Name: ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למדו לייצר חיסון ביולוגי אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 באמצעות שיטת ביטוי חלבונים בצמחים אכילים. הפרוטוקול מדגים ייצור אנטיגנים בכרובית אדומה לשימוש בהשראת סבילות אוראלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המשותף "שימוש בצמחים לייצור חיסון אכיל סוכרת אוטואימונית (eDIVA)" (מזהה הפרוייקט: 891854) ממומן על ידי האוניברסיטה של ורונה, במסגרת השיחה 2014.

<ol><li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+The+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li>
<li>Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+recovery+of+recombinant+proteins+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants.</a> Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).</li>
<li>Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-made+pharmaceuticals+for+the+prevention+and+treatment+of+autoimmune+diseases%3A+Where+are+we%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we?</a> Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).</li>
<li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li>
<li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pediatric+Reviews%22%5BJournal%5D)">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li>
<li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system%3A+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories%3A+Bacteria%2C+Insect+Cells+and+Plant+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li>
<li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+beet+%28Beta+vulgaris%29+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding%2C+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).</li>
<li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li>
<li>Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction">https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction</a> (2015).</li>
<li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li>
<li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery%3A+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li>
<li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+%E2%80%93+a+new+era+of+prophylaxis%3A+current+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology+and+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).</li>
<li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+science%22%5BJournal%5D)">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, FSO217 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

במחקר זה הראינו ניתוח ראשוני על עיצוב האתר של חיסון אוראלי מועמד לטיפול בסוכרת אוטואימונית. החלבון היעד עבור ניסוי זה היה בצורת מוטציה kDa 65 בני אדם Decarboxylase גלוטמט, אשר ייצור ופונקציונליות הם לזיהוי בקלות וניתנת למדידה12. הביטוי שלה ברקמות צמח מאכל שונים הייתה מתווכת על-ידי וקטורים5, אשר לתווך רמה גבוהה של חלבון רקומביננטי ייצור במסגרת זמן קצר מאוד. הבחירה של הצמח המועמד הטוב ביותר מארח אכיל בוצעה מבוסס על הביטוי eGFP, סלק אדום, תרד עלים על-ידי agroinfiltration ידנית...

מאז המהפכה ביולוגיה מולקולרית צמח בשנות ה-80, מערכות מבוססות-מפעל לייצור ביופרמצבטיקה יכול להיחשב כאלטרנטיבה למערכות מסורתית המבוססת על חיידקים בתרבית של תאים1. צמחים להציג כמה יתרונות על פני פלטפורמות מסורתי, עם מדרגיות, עלות האפקטיביות והבטיחות להיות הרלוונטיים ביותר2. המוצר רקומביננטי ניתן לטהר מרקמות הצמח טרנספורמציה, ואז מנוהל, גם parenterally או בעל פה, יתר על כן, צמח מאכל טרנספורמציה ניתן להשתמש ישירות עבור משלוח אוראלי. תוואי אוראלי בו זמנית מקדם חסינות הרירית ומערכתית, זה מבטל את הצורך של מחטים וצוותים רפואיים מיוחדים. יתר על כן, משלוח אוראלי מבטלת את העיבוד במורד הזרם מורכבים, עובייה בד כ 80% של העלות הייצור הכולל של חלבון רקומביננטי3. כל היתרונות הללו יכול להיות מתורגם חסכון בעלויות ייצור, אספקה, העבודה הפחתת העלויות של כל מנה, לבצע את התרופה במחיר נוח רוב האוכלוסייה הכללית.
מספר אסטרטגיות, הן עבור שינוי יציב, ביטוי ארעי, פותחו לייצור של חומרים בצמחים. ביניהם, מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח המפורקים תשואה גבוהה (למשל, magnICON) מספק ביצועים מעולים מובילים תפוקה גבוהה של חומרים על צירי זמן קצר יחסית4. דוגמאות רבות של ביטוי ארעי באמצעות מערכת מבוססת-וירוס הביטוי צמח בצמחים benthamiana טבק ידווחו, להיות המארח ייצור תקן הזהב. עם זאת, צמח מודל זה לא נחשב זן אכיל בשל של אלקלואידים אחרים מטבוליטים רעילים שאינן שהצטברו העלים שלו.
בעבודה זו, אנו מתארים את ההשוואה בין שתי מערכות צמח אכיל, סלק אדום (בטא דלקתית קורות חיים Moulin Rouge) ותרד (Spinacea הבר קורות חיים תעשייה), עבור הביטוי של שתי צורות המועמד איזופורם 65 kDa חומצה גלוטמית decarboxylase (GAD65), בוצע על ידי המפעל מבוסס-וירוס המומנט5. GAD65 autoantigen העיקריים הקשורים לסוכרת סוג 1 (T1D) וזה כרגע תחת חקירה בניסויים קליניים אנושי כדי למנוע או לעכב את T1D על ידי גרימת רגישות6. הייצור של GAD65 בצמחים בהרחבה נחקרה במין צמח מודל כמו טבק tabacum ו- benthamiana (ש ע)4,5,6,7. כאן, אנו מתארים את השימוש מיני צמחים אכילים לייצור המולקולה ברקמות זה הכוונה על משלוח אוראלי ישירה. מנקודת מבט טכנית, אנחנו למד ונבחר את המערכת עבור הצמח agroinfiltration ואת פלטפורמת צמח אכיל לייצור GAD65 על-ידי הערכת פרמטרים שונים: רמות הביטוי חלבון רקומביננטי, החיוב מיקרוביאלי שיורית בצמח רקמות מיועד משלוח אוראלי, ההתנגדות של GAD65 כדי עיכול קיבה ולאחר את אקוויוולנטיות של הצמחים טרנספורמציה עם סוג הפרוע.

