הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

פרוטוקול זה יכול לשמש להכנת חומרים פטרייתיים וצמחים עבור תהודה מגנטית גרעינית מצב מוצק, או NMR, וקיטוב גרעיני דינמי, או DNP, ניסויים לאפיון מערכת ביולוגית מורכבת. טכניקה זו מאפשרת לנו לחקור ביו-חומרים לרמה של רזולוציה אטומית בסביבתם הטבעית, למשל, בתאים שלמים. רכישת מידע מבני ברזולוציה גבוהה על חומרים פטרייתיים יסייע בפיתוח תרופות נגד פטריות.

השיטה מספקת תובנה על הרכב ומבנה של פחמימות מורכבות בקירות תאים פטרייתיים ו ניתן ליישם אותה על אורגניזמים עשירים בפחמימות רבים, כולל צמחים, פטריות, אצות וחיידקים. חלק מהחוקרים עשויים להיאבק עם זיהום פטרייתי בתרבויות התאים שלהם. העצה שלי היא לעקר את המדיום ואת הציוד ביסודיות לפני השימוש כדי למנוע זיהום זה.

הדגמה זו תסייע לחוקרים עם ניסיון מועט ב- NMR או בתרבות התאים ללמוד כיצד ליישם טכניקות אלה במערכות פטרייתיות וצמחים. כדי להכין בינוני צמיחה נוזלית ללא תריס, להמיס 6.5 גרם של שמרים לחלץ פפטון דקסטרוז או אבקת YPD ב 100 מיליליטר של מים מזוקקים, ולאחר מכן autoclave הפתרון וכתוצאה מכך במשך 25 דקות ב 134 מעלות צלזיוס. כדי להכין מדיום צמיחה מוצק ללא תריס, להוסיף 6.5 גרם של אבקת אגר YPD ל 100 מיליליטר של מים מזוקקים, ו autoclave את המדיום במשך 25 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, לפני קירור המדיום כ 50 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, להעביר 13 עד 15 מיליליטר של מדיום צמיחה מוצק נמס לתוך צלחות פטרי פלסטיק סטרילי בודדים, ומיד מניחים את המכסים על הכלים. כדי להכין פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו צמיחה נוזלית בינונית, להתאים נפח 100 מיליליטר של איזוטופ המכיל מדיום מינימלי ל- pH של 6.6 עם חומצה או בסיס לפי הצורך. לאחר מכן, להמיס את המלחים המפורטים בטבלה 100 מיליליטר של מים מזוקקים, להוסיף פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו צמיחה נוזלית בינונית, ו autoclave הפתרון וכתוצאה מכך במשך 25 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.

כאשר הפתרון התקרר לטמפרטורת החדר, להוסיף 100 microliters של פתרון יסודות קורט לנפח כולו של פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו בינוני מינימלי. כדי לגדל את החומרים הפטרייתיים, השתמש בלולאה מאמץ להעביר כמות קטנה של פטריות מאחסון לצלחת YPD, ולתרבת את הפטרייה במשך יומיים באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, השתמש בלולאת חינוך חדשה כדי להעביר יתרון פטרייתי פעיל גדל פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו מדיום צמיחה נוזלית, ולמקום את התרבות ב 30 מעלות צלזיוס ו 220 סיבובים לדקה במשך שלושה עד חמישה ימים באינקובטור רועד.

כאשר כמויות גדולות של הפטרייה לכסות את תחתית הבקבוק ולצוף בנוזל, לאסוף את הפטריות על ידי צנטריפוגה להשליך את supernatant. לחות את גלולה עם פתרון מתאים, ולהשתמש מטסות כדי לאסוף על 0.5 גרם של גלולה hydrated היטב עבור NMR ו DNP ניתוחים. לאחר מכן, מערבבים את החומר הנותר עם תסכול 20% גליצרול בצינור חרוטי, ומניחים את המדגם הפטרייתי במינוס 80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

כדי להכין את A.fumigatus לניתוח NMR מצב מוצק, תחילה להשתמש בשקית דיאליזה עם 3.5 קילודלטון ניתוק משקל מולקולרי כדי דיאליזה 0.5 גרם פחמן-13, חנקן-15 שכותרתו דגימה פטרייתית נגד ליטר אחד של חיץ פוספט 10 מילימולרית בארבע מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים כדי להסיר מולקולות קטנות מהצמיחה הבינונית. בסוף הדיאליזה, להעביר את המדגם לתוך צינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה, ולארוז 70 עד 80 מיליגרם של הדבק מדגם פחמן-13 תווית אחידה hydrated היטב לתוך רוטור זירקוניום דו חמצני ארבעה מילימטר. השתמש מוט מתכת בעדינות וחוזר על עצמו לסחוט את המדגם, באמצעות נייר לספוג את המים העודפים.

