Name: הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: למד הכנת דגימות פטריות וצמחים לספקטרוסקופיית NMR מצב מוצק וקיטוב גרעיני דינמי. שיטה זו מאפשרת אפיון ביוסיסטמים מורכבים ברזולוציה אטומית בסביבתם הטבעית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע דרך ה-NSF אויה-1833040. נבחרת גבוהה השדה המגנטי מעבדה (NHMFL) נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע דרך DMR-1157490, פלורידה. מערכת MAS-DNP-NHMFL הוא מומן בחלקו על ידי NIH S10 OD018519 ואת ה-NSF צ'ה-1229170.

1. גידול של 13ג', 15התווית על-ידי N אספרגילוס fumigatus בינוני נוזלי
<ol><li>הכנת ללא תווית ו- 13C, מדיום הגידול התווית על-ידי N 15 הערה: שניהם דקסטרוז Peptone לחלץ שמרים בינונית (YPD), את שיפור בינונית מזערי43 שימשו לשם קיום תרבות פטרייתי. כל השלבים לאחר autoclaving מבוצעות בתא למינארי כדי למזער את הזיהום.<ol>
<li>הכנת בינוני נוזלי ללא תווית: להמיס 6.5 גר' אבקת YPD 100 מ של מים מזוקקים ולאחר מכן אוטוקלב במשך 25 דקות-134 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הכנת בינוני מוצק ללא תווית<ol>
<li>להוסיף 1.5 g של אגר, 6.5 גר' אבקת YPD 100 מ של מים מזוקקים.</li>
			<li>אוטוקלב המדיום במשך 25 דקות-121 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן מגניב עד כ 50 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>להעביר 13-15 מ"ל של המדיום לתוך כל פלסטיק מראש עקר פטרי, מכסים את הכלי באמצעות מכסה באופן מיידי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הכנה של 13ג', 15התווית על-ידי N נוזלי בינוני הערה: כדי להכין את הפתרון צמיחה איזוטופ תיוג, מדיום מינימלי המכיל 13C-גלוקוז, 15N-נתרן חנקתי, פתרון יסוד קורט מוכן בנפרד הינם מעורבבים אז לפני השימוש.<ol>
<li>הכן 100 מ של המדיום מינימלי המכיל איזוטופ כמפורט בטבלה1. להתאים את ה-pH ל 6.6 באמצעות NaOH (1 מ') או פתרון HCl (1 מ').</li>
			<li>אוטוקלב אמצעי מינימלי עבור 25 דקות-121 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>להכין 100 מ ל (1, 000 x) של יסודות קורט פתרון, לפזר את מלחי המופיעים בטבלה 2 במים מזוקקים. אוטוקלב הפתרון עבור 25 דקות-134 מעלות צלזיוס. לקרר ולאחסן את הפתרון ב 4 ° C לשימוש לטווח קצר. ה-pH יהיה בערך 6.5, ניתן לבדוק באמצעות מד pH.</li>
			<li>להוסיף 0.1 מ"ל של יסודות קורט פתרון 100 מ של 13ג', התווית על-ידי N בינונית מזערי 15כמפורט בטבלה מס ' 2 לפני השימוש.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>הצמיחה של החומרים פטרייתי<ol>
<li>העברת כמות קטנה של פטריות מהמחסן לצלחת YPD באמצעות ללולאה לחסן ב תא למינארי. שמור את התרבות ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים בתוך אינקובטור.</li>
		<li>השתמש ללולאה לחסן להעברת פעיל היתרון פטרייתי גדל 13ג,15תיוג-N פתרון תא למינארי. לשמור על התרבות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים על 220 סל"ד ב חממה חזק.</li>
		<li>צנטריפוגה ב x 4,000 גרם במשך 20 דק. הסר תגובת שיקוע ולאסוף בגדר.</li>
		<li>השתמש פינצטה כדי לאסוף ~0.5 גר' צניפה שתיתן (> 50 wt % לחות) ללימודי NMR. אובדן לחות בכל נקודה להחמיר באופן משמעותי את הרזולוציה ספקטרלי. הערה: אם יש צורך, כמות קטנה (0.1 גר') של תפטיר רטוב ניתן להיות מופרדים, מיובש לחלוטין תחת זרימת גז2 N ברדס או של איזה שהוא לופילייזר כדי להעריך את רמת לחות ולחשב האחוז המוני יבש. בדרך כלל, גלולה המכילה ~0.3 g ניתן להשיג מסה יבש לאחר 3 ימים. אם הניסוי NMR להתנהל ארוך (> 7 ימים) ו/או אם המדינה של הפטריות צריך לתקן, החומר פטרייתי שיכול להיות עמוק קפוא נוזלי N2 למשך 10-20 דקות לפני עיבוד נוסף. אם הניסוי יהיה קצר (3-6 ימים), הקפאת יכול תדלג על כך לדוגמה יכול להישאר טריים.</li>