<table><tbody><tr><td>0.2-&mu; m מסנני ממברנה Minisart RC4</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash; מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M3148</td><td>רעיל; 4% ליצירת חיץ העמסה עם גליצרול, SDS ו-Tris-HCl</td></tr><tr><td>4-חומצה מורפולינאתינסולפונית (MES)</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5.5</td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma</td><td>27221</td> אצטוניטריל <td>קורוזיבי</td></tr><tr><td>LC-MS דרגה</td><td>Sigma</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Toxic &ndash; מלאי 0.1 מ' ב-DMSO</td></tr><tr><td>Agar Bacteriological Grade</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td>15 גרם/ליטר לייצור מדיום LB (pH 7.5 עם NaOH) עם תמצית שמרים, NaCl וטריפטון</td></tr><tr><td>אמוניום פורמט</td><td>Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-eGFP</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד GAD 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד LHCB2</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>כחול מבריק R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18 עמודה</td><td>גרייס</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 (150 מ"מ x 2.1 מ"מ; 3 &mu; מ) טור</td></tr><tr><td>C18 עמוד משמר</td><td>גרייס</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Alltima HP C18 ( 7.5 מ"מ x 2.1 מ"מ; 5 &mu; m) Guard&nbsp; עמודה</td></tr><tr><td>CalMag Grower</td><td>פיטר אקסל</td><td>15-5-15</td><td>דשן</td></tr><tr><td>קרבניצילין דיסודיום</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה כימילומינסנציה</td> רעילה <td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc Touch Imaging</td></tr><tr><td>System Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>חומר ניקוי</td><td>סיגמא</td><td>P5927</td><td>פוליסורבט 20</td></tr><tr><td>קורא פלואורסצנטי</td><td>פרקין-אלמר</td><td>&nbsp; 1420-011</td><td>VICTOR Multilabel Counter</td></tr><tr><td>חומצה פורמית LC-MS כיתה</td><td>סיגמא</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>15% ליצירת מאגר טעינה עם Tris-HCl, SDS ו-2&ndash; מרקפטואתנול</td></tr><tr><td>GoTaq G2 פולימראז</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td> עמוד <td>HILIC קורוזיבי</td></tr><tr><td></td><td>גרייס</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Ascentis Express HILIC (150 מ"מ x 2.1 מ"מ; גודל חלקיקים 2.7 &mu; מ)</td></tr><tr><td>טור משמר HILIC עמוד</td><td>גרייס</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>Vision HT HILIC (7.5 מ"מ x 2.1 מ"מ; 3 &mu; m) Guard&nbsp; עמודה</td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז (HRP) - נוגדן מצומד נגד ארנב</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>אין להקפיא/להפשיר יותר מדי פעמים</td></tr><tr><td>HPLC Autosampler</td><td>בקמן קולטר</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>מערכת זהב 508 דגימה אוטומטית</td></tr><tr><td>HPLC מערכת</td><td>בקמן קולטר</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>System Gold 128 מודול ממס HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>דליק Kanamycin sulfate</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>2 גרם/ליטר עם NaCl, Na2HPO4 