להשפיע על שותפי ההיתוך שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הערכה מהירה וקלה להרחבה של ההשפעות של חלבונים פלואורסצנטיים ושותפי ההיתוך שלהם. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על התנהגות חלבון פלואורסצנטי, זה יכול להיות מיושם גם על תגים מקודדים גנטית אחרים.כמו כן ידגים הליך זה יהיה סוניה די גרגוריו, שהוא סטודנט לתואר שני באוניברסיטה המערבית. כל חלבון פלואורסצנטי שנבדק בשיטה זו משוכפל תחילה לווקטור ביטוי שמרים המקודד גרסה בלתי ניתנת לעיכול גלקטוז של אקסון HTT מתויג על ידי FLAG אחד מחסה או לא רעיל 25Q לחזור או מחלת הנטינגטון הקשורים רעיל 72Q לחזור. שיבוטים נבחרים ומאומתים על ידי רצף ולאחר מכן הופכים לשמרים.כדי להכין תרבות תאים עבור assays שונים, פס שיבוטים שמרים נושאת תג 25Q או 72Q עם חלבון פלואורסצנטי של עניין על צלחת אגר המכילה מבחר שמרים בינוני עם גלוקוז כמקור הפחמן. במקביל, שמרי פס הנושאים שמרים 25Q או 72Q אופטימיזציה סופר-תיקיות מונומרית GFP לשמש שליטה חיובית. דגירה הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים עד שלושה ימים.בחר עד שלוש מושבות בודדות מכל צלחת לחסן חמישה מיליליטר של מדיום מלא סינתטי בתוספת 2% גלוקוז כמקור הפחמן. דגירה התרבויות ב 30 מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחרת, להעביר 200 microliters של כל תרבות לילה צינור microcentrifuge וצנטריפוגה כדי גלולה את התאים.לשטוף לפחות שלוש פעמים עם מים מזוקקים סטריליים. חשוב לשטוף היטב את התאים כדי לחסל את כל עקבות הגלוקוז שיכולים לתרום להדחיקת הגיוס של מקדם GAL1. הכן את התאים כפי שהודגם בעבר והשהה אותם מחדש במדיום מלא סינתטי המכיל 2%galactose כמקור הפחמן כדי לגרום לביטוי של היתוך polyQ.כפקד, השהה מחדש את התאים במדיה המכילה גלוקוז. דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס בצינור מסובב לילה. בבוקר שלמחרת, למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר של כל תרבות באמצעות ספקטרופוטומטר.השווה את צפיפות התא לצפיפות אופטית של 600 מתוך 2 ב-100 מיקרוליטרים של מדיום שלם סינטטי בצלחת סטרילית של 96 בארות. הכינו ארבעה דילולים של פי חמישה מכל דגימה על ידי צינורות 20 מיקרוליטרים של המדגם מה באר הקודמת ל-80 מיקרוליטרים של מדיה באר הבאה. השתמש בכלי הצמדת שמרים כדי לזהות את התאים על צלחות סלקטיביות דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים.תדמיין את הלוחות עם התקן תיעוד תמונה. הכן את תרבות התאים לתראה זו ולאחר מכן למדוד את OD600 של כל תרבות באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את התאים OD600 של 1 ב 300 microliters של מדיה בצלחת 96 באר.הכינו כל דגימה ב-triplicate. הדגירה את הצלחת באינקובטור קורא צלחת עם יכולות רועדות. הגדר את מספר הדגימות, הטמפרטורה ב 30 מעלות צלזיוס, הספיגה ב 600 ננומטר, אורך הניסויים ל 24 שעות, ואת מרווחי המדידה ל 15 דקות.בחר את מצב הרעידות הרציף. כאשר הניסוי נעשה, ליצור את עקומת הצמיחה לכמת את האזור מתחת לעקומה באמצעות תוכנת גרפים מדעית. הדבק את הנתונים בטבלת XY עם שלושה ערכים משוכפלים.עקומת הגדילה תוצג מתחת לתיקיית הגרפים בצד שמאל. לכימות האזור מתחת לעקומה, בחרו לנתח בחלק השמאלי העליון ולחצו על אזור מתחת לעקומה בניתוחי XY. התחל הליך זה על ידי דילול התאים המוכנים פי 10 במדיום הצמיחה.העבר 200 מיקרוליטרים של כל דגימה לתא הדמיה של שמונה בארות. תמונה התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב סטנדרטי. התאם את הגדרות הדימות לרכישת תמונה.מאז אגרגטים 72Q הם הרבה יותר בהירים מאשר אות 25Q מפוזר, הוא נדרש לעתים קרובות להשתמש הגדרת רכישה שונה בין plasmids שונים על מנת למנוע רוויה של אות פלואורסצנטי. לעבד את התמונות באמצעות תוכנה מתאימה לעיבוד תמונה. בפרוטוקול זה, כתם נקודה משמש לבחינת רמות ביטוי החלבון.הכינו את המאגר ליצירת ליאזט חלבונים על ידי הוספת ארבעה מיקרומולרים של פלואוריד פנילמתילסולפוניל וקוקטייל מעכב פרוטאז למאגר התיזה. גלולה חמישה מיליליטר של כל תרבות לילה על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את התאים ב 200 microliters של גם גם 800 מיקרוליטרים של חיץ תזה.מערבולת למשך 30 שניות ל-12 סיבובים, הדובדבן שבקצפת בין הסיבובים. צנטריפוגה ב 12, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant. השתמש בקנסטרום microfiltration כדי לזהות כמויות שוות של חלבון הכולל על קרום nitrocellulose.הרטיבו מראש את הממברנה עם PBS והרכיבו את המנגנון. חבר אותו למקור ואקום וודא שהברגים מהודקים. לטעון את הדגימות, להפעיל את הוואקום, ולתת לדגום לסנן דרך הממברנה על ידי כוח הכבידה.תנפחו את הממברנה ב-PBS 05%Tween 5% חלב ללא שומן למשך 30 דקות. דגירה הממברנה עם נוגדן אנטי דגל ראשוני בארבע מעלות צלזיוס לילה. ביום שלמחר, לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS 05%Tween.הדגירה את הממברנה עם נוגדן משני שכותרתו פלואורסצנטי PBS 05%Tween 5% חלב ללא שומן בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד עם PBS 05% Tween. לאחר מכן, תמונה הממברנה באמצעות מערכת תיעוד כתם אמינו.שמרים המבטאים או 25Q או 72Q HTT exon אחד התמזגו שמרים אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP או שמרים אופטימיזציה תג מונומרי BFP2 היה מתורבת גלוקוז או גלקטוז בינוני לילה או הבחין על צלחות אגר או דגירה עוד יותר במדיה נוזלית. בעוד שמרים 72Q אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP גורם פגם צמיחה משמעותי. BFP2 תג מונומרי מותאם שמרים 72Q מציג פנוטיפ צמיחה דומה לעמיתיו 25Q רעילים המציין כי אופי התג הפלואורסצנטי יכול לעכב את התנהגות התפשטות polyQ בתאים.הערכה של צבירה של היתוך polyQ פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי מראה כי 72Q שמרים אופטימיזציה superfolder מונומרי GFP מציג צבירה משמעותית, בעוד שמרים 72Q אופטימיזציה תג מונומרי BFP2 מציג אות ציטופלסמי מפוזר דומה עמיתים 25Q רעילים. מאז רמות הביטוי של היתוך polyQ שונים יכול להשפיע על רעילות, כתמי נקודה בוצעו כדי להעריך את רמות החלבון. תוצאות מדילול פי חמישה של ליsates התא מוצגים.אל תשכח כי טכניקה זו מאפשרת השוואה מהירה של חלבונים לא אופייניים פלואורסצנטי עם גרסאות GFP, אבל זה לא יכול להעריך ישירות אוליגומריזציה. בעקבות הליך זה, אמצעים אחרים, למשל, את הבדיקה כיב בתאי יונקים ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות כגון המצב המונומרי של חלבונים פלואורסצנטיים.