		<li>לערבב חומר עודף עם 20% (v/v) גליצרול בשפופרת צנטרפוגה ולשמור אותו במקפיא-80 ᵒC לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנה של fumigatus א Solid-state NMR ולימודי DNP
<ol><li>הכנת fumigatus א לניסויים NMR של מצב מוצק<ol>
<li>Dialyze 13ג, 15התווית על-ידי N פטרייתי דוגמת (שלב 1.2.4.) נגד 1 ליטר של 10 מ מ פוספט מאגר (pH 7.0) ב 4 ° C באמצעות שקית דיאליזה עם 3.5 kDa מולקולרית משקל סף כדי להסיר מולקולות קטנות מדיום הגידול לתקופה כוללת של 3 ימים. לשנות את המאגר פעמיים ביום. הערה: לחלופין, המדגם יכולים להישטף במשך 6 - 10 פעמים באמצעות מים יונים כדי להסיר שאריות מולקולות קטנות.</li>
		<li>להעביר את הדגימה לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה במשך 5 דקות (10,000 x g) באמצעות צנטריפוגה benchtop. הסר את תגובת שיקוע, לאסוף את החומרים פטרייתי.</li>
		<li>חבילת 70-80 מ"ג בצורה אחידה 13לדוגמה התווית על-ידי C, שתיתן הדבק לתוך הרוטור2 ZrO 4-מ מ או 30-50 מ"ג ל- 3.2 מ מ הרוטורים לניסויים NMR. שוב ושוב לסחוט את הדגימה בעדינות באמצעות מוט מתכת, לספוג את המים העודפים שימוש בנייר.</li>
		<li>בחוזקה קאפ הרוטור, להכניס את הדגימה ספקטרומטר עבור אפיון NMR של מצב מוצק. הערה: הרוטורים חדשים מוצעים כדי למזער את האפשרות של הרוטור התרסקות ולטעום נוזלים ב ספקטרומטר NMR. אם יש צורך, הוספה קל-F חד פעמיות עם איטום הברגים יכול לשמש כדי לשמש כגורם מכיל משני בתוך הרוטור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת fumigatus א דוגמאות לניסויים DNP<ol>
<li>להכין µL 100 DNP ממיסים29,44 (הידוע גם בשם המטריקס DNP) צינור microcentrifuge 1.5 mL 13ג,15התווית על-ידי N דגימות פטרייתי. מטריצה זו DNP מכיל תערובת של d8-גליצרול/D2O H2O (60/30/10 Vol %). הערה: אם הם דוגמאות ללא תווית להיחקר, ואז להכין המטריקס DNP באמצעות 13מדולדל C d8-גליצרול (12ג3, 99.95%; ד8, 98%) ו- D2O ו- H2O להימנע 13ג אות התרומה ממיסים.</li>
		<li>להמיס 0.7 מ"ג של AMUPol45 ב- µL 100 DNP בממיסים טופס 10 מ מ מניות פתרון רדיקלי. מערבולת למשך 2-3 דקות על מנת להבטיח כי רדיקלים הם מומס באופן מלא הפתרון.</li>
		<li>משרים 10 מ ג של dialyzed 13C, התווית על-ידי N חומרים פטרייתי 15כפי שתואר בשלבים קודמים (שלבים 2.1.1 ו 2.1.2) לתוך µL 50 של פתרון AMUPol, במתינות לטחון את התערובת באמצעות כבעלי מרגמה כדי להבטיח חדירה של הגורמים הקיצוניים לתוך קירות התא נקבובי. הערה: כדי להפחית את קצב איבוד לחות, שהטחינה יכולה להתקיים גם צינור microcentrifuge באמצעות micropestle.</li>
		<li>להוסיף עוד 30 µL של הפתרון הרדיקלי בגדר חרקו כדי מימה נוספת הדגימה פטרייתי.</li>
		<li>לארוז בגדר לתוך רוטור ספיר 3.2 מ מ, לסחוט בעדינות ולהסיר הממס DNP עודף. להוסיף פקק סיליקון 3.2 מ מ כדי למנוע את אובדן לחות. בדרך כלל, עמוסים 5-30 מ"ג של הדגימה את הרוטור. הסכום המדויק צריך להיקבע על ידי הדרישה רגישות של הניסויים NMR להתנהל.</li>
		<li>הכנס לשחחר מדגם ספקטרומטר DNP, למדוד את קשת משופרת DNP תחת הקרנה במיקרוגל ולהשוות אותם עם הקשת מיקרוגל-off. זה יוביל שיפור מקדם חדוההפעלה/כיבוי, אשר אמור להיות 20-40 עבור חומרים מורכבים אלה. הפעל את הניסויים מעוצב כדי לקבוע מבנה דופן התא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנה של הצמח ביומסה NMR ולימודי DNP