ו-KH2PO4 לייצור PBS</td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2.4 גרם/ליטר עם NaCl , Na2HPO4 ו-KCl לייצור PBS</td></tr><tr><td>Loading Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminol פתרון Ge</td><td>Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>הכן את הפתרון באמצעות הערכה המסחרית ECL Prime Western Blotting System</td></tr><tr><td>Lyophilizator</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&nbsp; -</td><td>Bruker Esquire 6000; ספקטרומטר המסה צויד במקור ESI והאנלייזר היה מלכודת יונים</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חסימת חלב</td><td>Ristora</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td>3% ב-PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>לשימוש עם NaH2PO4 לייצור חוצץ נתרן פוספט</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>80 גרם/ליטר עם KCl, Na2HPO4 ו-KH2PO4 לייצור PBS; 10 גרם/ליטר לייצור מדיום LB (pH 7.5 עם NaOH) עם תמצית שמרים, טריפטון ואגר דרגה בקטריולוגית</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&nbsp; יש להשתמש עם Na2HPO4 ליצירת חוצץ נתרן פוספט; 14.4 גרם/ליטר לייצור PBS</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת ניטרוצלולאז</td><td>Ge Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>פפסין מרירית קיבה חזירית</td><td>Sigma</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>מצע פרוקסידאז ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td>חומר רגיש</td></tr><tr><td>לאור משאבת ואקום מכבש</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>מגיב A</td><td>סיגמא</td><td>B9643</td><td>השתמש ב-50 חלקים של מגיב זה עם חלק אחד של מגיב B להכנת תמיסת עבודה BCA</td></tr><tr><td>מגיב B</td><td>סיגמא</td><td>B9643</td><td>השתמש בחלק אחד של מגיב זה עם 50 חלקים של מגיב A להכנת תמיסת עבודה BCA</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Toxic &ndash; מלאי 25 מ"ג/מ"ל ב-DMSO</td></tr><tr><td>SDS (נתרן דודציל סולפט)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>דליק, רעיל, מאכל -10% מלאי; 3% ליצירת מאגר טעינה עם Tris-HCl, גליצרול ו-2&ndash; מרקפטואתנול</td></tr><tr><td>נתרן מטאביסולפיט</td><td>סיגמא</td><td>7681-57-4</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סוניקטור</td><td>Soltec</td><td>090.003.0003</td><td>Sonica&reg; 2200 MH; תדר 40 קילו-הרץ</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>Terumo</td><td>&nbsp; &nbsp; -</td><td></td></tr><tr><td>שקוף קבוע 300-& מיקרו; L הכנס צינורות זכוכית</td><td>Thermo Scientific</td><td>11573680</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>התאם את ה-pH עם 1N HCl כדי ליצור מאגר Tris-HCl, השתמש ב-1,5M Tris-HCl (pH 6.8) כדי ליצור מאגר טעינה עם SDS, גליצרול ו-2&ndash; מרקפטואתנול</td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td>10 גרם/ליטר להכנת מדיום LB (pH 7.5 עם NaOH) עם תמצית שמרים, NaCl ו-Agar רכז ואקום בדרגה בקטריולוגית</td></tr><tr><td></td><td>Heto</td><td>3878 F1-3</td><td>Speed-vac</td></tr><tr><td>System מים בדרגת LC-MS</td><td>סיגמא</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>סיגמא</td><td>Y1333</td><td>5 גרם/ליטר לייצור מדיום LB (pH 7.5 עם NaOH) עם טריפטון, NaCl ו-Agar דרגה בקטריולוגית</td></tr></tbody></table>

ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

הצמח בחקלאות מולקולרי הוא השימוש של צמחים כדי לייצר מולקולות של עניין. בפרספקטיבה הזו, צמחים עשוי לשמש הן ריאקטורים על ההפקה ועל טיהור עוקבות של המוצר הסופי, למסירה אוראלי ישירה של חלבונים heterologous בעת שימוש מיני צמחים אכילים. בעבודה זו, אנו מציגים הפיתוח של חיסון אוראלי המועמד נגד סוכרת סוג 1 (T1D) מערכות צמח אכיל בעזרת טכנולוגיה מבוססת-וירוס דנ א רקומביננטי צמח המפורקים, הנכללת הסתננות ואקום. התוצאות שלנו מראים כי סלק אדום פונדקאי מתאים לביטוי ארעית autoantigen נגזר האנושי קשור T1D, נחשב מועמד מבטיח כמו חיסון T1D. עלים לייצר את autoantigen מאופיינים ביסודיות שלהם עמידות עיכול קיבה, נוכחות של מטען חיידקי שיורית, שלהם פרופיל מטבולי המשני, נותן סקירה כללית של תהליך הייצור לשימוש פוטנציאלי הצמחים עבור משלוח אוראלי ישירה של חלבון heterologous. הניתוח שלנו הראה השפלה כמעט מוחלטת של המועמד הליחה חיסון אוראלי בעקבות עיכול קיבה מדומה, רומז כי אסטרטגיית כימוס בייצור של החיסון גד הצמחי נדרש.

בעבודה זו, מוצג את זרימת העבודה עבור הפיתוח של חיסון אוראלי ברקמות הצמח אכיל. המוקד של עבודה זו היא הביטוי של חלבון המטרה זן צמח אכיל מארח אפיון חיסון אוראלי פוטנציאליים.
הצעד הראשון מעורב הערכת ההתאמה של הטכנולוגיה מבוססת-וירוס הביטוי צמח כדי לייצר חומרים במערכות צמח אכיל. למטרה זו, תחילה נשתמש את eGFP בתור דגם חלבון, אנחנו המבוטא זה שתי מערכות צמחים בעלי עלים אכילים: סלק אדום ותרד. הצמחים היו באופן ידני agroinfiltrated עם השעי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מועמד חיסון אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 במפעל אכיל.

