בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

הדרך הסטנדרטית להשיג תא גזע עיסת שיניים הוא יעיל מאוד, וזה תלוי במספר משתנים. הפרוטוקול שלנו איפשר להשיג בידוד מוצלח של תאי גזע משיניים מטופלות ב-90% מהמקרים. השגת מספר גבוה של תאים בתוך כמה שבועות הוא היתרון העיקרי.

זה מאפשר לנו להשתמש בתא ברפואה רגנרטיבית וליצור ביו-בנק המספק למדענים אחרים את הכלי השימושי הזה. ההליך לפתיחת השן יתבצע על ידי ד"ר קונסטנטינו Santacroce. לאחר מכן, הפרוטוקול יוצג על ידי סטפנו מרטלוצ'י, דוקטורנט מהמעבדה שלי, שהוא המחבר הראשון של המאמר.

כדי להתחיל, לחלץ את הטוחן השלישי מהמטופל, לשטוף אותו במהירות עם PBS, לשים במבחנה 15 מיליליטר עם המדיום, ולהעביר אותו למעבדה בתוך פחות משעה. מתחת למכסה המנוע biohazard, להשתמש חותך כדי לפתוח את השן על ידי מעבר חיתוך coronal, מקביל ומשותק, דרך הגג של תא עיסת. עם חופר קטן, בעדינות להסיר את עיסת, ולמקום אותו במבחנה.

לאחר מכן, לשטוף עם PBS שלוש פעמים, צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר את העל-טבעי. תן שוב את גלולת הפתרון של האנק, ולהעביר את הדגימה לצלחת פטרי.

הסר את הפתרון של האנק על ידי צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן, עם אזמל חד פעמי, מחלקים את העיסה לפרוסות של כמילימטר אחד, ומוסיפים מיליליטר אחד של קולגן מסוג IV. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם ב 2, 500 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.

הסר את העל-טבעי, ולחץ מחדש על גלולה במדיום. תרבות זה בבקבוק T25 ספציפי לתאי גזע ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני. במהלך תקופת הדגירה, לשנות את מדיום התרבות כל שלושה ימים.

לאחר התאים חסיד להגיע להתכנסות, להוסיף מיליליטר אחד של פתרון טריפסין-EDTA לתאים כדי לנתק אותם, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום התרבות ביחס של אחד עד חמישה כדי לעצור את הפעולה טריפסין, צנטריפוגה ההשעיה התא ב 259 פעמים g במשך שש דקות. הסר את העל-טבעי.

לאחר מכן, מניחים את התאים בבקבוק T25 כדי להפיץ. לאחר מכן, לנתק את התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 259 פעמים g במשך שש דקות.

הסר את העל-טבעי והמשך לבדוק את התאים לצורך ניתוח ציטופלוורימטרי. כדי לבצע את שלב השתקה חלבון פריון חולף, התרבות הראשונה תאי גזע עיסת שיניים אנושיים צלחות שש באר עם שני מיליליטר של מדיום התרבות במשך 24 שעות. לאחר מכן, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של מדיום ה-RNA PrP המפריע הקטן לכל דגימה, והדגירה אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך שש שעות.

מבלי להשליך את מדיום siRNA PrP, להוסיף 1.6 מיליליטר של מדיום התרבות ביחס של אחד עד חמש, ולהשאיר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות. לאחר תקופת הדגירה, להסיר את supernatant, ולשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מוסיפים שני מיליליטר של מדיום התרבות העצבית, ולשמור את התאים במשך שבעה עד 14 ימים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר תקופת הדגירה, לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר, ולהמשיך ניתוח כתם מערבי כדי לבדוק אנטיגנים משטח עצבי. כדי לבצע את תהליך אינדוקציה עצבית, תרבות 2 מיליון תאי גזע עיסת שיניים אנושיים בצלחות שש באר, עד 28 ימים מן ההפרדה עיסת. כל שלושה ימים, השלך את העל-טבעי.

לשטוף שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר, ולהחליף שני מיליליטר של מדיום התרבות העצבית. לאחר שבעה עד 14 ימים, לנתק את התאים עם מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף ארבעה מיליליטר של מדיום התרבות ביחס של אחד עד חמישה כדי לעצור את פעולת טריפסין.

כדי לאפיין את תאי גזע עיסת השיניים האנושיים על ידי ציטומטריה זרימה, תרבות 2 מיליון למיליליטר של התאים בצלחות שש באר עם שני מיליליטר של מדיום התרבות. ב 28 ימים לאחר הפרדת עיסת שיניים או לאחר 14 ימים נוספים עם מדיום תרבות עצבית, להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום התרבות ביחס של אחד עד חמישה כדי לעצור את הפעולה טריפסין, ו centrifugate ב 259 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך שש דקות.