<ol><li>הכנת חומרי צמח NMR של מצב מוצק<ol>
<li>לייצר בצורה אחידה 13התווית על-ידי C צמחים ללא צורך במיקור חוץ באמצעות 13CO2 אספקה קאמרית או 13C-גלוקוז מדיום הגידול כפי שתואר לעיל46,47 או ישירות לרכוש חומרים עם תוויות תיוג-איזוטופ חברות. הערה: 13C-גלוקוז יכול לשמש רק בצמיחה כהה כדי למנוע את כניסתה של 12C על ידי פוטוסינתזה.</li>
		<li>לחתוך בצורה אחידה 13ג שכותרתו חומר צמחי לחתיכות קטנות (בדרך כלל 1-2 מ. מ בממד) באמצעות תער מעבדה. הערה: בהתאם למטרה, קירות התא שהופרד נעשה שימוש לעיתים עבור אפיון מבניים, הפרוטוקולים מפורט מדווחים על מחקרים קודמים21,46.</li>
		<li>אם המדגם היה בעבר יבש, להוסיף 100 µL של מים 30 מ"ג של הצמח חומרים צינור microcentrifuge 1.5 mL, מערבולת, equilibrate בטמפרטורת החדר עבור יום אחד. צנטריפוגה ב x 4,000 g 10 דקות ולהסיר עודפי המים באמצעות פיפטה.</li>
		<li>אם המדגם היה מיובש מעולם לא בשלב כלשהו, להשתמש ישירות המדגם ללא טיפול נוסף.</li>
		<li>חבילת החומרים הצמח שתיווצר לתוך 3.2 מ מ או 4 מ מ ZrO2 רוטורים לניסויים NMR של מצב מוצק.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה של חומרים צמח ללימודי DNP<ol>
<li>להכין פתרון 60 של מניות µL 10 מ מ AMUPol רדיקלית כפי שמתואר שלבים 2.2.1 ו- 2.2.2.</li>
		<li>לחתוך בצורה אחידה 13ג שכותרתו חומר צמחי שילמדו לחתיכות קטנות (1-2 מ מ בממד) באמצעות תער מעבדה ולשקול 20 מ ג של החומרים הצמח.</li>
		<li>יד-לטחון החלקים צמח לתוך חלקיקים קטנים (~ 1-2 מ"מ) באמצעות ומכתש. אבקות הסופי יש מראה הומוגני.</li>
		<li>הוסף µL 40 של הפתרון מניות DNP המבושלות צעד קודם (שלב 2.2.2) לחומר צמח, לטחון במתינות למשך 5 דקות להבטיח הומוגנית ערבוב עם הקיצוני.</li>
		<li>להוסיף עוד 20 µL של הפתרון המניות עוד יותר מימה החומר הצמח לאחר שחיקה.</li>
		<li>חבילת המדגם צמח equilibrated לתוך 3.2 מ מ רוטור ספיר לניסויים DNP. להוסיף פקק סיליקון כדי למנוע את אובדן לחות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. תקן NMR של מצב מוצק ניסויים עבור משלב האפיון הראשוני של Biomaterials עתירי פחמימות
הערה: סקירה קצרה של הניסויים NMR מסופק בסעיף זה. עם זאת, הבהרה מבנית בדרך כלל דורש מומחיות מקיפה. לכן, מומלץ מאמצים משותפים עם NMR spectroscopists.
<ol><li>מדד 1 י 13C לחצות קיטוב (CP), 13C ישירה קיטוב (DP) עם 2-s ו- 35-s המיחזור עיכובים, 1H -13C מיומן48,49 ספקטרה כדי להשיג הבנה כללית של דינמיות הפצה של רכיבים תא (איור 1 א'). קירות התא הם בדרך כלל החלק יחסית נוקשה ולהציג אותות דומיננטי בספקטרום CP.</li>
	<li>למדוד סדרת 2D תקן 13C -13C מתאם ניסויים עבור הקצאות תהודה של אותות 13C. להתחיל עם לקוי refocused50,51 לקבלת קישוריות פחמן, אשר צריך להיות בסיוע סדרה של ניסויים דרך-שטח כגון 1.5-ms RFDR52 (איור 1b) חוט 50-ms/דר53 ניסויים. הערה: אם זה עניין למצוא דוגמא עשירה רכיב מסוים, לדוגמה, ראשית או קירות התא משני, אז מקטעים מרובים או צמחים מרובים עשויים צריך למדוד בנפרד כדי למצוא את הדגימה עם הרכב מיטבי.</li>
	<li>לערוך ניסויים המתאם13C 2D 15N - אשר ניתן למדוד כדי להקל את ההקצאות תהודה של חלבונים ופחמימות nitrogenated. הערה: ההקצאה תהודה היא בדרך כלל זמן רב. שיטה כיום מפותח כדי להקל על המשימה תהודה של פחמימות אותות עבור המדענים הללו ללא ניסיון קודם.</li>
	<li>למדוד את הניסויים יותר מיוחדים כדי לקבוע את מרחבי proximities (איור 1 c, d), הידרציה ואת mobilities של מולקולות מורכבות כדי לקבוע למבנה התלת ממדי של החומרים עתירי פחמימות כמו באופן שיטתי שתוארה לעיל22,29.</li>
</ol>