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

בין האסטרטגיות השונות לייצור חלבון רקומביננטי בצמחים, ביטוי VERS על בסיס צמחי מפורק מספק ביצועים מעולים, מה שמוביל לתשואות גבוהות על פני מסגרת זמן קצרה יחסית. שכפול של טכנולוגיה זו לייצור חיסון אוראלי טומן בחובו פוטנציאל גדול להפוך לחלופה לחיסונים קונבנציונליים בעתיד הקרוב. עלי סלק אדומים Lyophilized טרנספורמציה ארעית צובר כמות של אנטיגנים צילום מתאים אינדוקציה סובלנות אוראלית במניעת סוכרת מסוג אחד.פרוטוקול ניסיוני זה יכול להיות מורחב למינים אכילים רבים ושונים לאחר הערכה מקרה לגופו של הצטברות חלבון רקומביננטי. הדגמת ההליך תהיה אדוארדו ברתיני, מתיה סנטוני, אנה קוקורולו ורוברטה זמפיירי. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל סלק אדום וצמחי תרד בתא צמיחה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר נביטת זרעים, להפרות את הצמחים פעמיים בשבוע עם פתרון של דשן זמין מסחרית בריכוז של גרם אחד לליטר. למילוי אגרו-סינון, יש להשתמש בתרד בן חמישה שבועות ובצמחי סלק אדומים בני שישה שבועות. לאחר בניית וקטורים ביטוי הצמח, לחסן את שלושת טרנספורמנטים A.tumefaciens ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל ריפאמפיץ בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר ואנטיביוטיקה ספציפית וקטור כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.לגדול על ידי רועד לילה ב 28 מעלות צלזיוס. למחרת, גלולה תרבות חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4500 פעמים G במשך 20 דקות. תן שימוש חוזר את גלולה ב 100 מיליליטר של חיץ חדירה המכיל 10 MES מילימולרית ו 10 מגנזיום גופרתי מילימולארי.דגירה המתלים בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות. מערבבים נפח שווה של מתלה חיידקי המכיל את אחד המודולים המוצגים כאן, עם חמשת המודולים הראשיים ומודול האיטגרייס. באמצעות מזרק ללא מחט, להוציא חמישה מיליליטר של תערובת ההשעיה.לחץ על קצה המזרק על החלק התחתון של עלה הצמח תוך הפעלת בעדינות נגד לחץ בצד השני של העלה. הסתננו לשלושת העלים המורחבים לחלוטין, החל מהעלים, עבור כל צמח. סמן את העלים המותנים עם תג הנייר על גזע העלה.ואז להחזיר את הצמחים לתא הצמיחה בתנאים סטנדרטיים. בימים 4 עד 14 לאחר ההדבקה, לאסוף את העלים agroinfiltrated ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. אחסן את רקמת הצמח במינוס 80 מעלות צלזיוס.ראשית, לגדל בנפרד את שלושת טרנספורמנטים A.tumefaciens ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל ריפאמפיצין בריכוז של 50 microliters למיליליטר, ואנטיביוטיקה ספציפית וקטור מתאים על ידי רועד לילה ב 28 מעלות צלזיוס. למחרת, גלולה תרבות חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4500 פעמים G במשך 20 דקות. תן את גלולה ב 1 ליטר של חיץ חדירה ל OD600 של 0.35, ולהדגיר את המתלים בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות.לאחר מכן הוסף 0.01% של חומר הניקוי לכל השעיה. מערבבים נפח שווה של מתלה חיידקי המכיל את אחד המודולים המוצגים כאן עם חמשת המודולים הראשיים ומודול האיטגרייס. הכנס צמח סלק אדום אחד בן שישה שבועות למחזיק.להפוך את המחזיק ולהמקם אותו על גבי מקור המכיל שני ליטרים של אמבטיית הסתננות כדי להטביע את העלים בהשעיית החדירה. לאחר מכן, להעביר את אמבטיית ההסתננות עם הצמח שקוע לתא החדירה ולסגור אותו. הפעל את משאבת ואקום ולפתוח את שסתום צריכת ואקום על תא החדירה.ברגע שהלחץ בתא ירד ל-90 מ"מ, שמרו על הוואקום למשך שלוש דקות. ואז לשחרר את הוואקום במשך 45 שניות. כאשר התא חזר ללחץ אטמוספרי, פתח את התא והסר את הצמח שחדר מהאמבטיה החיידקית.להחזיר את הצמח לתא הצמיחה. ביום הביטוי המקסימלי, לקצור את העלים הסתננו להקפיא אותם בחנקן נוזלי כפי שתואר קודם לכן. ראשית, לקצור את הדלתא agroinfiltrated ואקום 87 GAD65mut מבטא עלים סלק אדום בשיא הביטוי, ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי.ליופיליזציה של העלים הקפואים במינוס 50 מעלות צלזיוס וב-0.04 מיליבאר למשך 72 שעות. ואז לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כאשר מוכנים להמשיך, טוחנים את העלים לאבקה דקה ומאחסנים בטמפרטורת החדר במיכל אטום עם ג'ל סיליקה כדי לא לכלול את הלחות.לסימולציית עיכול הקיבה, שקלו 100 מיליגרם של עלי הסלק האדומים המיובשים בהקפאה עדינים, ותדלקו אותו מחדש בשישה מיליליטר של PBS. השתמש שש חומצה הידרוכלורית molar כדי להתאים את ה-pH מדגם לשניים. הוסף ארבעה מיליגרם למיליליטר פפסין מרירית קיבה חזירית, וחומצה הידרוכלורית 10 מילימולרית, כדי לקבל ריכוז פפסין סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.לנער את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות. לאחר מכן, השתמש נתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH מדגם לשמונה ולהשבית את הפפסין. מעבירים 750 מיליליטר של כל דגימה לצינורות מיקרוצנטריפוגה, ומעבירים את האליקוטים ב-20,000 פעמים G וב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאסוף כל על-טבעי בנפרד, ולתלות מחדש כל גלולה בנפח אחד על-טבעי של מאגר טעינה. ואז לנתח הן את supernatant ואת גלולה resuspended על ידי ניתוח כתם מערבי. לניתוח שלמות התא, הכינו שתי דגימות של 100 מיליגרם של עלי הסלק האדומים המיובשים בהקפאה, והתינו מחדש בשישה מיליליטר של PBS.השתמש שישה חומצה הידרוכלורית molar כדי להתאים את ה- pH של מדגם אחד לשניים. לנער את שתי הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות. ואז aliquot 750 microliters של כל מדגם לצינורות מיקרוצנטריפוגה.צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G וב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאסוף כל על-טבעי בנפרד, ולתלות מחדש כל גלולה בנפח אחד על-טבעי של מאגר טעינה. ואז לנתח הן את supernatant ואת גלולה resuspended על ידי ניתוח כתם מערבי.ראשית, לשקול 100 מיליגרם של עלי סלק אדומים מיובשים בהקפאה דק, ו resuspend אותו בשמונה מיליליטר של PBS סטרילי. וורטקס לדקה אחת. צלחת מיליליטר אחד של כל הומוגניט עלה מיובש בהקפאה באחת מחמשת המדיה LB סלקטיבי מוכן.דגירה הצלחות ב 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. לאחר מכן, לספור את מושבות האגרובקטריום גדל על כל צלחת, ולחשב את המטען החיידקי שיורית כמספר המושבה להרכיב יחידות למיליליטר של הומוגונט עלה מיובש בהקפאה. בעבודה זו, חיסון אוראלי מפותח ברקמת צמח אכיל.צמחי סלק ותרד אדומים הם agroinfiltrated באופן ידני עם השעיות של A.tumefaciens נושאת וקטורים ביטוי רקומביננטי EGFP, ואת ביטוי חלבון פלואורסצנטי הוא דמיינו על ידי ניתוח כתם מערבי וכמת תחת אור UV. מערכת הסלק האדומה מאופיינת בביטוי EGFP גבוה יותר, המגיע לכ-544 מיקרוגרם לגרם משקל עלים טריים בתשעה ימים לאחר ההדבקה, בעוד התרד הגיע לרמה מקסימלית של כ-113.4 מיקרוגרם לגרם משקל עלים טריים ב-11 ימים לאחר ההדבקה. מסיבה זו, הסלק האדום נבחר כמארח הביטויים עבור כל הניסויים הבאים.לאחר מכן, צמחים חודרים לוואקום עם השעיה של איי-טופקינס. לאחר מיצוי TSP של עלי agroinfiltration, הדגימות מנותחות על ידי כתם מערבי, ואת החלבון רקומביננטי הוא לכמת יחסית על ידי ניתוח צפיפות. לבסוף, הפרמטרים לפיתוח חיסון אוראלי פוטנציאלי מוערכים.כפי שניתן לראות כאן, חלבון היעד נראה יציב לאחר תהליך lyophilization. עיכול קיבה מדומה על ידי הוספת פפסין אנזים קיבה חזירי לחומר מיובש בהקפאה, או לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר, או יחס של 1 עד 20, ל- TSP. שני תנאי הטיפול במערכת העיכול גורמים להשפלה של החלבון הרקומביננטי.היעדר אות ספציפי בדגימות גלולה לאחר עיכול פפסין עולה כי לאחר ייבוש הקפאה, תאי הצמח איבדו את שלמותם, וזה הוביל השפלה חלבון היעד. ההליך צריך להיות מותאם בקפידה למינים הצמחים ביחס לחדירת ואקום ולחלבון רקומביננטי היעד ביחס לניתוח קורס זמן. הליך ההדגמה עשוי לשמש גם לייצור ביופארמה המיועדת ללידה דרך הפה, כמו חיסון ונוגדנים.

