באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה
31 ביולי 2019
פרוטוקול זה מתאר את מערכת התסיסה התרבותית של תרבות האצווה האנושית של מיקרוביוטה בצואה, באמצעות אינולין (באופן מוכר, ואחד מהמיקרוביוטה הנפוצים ביותר) כדי להדגים את השימוש במערכת זו בהערכת השפעות ספציפיות התערבויות על הרכב microbiota צואה ופעילויות מטבולית.
בהתחשב בתפקיד המתעוררים של מיקרוביום המעיים במחלות אנושיות שונות, מספר אפנן מיקרוביום המעיים כמו פרוביוטיקה, פרה-ביוטיקה, דיאטות ותרופות יכול לעזור בהשראת מחלות בריאות הקשורות למיקרוביום במעיים. עם זאת אין מערכת סינון מהירה ובמחיר סביר זמינים כדי לחזות את ההשפעות של אפנוני מיקרוביום המעיים כאלה, אבל מערכת זו היא פשוטה מספיק כדי לחזות כיצד התערבויות מסוימות יכולות להשפיע על מיקרוביום המעיים שבסופו של דבר יכול להשפיע על בריאות המארח. פרוטוקול זה הוא פשוט, סביר ומעשי עבור מעבדות לחקור את אפנוני המיקרוביום במעיים ואת ההשפעות שלהם על microbiota ובריאות המארח.
תחזוקה של תנאים אספטיים ואנאירוביים חיונית לניסוי זה. כמו כן יש להשתמש בדגימה הצואה מחדש, מיד עם איסוף. אחרת אם הניסוי מתוכנן מאוחר יותר, המדגם צריך להיות מאוחסן במינוס 80 מיד עם איסוף, ללא כל חשיפה לטמפרטורת הסביבה ואוויר.
טיפול בדיוק במהלך הכנת aliquot וצנרת חשוב גם לשמירה על דיוק ושחזור. זה ייקח פחות מ -12 שעות בשעות היום. אנחנו יכולים לבנות תרבות בן לילה אם הם צריכים את הדגימות ב24 שעות.
לאחר מכן, ואחריו חומצות שומן קצרות שרשרת ונחישות המיקרוביום. את התהליך הזה יפגינו שני תלמידי יוני גדולים, שוקו אחמדי ורבינה מינלי מהמעבדה שלי. להכנת מדיית תסיסה מתחת למכסה המנוע של אדים, בבקבוק ריאגנט על תערובת מגנט, יש לערבב פתרון A, פתרון B, פתרון מינרלי קורט, תותב ויטמין מסיס במים, תותב ביוטין חומצה פולית, פתרון ריבופלבין, פתרון המין, תערובת חומצות שומן קצרות שרשרת ורסזורין.
לאחר מכן מוסיפים לתוך תמצית שמרים בקבוק, נתרן קרבונט, ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט, טריפטיקאז. הוסף 296.1 מיליליטר של מים מזוקקים, להתאים את ה- pH עם הידרוכלוריד נורמלי אחד או נתרן הידרוקסיד כדי להבטיח שזה סביב 7.0. העבר את המיקרו-מטר לתחנת עבודה אספטית, ולהשתמש במסנן ואקום עם גודל נקבובית ב- 0.22 מיקרומטר כדי לסנן את המדיה לחיטוי.
כדי להכין פתרון דילול אנאירובי ליטר אחד, להמיס חמישה גרם של נתרן כלורי, שני גרם של גלוקוז, ו 0.3 גרם של ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראקט במים מיוינים. יש לאחסן אותו בתוך התא האנארובי ב-121.1 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לפני תחילת ניסוי התסיסה, שמרו את כל החומרים, הפתרונות והכלים הדרושים לניסוי התסיסה בתוך התא האנארובי למשך 48 שעות לפחות, כדי להבטיח שכל שאריות החמצן יוסרו.
לפחות 24 שעות לפני ניסוי התסיסה, שוקלים 300 מיליגרם אינולין, ומעבירים אותו לצינור 50 מיליליטר, אשר ממוקם לאחר מכן בתוך התא האנירובי. הוסף 26 מיליליטר של מדיה תסיסה מעורקת לתוך הצינור, ומערבולת לערבב. אפשר הידרציה של סיבים במשך כ 24 שעות.
ביום של ניסוי התסיסה, להכין inoculum צואה. ראשית, לשקול חמישה גרם של מדגם צואה טרי בצינור חרוט 50 מיליליטר. הוסף פתרון דילול אנאירובי לצינור כדי להגיע לנפח סופי של 50 מיליליטר.