אין לנו לחשוף.

לעומת שיטות ביוכימיות, NMR של מצב מוצק יש יתרונות כמו טכניקה הרסניות ו ברזולוציה גבוהה. NMR גם כמותיים בניתוח ההלחנה, בניגוד לרוב שיטות אנליטיות אחרות, לא צריך אי הוודאויות שהוצגו על ידי המסיסות מוגבל biopolymers. הקמת בפרוטוקול הנוכחי מקלה על מחקרים עתידיים על פחמימות-עשיר biomaterials, פולימרים functionalized. עם זאת, יצוין כי הקצאה תהודה וניתוח נתונים יכולה לגזול זמן רב, בדרך כלל דורשים הכשרה. המחברים כיום מפתחים כלים, מסדי נתונים כדי לעזור מדענים ללא ניסיון קודם כדי להתגבר על מחסום זה.
מאז...

פחמימות תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים שונים כגון אחסון אנרגיה, בניין מבניים, ועל זיהוי הסלולר אדהזיה. הם מועשרים בקיר התא, אשר היא מרכיב מהותי צמחים, פטריות, אצות, חיידקים1,2,3. קיר התא מהווה מקור מרכזי הייצור של דלק ביולוגי, biomaterials, כמו גם מטרה מבטיחים טיפולים מיקרוביאלית4,5,6,7,8 , 9.
ההבנה העכשווית של חומרים מורכבים אלה כבר מתקדם באופן משמעותי על ידי עשורים של המאמצים הוקדשו אפיון מבניים בשיטות ארבע הגדולות ביוכימי או גנטי. השיטה הראשונה הגדולות מסתמך על טיפולים רציפים באמצעות כימיקלים קשים או אנזימים כדי לשבור את קירות התא לחלקים שונים, שבעקבותיה באה ההלחנה וניתוח הצמדה של סוכרים כל שבר10. שיטה זו שופך אור על התפלגות התחום של פולימרים, אך הפרשנות עלולה להטעות בשל המאפיינים הכימי והפיזי של מולקולות. לדוגמה, קשה לקבוע אם השבר אלקלי-לחילוץ מקורו מחשבים בודדת של מולקולות פחות מובנים או מולקולות נפרדות עם מסיסות דומות. שנית, חילוץ חלקים או את כל קירות התא ניתן גם למדוד באמצעות פתרון NMR כדי לקבוע את קישורים קוולנטיות, גם כינה crosslinking, בין מולקולות שונות11,12,13, 14,15. בדרך זו, יכול להיות ובחן את מבנה נתונים היסטוריים של עוגנים קוולנטיות, אך מגבלות יכולה להתקיים בשל המסיסות נמוכה של סוכרים, מספר קטן יחסית של אתרים crosslinking הבורות של תופעות שאינן קוולנטיות זה מייצבת אריזה רב-סוכר, כולל שטני של מימן, ואן דר Waals כוח, אינטראקציה אלקטרוסטטית, שזירה פולימר. שלישית, זיקה מחייבת היה נחוש במבחנה באמצעות פוליסכרידים מבודד16,17,18,19, אבל הטיהור הליכים עשוי לשנות באופן משמעותי מבנה ותכונות של מולקולות אלה. שיטה זו נכשלת גם לשכפל את התצהיר מתוחכמים והרכבה של מקרומולקולות לאחר ביוסינטזה. לבסוף, פנוטיפ, מורפולוגיה תאים, תכונות מכניות של מוטציות גנטיות עם ייצור הקלוש של רכיב מסוים דופן התא לשפוך אורות על התפקידים המבניים של סוכרים, אבל הראיות מולקולריות יותר יש צורך לגשר על אלה תצפיות מאקרוסקופית עם הפונקציה שעברו הנדסה לאחור של חלבון machineries20.
התפתחויות אחרונות פיתוח ויישום של רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק הציגו הזדמנות ייחודית לפתרון חידות מבניים אלה. ניסויים NMR של מצב מוצק דו-ממדי/תלת-ממדי לאפשר חקירה ברזולוציה גבוהה של הרכב, ארכיטקטורה של חומרים עתירי פחמימות במצב מקורי ללא ההפרעות הגדולות. מבניים מחקרים נערכו בהצלחה על ראשי והן קירות התא משני של צמחים, ביומסה שטופלו catalytically, biofilm חיידקי, הפיגמנט רוחות פטריות ו, לאחרונה על-ידי המחברים, קירות התא שלם בפטריה פתוגניים אספרגילוס fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. ההתפתחות של קיטוב גרעיני דינמי (DNP)32,33,34,35,36,37,38 , 39 , 40 , 41 , 42 מקלה באופן משמעותי על הבהרה מבניים NMR כמו שיפור הרגישות מאת DNP מקצר במידה ניכרת הזמן ניסיוני על biomaterials מורכבים אלה. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את נהלי איזוטופ-תיוג הפטריה fumigatus א והכנת פטרייתי ודוגמאות צמח על אפיון NMR, DNP של מצב מוצק. נהלים תיוג דומים צריך להיות רלוונטי פטריות אחרות שינו בינונית, ההליכים הכנת המדגם צריך להיות בדרך כלל החלים biomaterials עתירי פחמימות אחרות.