transient-expression-red-beet-biopharmaceutical-candidate-vaccine-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים היווצרות כבדה הניא איון בSTZ (streptozotocin)-מושרה עכברים סוכרתיים על ידי העברת גנים מNeurogenin3 (Ngn3) וBetacellulin (BTC) באמצעות וקטור עוזר תלוי adenoviral (HDAd) והיפוך של היפרגליקמיה. השיטה שלנו לוקחת את היתרונות של וקטורי adenoviral עוזר תלויים עימם היעיל ביותר בתמרת vivo וביטוי הגנים לאורך זמן.

כינון ניאו איילט בכבד של עכברים סוכרתיים על ידי העברת גני Helper תלוי adenoviral וקטור בתיווך

אנו מספקים שיטת שחזור כדי לגרום לסוכרת מסוג 1 (T1D) בעכברים בתוך שבועיים על ידי העברת המאמצת של CD4 איון אנטיגן ספציפי, העיקרי + T תאים.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

ייצור חלוף חלבון בצמחי Nicotiana מבוססים על חדירת אבק עם Agrobacteria ביצוע וקטורי השקה (מבוסס נגיף פסיפס טבק) הוא גישה מהירה וכלכלית להפקת אנטיגנים חיסון וחלבונים טיפוליים. אנחנו פישטנו את ההליך ושיפור בהצטברות יעד על ידי אופטימיזציה של תנאי גידול חיידקים, בחירת מין מארח, ושיתוף מציג מדכאי RNA השתקה.

אופטימיזציה וניצול<em&gt; Agrobacterium</emייצור חלבון חלוף&gt; בתיווך ב<em&gt; Nicotiana</em

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור אפנון הביטוי transgene באמצעות מתג יחיד ג'ין pEUI(+) על ידי טיפול tebufenozide.

Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

פרוטוקול כדי ליצור גנים שונה האדם מדומה מפוזרים תאים איון האדם התפזרו על ידי וירוס לנשיאת RNA קצר (מרין) מוצג. פרוטוקול זה מנצל את כלי האנזים והתרבות הזמינים, ניתן לבצע בקלות, והוא מייצר מדומה מבחינה גנטית מדומה המתאים ללימודים פונקציונליים ומורפולוגיים.

לנטינגינה ג'ין מתווכת השתקה האדם פסאודו איון מוכן לוחות מצורף נמוך

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הדור של תאים CD8 T ספציפיים אנטיגן, ואת התרחבות שלהם בתוך מבחנה, עם מטרה של מספר גבוה מניב של תאי T פונקציונלי לשימוש מבחנה ובvivo.

יעילות גבוהה הדור של העכבר העיקרי של אנטיגן בתאי T ציטוטוקסיים לבדיקות פונקציונליות במודל סוכרת אוטואימוניות

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזעיר פולשנית להשתלה והדמיה של תאי NIT-1 בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD) - עכברים משולבים בעלי כשל חיסוני חמור המאותגרים בטחול מטוהר מעכברי NOD סוכרתיים ספונטניים.

ניטור ביולומינסנטי של הישרדות השתל במודל העברה מאומץ של סוכרת אוטואימונית בעכברים

פרוטוקול זה מתאר הליך מפורט ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים (CAR) באמצעות mRNA לא משולב לאימונותרפיה לסרטן ומספק שיטות אמינות להערכת תאי CAR-T ותפקודם ציטוטוקסי.

גישה לא ויראלית ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים חולפים באמצעות mRNA לאימונותרפיה לסרטן

למדו לייצר חיסון ביולוגי אוראלי נגד סוכרת מסוג 1 באמצעות שיטת ביטוי חלבונים בצמחים אכילים. הפרוטוקול מדגים ייצור אנטיגנים בכרובית אדומה לשימוש בהשראת סבילות אוראלית.

ארעי ביטוי סלק אדום של חיסון ביולוגיות המועמד לסוכרת מסוג 1

גלה סרטונים נוספים