לאחר מכן, תכניסו בחוזקה את הרוטור, והכניסו את הדגימה לספקטרומטר לאפיון NMR במצב מוצק. כדי להכין את A.fumigatus לניתוח DNP, להוסיף 100 microliters של מטריצת DNP לתוך צינור אחד 1.5 מיליליטר microcentrifuge לכל פחמן-13, פחמן-15 שכותרתו מדגם פטרייתי, ולהמיס 0.7 מיליגרם של סוכן קיטוב לכל צינור כדי ליצור פתרון מלאי רדיקלי 10 מילימולר. לאחר מערבולת במשך שתיים עד שלוש דקות כדי להבטיח כי רדיקלים מומסים באופן מלא בתמיסה, להשרות 10 מיליגרם של פחמן-13 דיאליזה, חנקן-15 שכותרתו דגימה פטרייתית ב 50 microliters של פתרון הסוכן הקיטוב, ולהשתמש עלה וטיט לטחון קלות את התערובת כדי להבטיח חדירה של הרדיקלים לתוך קירות התא הנקבובי.

הוסף עוד 30 microliters של הפתרון הרדיקלי גלולה הקרקע כדי לחות עוד יותר את המדגם פטרייתי, ולארוז את גלולה לתוך רוטור ספיר 3.2 מ"מ. לסחוט במתינות ולהסיר את ממס DNP עודף כפי שהוכח, ולהוסיף תקע סיליקון 3.2 מ"מ כדי למנוע אובדן הידרציה. לאחר מכן, הוסף את הרוטור לספקטרומטר NMR לניסוי שגרתי או ספקטרומטר DNP למדידת הספקטרום המשופר של DNP תחת הקרנה במיקרוגל.

כדי להכין חומרים צמחיים למחקרי DNP, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את החומר הצמחי המסומן באופן אחיד בפחמן-13 לחתיכות של מילימטר אחד עד שניים. השתמש מרגמה ועלי לטחון את החלקים לחלקיקים קטנים יותר עד האבקה הסופית יש מראה הומוגני. הוסיפו 40 מיקרוליטרים של תסבומת מלאי רדיקלית של 10 מילימולרים לחומר הצמח, וטחנו קלות את הדגימה במשך חמש דקות נוספות כדי להבטיח ערבוב הומוגני עם הרדיקל.

לחות את מדגם הקרקע עם עוד 20 microliters של פתרון מלאי רדיקלי, ולארוז את דגימת הצמח מצויד לתוך רוטור ספיר 3.2 מילימטר לניתוח DNP. לאחר מכן, הכנס תקע סיליקון כדי למנוע אובדן הידרציה, וטען את המדגם על ספקטרופוטומטר DNP. תיוג איזוטופ משפר באופן משמעותי את רגישות ה-NMR ומאפשר מדידת סדרה של פחמן-13-פחמן-13 דו-ממדי וספקטרום מתאם פחמן-13-חנקן-15 כדי לנתח את הרכב, הידרציה, ניידות ואריזה של הפולימרים לשילובם לבניית מודל תלת מימדי של ארכיטקטורת דופן התא.

אם קשה להשיג אותות לא אלכסוניים בספקטרום פחמן-13-פחמן-13 דו-מימדי, ייתכן שהתרחש תיוג סטטיסטי. שתי פסגות הפחמן-13 ב-96 ו-92 חלקים למיליון הן אותות חתימה של גלוקוז פחמן-1. לכן, עוצמתם החזקה בספקטרום הקיטוב הישיר כמותי פחמן-13 הנמדדת בעיכובים ארוכים של מיחזור של 35 שניות מצביעה בדרך כלל על הדומיננטיות של מולקולות קטנות עקב דיאליזה או שטיפה לא שלמים.

עם דגימות מסומנות היטב, מתאמים ארוכי טווח ניתן למדוד עוד יותר כדי לזהות את הקרבות המרחביות של biomolecules ולבנות מודל מבני של קירות התא שלמים. טכניקה זו מאפשרת לחקור את תפקוד המבנה בחומרים טבעיים ומהונדסים רבים, ומאפשרת מחקרים עתידיים של ביו-חומרים עשירים בפחמימות ופולימרים פונקציונליים. כמו פטריות מסוימות עלולות לגרום לזיהום או מחלות שיטתיות בבני אדם, הקפד לטפל בחומרים פטרייתיים במכסה המנוע לזרימת למינאר להגנה ולמזער את החשיפה.