<table><tbody><tr><td>אמוניום מוליבדט טטרהידרט</td><td>אקרוס אורגני</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>איזון שקילה אנליטי</td><td>B730439218</td><td>אוהאוס</td><td>דגם PA84C</td></tr><tr><td>ביוקלאב 16 ליטר</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגית</td><td>תאגיד Labconco</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>חנות VWR</td><td>BDH9222</td><td>ב-15-30 מעלות; C</td></tr><tr><td>קובלט (II) כלוריד הקסהידרט</td><td>Honeywell |פלוקה</td><td>60820</td><td>&ge; 98%</td></tr> <tr><td>נחושת (II) סולפט פנטהידראט</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge; 98 %</td></tr> <tr><td>קורנינג LSE אינקובטור טלטול</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>151882</td><td>99.9 אטום %</td></tr><tr><td>D d6-DMSO</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>151874</td><td>99.9 אטומים %</td></tr><tr><td>D d8-glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge; 99 אטום %</td></tr><tr><td>D צינורות דיאליזה 3.2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>דיפוטסיום פוספט</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge; 98</td></tr>% <tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G5516</td><td>&ge; 99.5</td></tr>% <tr><td>Heraus Megafuge 16R צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר 750004271</td><td></td><td>מקסימום RCF 25,830 x גרם</td></tr><tr><td>ערכת הכנסה חד פעמית HR-MAS</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>ברזל (II) סולפט Heptahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge; 99+ %</td></tr> <tr><td>מגנזיום סולפט Heptahydrate</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>לאחסן בטמפרטורה של 18-26 מעלות; C</td></tr><tr><td>מנגן(II) כלוריד טטרהידרט</td><td>אלפא Aesar</td><td>11563</td><td>&ge; 99</td></tr>% <tr><td>מונופוטסיום פוספט</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge; 99</td></tr>% <tr><td>מד pH</td><td>מטלר טולדו</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>טטרסודיום אתילנדיאמין-טטראצטט</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge; 99.5</td></tr>% <tr><td>אבץ גופרתי Heptahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge; 98 %</td></tr><tr><td>12C3, d8-glycerol</td><td>Cambridge Isotope Laboratory</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99.95%; D8, 98%</td></tr><tr><td>13C6-גלוקוז</td><td>סיגמא אלדריך</td><td>364606</td><td>&ge; 99% (CP)</td></tr><tr><td>15N-נתרן חנקתי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge; 98% 15N, &ge; 99 (cp)</td></tr> <tr><td>3.2 מ"מ ספיר NMR רוטור</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>3.2 מ"מ תקע סיליקון</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>4 מ"מ ערכת רוטור MAS</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>זירקוניה</td></tr></tbody></table>

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות nmr של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

פרוטוקול זה מראה איך בצורה אחידה 13ג, 15התווית על-ידי N חומרים פטרייתי יכול להיות והופק כמה חומרים רכים אלה צריך להיות המשיך NMR של מצב מוצק, רגישות משופרת DNP ניסויים. ההליך דוגמת עיבוד של הצמח ביומסה גם מפורט. שיטה זו מאפשרת את המדידה של סדרת 1D ו- 2D 13C -13C /15N מתאמים ספקטרה, המאפשר הבהרה מבניים ברזולוציה גבוהה של מורכבות biomaterials במצב מקורי, עם ההפרעות מינימלי. האיזוטופ-תיוג יכולים להיבדק על ידי לכימות את עוצמת ב 1 י ספקטרה ואת יעילות העברת קיטוב ב- 2D המתאם ספקטרה. ניתן להעריך את ההצלחה של הכנת הדוגמא קיטוב גרעיני דינמי (DNP) על ידי הגורם שיפור הרגישות. לניסויים נוספים לבחון את ההיבטים המבניים של סוכרים, חלבונים יוביל מודל של הארכיטקטורה תלת מימדי. שיטות אלה ניתן לשנותם ולאחר הותאם לחקור מגוון רחב של חומרים עתירי פחמימות, כולל קירות התא הטבעי של צמחים, פטריות, אצות, חיידקים, וכן מסונתז או תוכנן פחמימות פולימרים ומורכב שלהם עם השני מולקולות.