תקן את התאים שאינם מטופלים או מטופלים עם 300 microliters של 4% paraformaldehyde ב PBS בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה, להשליך את supernatant, ולחלחל התאים עם 1% לא יוני פעילי שטח PBS בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות נוספות. לאחר מכן, צנטריפוגה שוב, להשליך את supernatant, ולבצע את החסימה עם 5% חלב מיובש דל שומן במיליליטר אחד של PBS בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.

לשטוף שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS, ולהדק את התאים עם אנטי CD105, אנטי CD44, אנטי STRO-1, אנטי CD90, אנטי CD73, אנטי בטא שלוש-tubulin, אנטי NFH, ו נוגדנים חד שבטיים נגד GAP43 בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים שוב שלוש פעמים רצופות עם מיליליטר אחד של PBS במרווחים של שש דקות, ולאחר מכן דגירה עם PE נגד עכבר או נוגדנים חד שבטיים CY5 אנטי ארנב בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת נוספת. השתמש בנוגדנים המשניים לצורך גתת התאים החיוביים לחיסון, ונתח את כל הדגימות באמצעות ציטומטר זרימה.

תרבות 2 מיליון תאים למיליליטר של תאי גזע עיסת שיניים אנושיים בצלחות שש באר עם שני מיליליטר של מדיום התרבות. ב 21 ו 28 ימים לאחר הפרדת עיסת שיניים או לאחר שבעה עד 14 ימים נוספים עם מדיום התרבות העצבית, להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות כדי לנתק את התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה, להשליך את supernatant, ולאחר מכן לתקן את הדגימות עם 4% paraformaldehyde ב PBS בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה, להשליך את supernatant, ולאחר מכן לחלחל עם 1% לא יוני פעילי שטח PBS בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מוציאים את העל-טבעי, ומכתימים את התאים בנוגדן חד שבטי נגד PrP בטמפרטורת החדר למשך שעה. לבסוף, צנטריפוגה, להשליך את supernatant, ולאחר מכן דגירה עם נוגדן נגד ארנב CY5 חד שבטי בטמפרטורת החדר במשך שעה נוספת.

לנתח את כל הדגימות עם ציטומטר זרימה. לאחר הפרדת עיסת, אשכולות של תאי גזע עיסת שיניים אנושיים הורחבו בפריפריה. השוואה בין הצמיחה של תאים אלה לפני ואחרי ההבחנה העצבית המושרה על ידי EGF / bFGF הראה שינויים משמעותיים במורפולוגיה התא נויריטס גדילה.

תאי גזע עיסת שיניים אנושיים לא מטופלים הביעו אנטיגנים רב-תכליתיים של משטחים ספציפיים לסטרומליים, כגון CD44, CD90, CD105, CD73 ו- STRO-1. לאחר גירויים אינדוקציה עצביים מתאימים, תאים אלה הביעו סמנים עצביים ספציפיים, כגון בטא שלוש-tubulin, NFH, ו GAP43. תאים לא מטופלים או מטופלים לא הביעו סמנים hematopoietic, כגון CD14 ו- CD19.

לאחר 28 ימים, חלבון פריון בא לידי ביטוי באופן תלול בתאי גזע עיסת שיניים אנושיים בהשוואה לשליטה השלילית המתאימה, והביטוי שלו הוגדל לאחר תהליך ההידול העצבי המושרה על ידי EGF / bFGF. ניתוח כתם מערבי הראה כי השתקה של חלבון הפריון על ידי sRNA לפני גירויים EGF / bFGF יכול להשפיע על תהליך ההידול העצבי של תאי גזע עיסת שיניים אנושיים על ידי מניעת הביטוי של סמנים עצביים בטא שלוש-tubulin ו NHF. הדבר החשוב ביותר הוא הבחירה של האנזים להפריד את התאים מן עיסת.

למעשה, אם האנזים הוא אגרסיבי מדי, התאים עלולים להיפגע ויכולת הצמיחה וההתברואה שלהם עלולה להיפגע. תאי גזע עיסת שיניים הם מודל ניסיוני מעולה אשר ניתן להשתמש בו vivo ו in vitro מחקרים בתחום הרפואה הרגנרטיבית. מאז PrP ממלא תפקיד מפתח בתהליך ההידול העצבי של תאי גזע עיסת שיניים, סמן זה עשוי להיות מועמד מצוין כיעד יעיל במחלות ניווניות.

ההיבט החשוב ביותר לייעץ הוא מצבם הבריאותי של החולים, כגון היעדר מחלות זיהומיות.