effect-fluorescent-proteins-on-fusion-partners-using-polyglutamine

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים...

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

סרטון זה מדגים בדיקה מבוססת הדמיה in vivo כדי לקבוע ירידה בפרוטאוסטזיס עקב הזדקנות. הבדיקה משתמשת ב- Caenorhabditis elegans המבטא חלבון היתוך YFP פוליגלוטמין בשרירי דופן הגוף כדי למדוד את הצבירה הקשורה לגיל של פוליגלוטמין והשראת פרוטאוטוטוקסיות, מה שמוביל לשיתוק.

בדיקת שיתוק מבוססת כתב פלואורסצנטי: טכניקה להערכת היווצרות פרוגרסיבית הקשורה לגיל של כתב פלואורסצנטי פוליגלוטמין ושיתוק נלווה ב- Caenorhabditis elegans

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

אנו מספקים שיטה בסיסית הניתנת לשחזור למיקרוסקופיה ארוכת טווח של מחזור החיים המיני של שמרי ביקוע. עם התאמות קלות שתוארו, הפרוטוקול המוצג מאפשר התמקדות מחקרית בשלבים שונים של תהליך הרבייה.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

PCR בתיווך שינוי גנטי יכול לשמש כדי ליצור תערובות חלבון פלואורסצנטי במיני קנדידה, המאפשר הדמיה לכמת בתאי שמרים וחלבונים. בזאת, אנו מציגים אסטרטגיה לבניית שילוב חלבון פלואורסצנטי (Eno1-FP) ב קנדידה parapsilosis.

הדור של Fusions חלבון פלורסנט<em&gt; קנדידה</em&gt; מינים

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

שמרי ביקוע כפלטפורמה למסכי תרופות אנטיבקטריאליים המכוונים לחלבוני שלד ציטו-בקטריאלי

חקור את השפעת חלבונים פלורסנטיים על שותפי היתוך במערכת שמרים. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה וניתנת להרחבה של רעילות הרחבות פוליגלוטמין ודינמיקת צבירת חלבונים.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

גלה סרטונים נוספים