איזוטופ תיוג באופן משמעותי משפר את הרגישות NMR, מאפשרת מדידה של סדרת 2D 13C -13C ו 13C -15N מתאם ספקטרה כדי לנתח את הרכב, לחות, ניידות, אריזה של פולימרים, אשר ניתן לשלב בניית מודל תלת מימדי של דופן התא אדריכלות (איור 1). אם תיוג אחיד מצליחה, ערכה מלאה של 1 י 13C ו 15N ספקטרה ניתן לאסוף בתוך 1 h, כל ספקטרום 2D רגיל צריך לקחת לא יותר מ- 24 שעות של המדידה.
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

פרוטוקול להכנת 13ג,15דוגמאות פטרייתי וצמח התווית על-ידי N רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק וחקירות קיטוב גרעיני דינמי (DNP) מוצג.

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

פרוטוקול זה יכול לשמש להכנת חומרים פטרייתיים וצמחים עבור תהודה מגנטית גרעינית מצב מוצק, או NMR, וקיטוב גרעיני דינמי, או DNP, ניסויים לאפיון מערכת ביולוגית מורכבת. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור ביו-חומרים לרמה של רזולוציה אטומית בסביבתם הטבעית, למשל, בתאים שלמים. רכישת מידע מבני ברזולוציה גבוהה על חומרים פטרייתיים יסייע בפיתוח תרופות נגד פטריות.השיטה מספקת תובנה על הרכב ומבנה של פחמימות מורכבות בקירות תאים פטרייתיים ו ניתן ליישם אותה על אורגניזמים עשירים בפחמימות רבים, כולל צמחים, פטריות, אצות וחיידקים. חלק מהחוקרים עשויים להיאבק עם זיהום פטרייתי בתרבויות התאים שלהם. העצה שלי היא לעקר את המדיום ואת הציוד ביסודיות לפני השימוש כדי למנוע זיהום זה.הדגמה זו תסייע לחוקרים עם ניסיון מועט ב- NMR או בתרבות התאים ללמוד כיצד ליישם טכניקות אלה במערכות פטרייתיות וצמחים. כדי להכין בינוני צמיחה נוזלית ללא תריס, להמיס 6.5 גרם של שמרים לחלץ פפטון דקסטרוז או אבקת YPD ב 100 מיליליטר של מים מזוקקים, ולאחר מכן autoclave הפתרון וכתוצאה מכך במשך 25 דקות ב 134 מעלות צלזיוס. כדי להכין מדיום צמיחה מוצק ללא תריס, להוסיף 6.5 גרם של אבקת אגר YPD ל 100 מיליליטר של מים מזוקקים, ו autoclave את המדיום במשך 25 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, לפני קירור המדיום כ 50 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להעביר 13 עד 15 מיליליטר של מדיום צמיחה מוצק נמס לתוך צלחות פטרי פלסטיק סטרילי בודדים, ומיד מניחים את המכסים על הכלים. כדי להכין פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו צמיחה נוזלית בינונית, להתאים נפח 100 מיליליטר של איזוטופ המכיל מדיום מינימלי ל- pH של 6.6 עם חומצה או בסיס לפי הצורך. לאחר מכן, להמיס את המלחים המפורטים בטבלה 100 מיליליטר של מים מזוקקים, להוסיף פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו צמיחה נוזלית בינונית, ו autoclave הפתרון וכתוצאה מכך במשך 25 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.כאשר הפתרון התקרר לטמפרטורת החדר, להוסיף 100 microliters של פתרון יסודות קורט לנפח כולו של פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו בינוני מינימלי. כדי לגדל את החומרים הפטרייתיים, השתמש בלולאה מאמץ להעביר כמות קטנה של פטריות מאחסון לצלחת YPD, ולתרבת את הפטרייה במשך יומיים באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, השתמש בלולאת חינוך חדשה כדי להעביר יתרון פטרייתי פעיל גדל פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו מדיום צמיחה נוזלית, ולמקום את התרבות ב 30 מעלות צלזיוס ו 220 סיבובים לדקה במשך שלושה עד חמישה ימים באינקובטור רועד.כאשר כמויות גדולות של הפטרייה לכסות את תחתית הבקבוק ולצוף בנוזל, לאסוף את הפטריות על ידי צנטריפוגה להשליך את supernatant. לחות את גלולה עם פתרון מתאים, ולהשתמש מטסות כדי לאסוף על 0.5 גרם של גלולה hydrated היטב עבור NMR ו DNP ניתוחים. לאחר מכן, מערבבים את החומר הנותר עם תסכול 20% גליצרול בצינור חרוטי, ומניחים את המדגם הפטרייתי במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.כדי להכין את A.fumigatus לניתוח NMR מצב מוצק, תחילה להשתמש בשקית דיאליזה עם 3.5 קילודלטון ניתוק משקל מולקולרי כדי דיאליזה 0.5 גרם פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו דגימה פטרייתית נגד ליטר אחד של חיץ פוספט 10 מילימולרית בארבע מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים כדי להסיר מולקולות קטנות מהצמיחה הבינונית. בסוף הדיאליזה, להעביר את המדגם לתוך צינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה, ולארוז 70 עד 80 מיליגרם של הדבק מדגם פחמן-13 תווית אחידה hydrated היטב לתוך רוטור זירקוניום דו חמצני ארבעה מילימטר. השתמש מוט מתכת בעדינות וחוזר על עצמו לסחוט את המדגם, באמצעות נייר לספוג את המים העודפים.לאחר מכן, תכניסו בחוזקה את הרוטור, והכניסו את הדגימה לספקטרומטר לאפיון NMR במצב מוצק. כדי להכין את A.fumigatus לניתוח DNP, להוסיף 100 microliters של מטריצת DNP לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר microcentrifuge לכל פחמן-13, פחמן-15 שכותרתו מדגם פטרייתי, ולהמיס 0.7 מיליגרם של סוכן קיטוב לכל צינור כדי ליצור פתרון מלאי רדיקלי 10 מילימולר. לאחר מערבולת במשך שתיים עד שלוש דקות כדי להבטיח כי רדיקלים מומסים באופן מלא בתמיסה, להשרות 10 מיליגרם של פחמן-13 דיאליזה, חנקן-15 שכותרתו דגימה פטרייתית ב 50 microliters של פתרון הסוכן הקיטוב, ולהשתמש עלה וטיט לטחון קלות את התערובת כדי להבטיח חדירה של הרדיקלים לתוך קירות התא הנקבובי.הוסף עוד 30 microliters של הפתרון הרדיקלי גלולה הקרקע כדי לחות עוד יותר את המדגם פטרייתי, ולארוז את גלולה לתוך רוטור ספיר 3.2 מ"מ. לסחוט במתינות ולהסיר את ממס DNP עודף כפי שהוכח, ולהוסיף תקע סיליקון 3.2 מ"מ כדי למנוע אובדן הידרציה. לאחר מכן, הוסף את הרוטור לספקטרומטר NMR לניסוי שגרתי או ספקטרומטר DNP למדידת הספקטרום המשופר של DNP תחת הקרנה במיקרוגל.כדי להכין חומרים צמחיים למחקרי DNP, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את החומר הצמחי המסומן באופן אחיד בפחמן-13 לחתיכות של מילימטר אחד עד שניים. השתמש מרגמה ועלי לטחון את החלקים לחלקיקים קטנים יותר עד האבקה הסופית יש מראה הומוגני. הוסיפו 40 מיקרוליטרים של תסבומת מלאי רדיקלית של 10 מילימולרים לחומר הצמח, וטחנו קלות את הדגימה במשך חמש דקות נוספות כדי להבטיח ערבוב הומוגני עם הרדיקל.לחות את מדגם הקרקע עם עוד 20 microliters של פתרון מלאי רדיקלי, ולארוז את דגימת הצמח מצויד לתוך רוטור ספיר 3.2 מילימטר לניתוח DNP. לאחר מכן, הכנס תקע סיליקון כדי למנוע אובדן הידרציה, וטען את המדגם על ספקטרופוטומטר DNP. תיוג איזוטופ משפר באופן משמעותי את רגישות ה-NMR ומאפשר מדידת סדרה של פחמן-13-פחמן-13 דו-ממדי וספקטרום מתאם פחמן-13-חנקן-15 כדי לנתח את הרכב, הידרציה, ניידות ואריזה של הפולימרים לשילובם לבניית מודל תלת מימדי של ארכיטקטורת דופן התא.אם קשה להשיג אותות לא אלכסוניים בספקטרום פחמן-13-פחמן-13 דו-מימדי, ייתכן שהתרחש תיוג סטטיסטי. שתי פסגות הפחמן-13 ב-96 ו-92 חלקים למיליון הן אותות חתימה של גלוקוז פחמן-1. לכן, עוצמתם החזקה בספקטרום הקיטוב הישיר כמותי פחמן-13 הנמדדת בעיכובים ארוכים של מיחזור של 35 שניות מצביעה בדרך כלל על הדומיננטיות של מולקולות קטנות עקב דיאליזה או שטיפה לא שלמים.עם דגימות מסומנות היטב, מתאמים ארוכי טווח ניתן למדוד עוד יותר כדי לזהות את הקרבות המרחביות של biomolecules ולבנות מודל מבני של קירות התא שלמים. טכניקה זו מאפשרת לחקור את תפקוד המבנה בחומרים טבעיים ומהונדסים רבים, ומאפשרת מחקרים עתידיים של ביו-חומרים עשירים בפחמימות ופולימרים פונקציונליים. כמו פטריות מסוימות עלולות לגרום לזיהום או מחלות שיטתיות בבני אדם, הקפד לטפל בחומרים פטרייתיים במכסה המנוע לזרימת למינאר להגנה ולמזער את החשיפה.

preparation-fungal-plant-materials-for-structural-elucidation-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אברי הצמח אוויר מוגנים על ידי לציפורן, הרכבה סופראמולקולרית biopolyester שעווה. אנו מציגים פרוטוקולים כדי לפקח על הסרת סלקטיבי של EPI-ושעוות intracuticular מ cuticles פירות עגבניות על סולמות מולקולרית מיקרו ידי NMR מצב מוצק וכן במיקרוסקופ כוח אטומי, בהתאמה, על מנת להעריך את יכולת cross-linking של biopolyesters cuticular מהונדסים.

בידוד מחקר Biophysical של cuticles פירות

שיפור הרגישות המסופק על ידי קיטוב גרעיני דינמי של פירוק (DNP) מאפשר מעקב אחר תהליכים מטבוליים בזמן אמת על ידי NMR ו-MRI. נדונים המאפיינים והביצועים של מערך DNP ייעודי לפירוק המיועד לחקר תגובות אנזימטיות.

פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ&quot;ג

פרוטוקול זה מתאר את הטכניקות הספציפיות המשמשות לאפיון מבני של רצפי גליקוזיל מפחיתים (RE) ואזור פנימי של הטרוקסילנים על ידי תיוג ה-RE עם 2 אמינובנזמיד לפני הידרוליזה אנזימטית (אנדוקסילאנאז) ולאחר מכן ניתוח של האוליגוסכרידים המתקבלים באמצעות ספקטרומטריית מסה (MS) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR).

רצף של הצמח קיר Heteroxylans שימוש enzymic, כימית (מתילציה) הפיזיקליים (ספקטרומטריית מסה, תהודה מגנטית גרעינית) טכניקות

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

מוצג כאן פרוטוקול להעברה קריוגנית של דגימות קפואות לזווית הקסם הדינמית של הקיטוב הגרעיני (DNP) המסתובב (MAS) גשושית תהודה מגנטית גרעינית (NMR). הפרוטוקול כולל הוראות לאחסון רוטור לפני הניסוי וכיוונים למדידות כדאיות לפני ואחרי הניסוי.

דגימה קריוגנית נטענת לתוך זווית קסם ספינינג ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית המשמרת את הכדאיות התאית

31 P NMR הוא כלי רב עוצמה עבור ההבהרה המבנית של פוליפנולים. הליך אנליטי מהיר, קל, מדויק, כמותי ושחזורי מאוד זה, המאפשר כימות ובידול של סוגים שונים של קבוצות הידרוקסיות, פנוליות וקרבוקסיליות בליגנינים וטאנינים הפך כעת לכלי אנליטי שגרתי.

ניתוח כמותי 31P NMR של ליגנינים וטאנינים

מאמר זה מציג את השימוש ב-PSYCHE וב-SAPPHIRE-PSYCHE באפיון מטבולי של צמחים וכולל נהלים מפורטים להכנת דגימות והקלטה אופטימלית של ספקטרום NMR Pure Shift. דוגמאות שבאמצעותן נדון הרווח ברזולוציה שהושג על ידי ניתוק הומו-גרעיני המאפשר הבנה מקיפה יותר של המערכת.

תהודה מגנטית גרעינית Pure Shift: כלי חדש למטבולומיקה של צמחים

מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.

שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

פרוטוקול זה משלב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בהתאמה אישית עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR היפרפולרית כדי למדוד מטבוליזם פירובט בזמן אמת בתאים חיים, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי עבור מחקרים מטבוליים ויישומי סינון תרופות.

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

אנו מתארים נהלים להכנה ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון ממברנה בשלב מעוקב ליפידי עבור קריסטלוגרפיה סדרתית בלייזרים אלקטרונים חופשיים של קרני רנטגן ומקורות סינכרוטרון. ניתן ליישם פרוטוקולים אלה גם לשילוב ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון מסיסים, מה שמוביל להפחתה משמעותית בצריכת הדגימה בהשוואה להזרקת נוזלים.

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

למד הכנת דגימות פטריות וצמחים לספקטרוסקופיית NMR מצב מוצק וקיטוב גרעיני דינמי. שיטה זו מאפשרת אפיון ביוסיסטמים מורכבים ברזולוציה אטומית בסביבתם הטבעית.

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

גלה סרטונים נוספים