מערבולת במשך 15 דקות, או עד הומוגני לחלוטין. שמור את הצינורות מחוסנים ב 37 מעלות צלזיוס בתוך התא אנאירובי, ולהפוך בעדינות פעם בשעה כדי לעכל מחדש את הסיבים ואת inoculum. לאחר שלוש, שש, תשע או 24 שעות, להוציא את הכמות הנכונה של מדיה מותססת, צנטריפוגה הדגימות ב 14, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מיד להקפיא את supernatant ו גלולה בחנקן נוזלי, ולאחר מכן לאחר הקפאת הצמד, לאחסן את supernatant לניתוח חומצות שומן קצר שרשרת, ו גלולה לניתוח מיקרוביום, במינוס 80 מעלות צלזיוס. פרוטוקול זה משמש להדגמת ההשפעה של פרה-ביוטיקה ספציפית. הצואה של נבדקים אנושיים בריאים, לאחר טיפול עם אינולין, הראה pH יציב יחסית במשך תשע שעות, בעוד ירד באופן דרמטי לאחר 24 שעות.
החיסון של אינולין הגדיל באופן משמעותי את רמות חומצות השומן קצרות השרשרת לקטט בדגימה צואה שטופלו אינולין מושווה לתרבות microbiota צואה לא מטופלים. ניתוח קואורדינטות ראשי מראה הרכב מיקרוביוטה שונה לאמצעי UniFrac משוקלל ולא משקל של גיוון בטא בין אינולין מטופל דגימות מטופלות. מדדים של גיוון אלפא לעומת מגוון פילוגנטי באמצעות עץ שלם PD, עושר מינים, יחידות אירונומיות תפעוליות, שווה מינים, כמו גם שפע יחסי של פילה וג'נה מרכזיים, כולם מציגים חתימות microbiota מעיים שונים בין אינולין מטופל דגימות מטופלות.
cladogram אטיונומית, נגזר ניתוח גודל אפקט מפלה ליניארי של רצפי 16S, מייצג את המסה בשפע דיפרנציאלי בין קבוצות שונות של דגימות. בצע את כל השלבים בזהירות. הדבר החשוב ביותר הוא לשמור על תנאים אספטיים ואנאירוביים קפדניים.
העל-טבעי ומהניסוי יכול לשמש לטיפול בשינויים ברמת חומצות השומן בשרשרת קצרה כתוצאה מהתסיסה המבוססת על סיבים. בנוסף, גלולה יכול לשמש לניתוח השינויים בהרכב המיקרוביום במעיים. כמה כימיקלים המשמשים להכנת תקשורת התרבות עלולים להיות מסוכנים.
נא את גיליון MSDS ולנקוט אמצעי זהירות בהתאם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מערכת תסיסה של תרבית-אצווה (batch-culture) במעבדה (in vitro) של מיקרוביוטה צואית אנושית, המשתמשת באינולין כדי להעריך את ההשפעות של התערבויות ספציפיות על הרכב המיקרוביוטה הצואית ועל פעילויות מטבוליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר מיקרוביום
- בריאות המעי
- השפעות פרביוטיות
רקע
- מיקרוביום המעי ממלא תפקיד מכריע בבריאות האדם.
- מודולטורים כגון פרה-ביוטיקה יכולים להשפיע על מיקרוביוטת המעי.
- מערכות סריקה נוכחיות להשפעות של מיקרוביום המעי הן מוגבלות.
- פרוטוקול זה מציע פתרון מעשי עבור מעבדות.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת סריקה פשוטה ובמחיר נגיש.
- חיזוי השפעתן של התערבויות על מיקרוביוטת המעי.
- העמקת ההבנה לגבי תפקידה של המיקרוביוטה בבריאות המארח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מערכת תסיסה של תרבית באצות (batch-culture) in vitro.
- שימוש בדגימות צואה טריות או אחסון תקין ב-80°C-.
- שמירה על תנאים אספטיים ואנאירוביים.
- הערכה של הרכב המיקרוביוטה ופעילויות מטבוליות.
תוצאות עיקריות
- המערכת חוזה ביעילות את ההשפעות של התערבויות ספציפיות.
- הוכחו שינויים בהרכב המיקרוביוטה העוצרי.
- הודגשו הפעילויות המטבוליות המושפעות מאינולין.
- סופקו תובנות לגבי ויסות מיקרוביום המעי.
מסקנות
- פרוטוקול זה מהווה כלי בעל ערך למחקר מיקרוביום.
- הוא מאפשר הערכה של התערבויות לבריאות המעי.
- תומך במחקרים נוספים על מיקרוביוטה ובריאות המארח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים של תרביות קבוצתיות (batch-culture) במעבדה (in vitro) בעלות תפוקה גבוהה עבור מיקרוביוטה של צואה אנושית מאפשרים סריקה מהירה וניתנת להרחבה של מודולטורים של המיקרוביום ללא הסתמכות על מחקרים בבעלי חיים או בבני אדם. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של התערבויות מועמדות, על ידי אספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור על הרכב המיקרוביוטה ותפוקים מטבוליים. שילוב של מודלים אלו בצינורות גילוי (discovery pipelines) מאיץ את הערכתם של פרביוטיקה, פרוביוטיקה ותרכובות תזונתיות עבור פורטפוליו לבריאות המעי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה פונקציונלית של מווספי מיקרוביום על קהילות מיקרוביאליות ממקור אנושי.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות שינויים במגוון המיקרוביוטה ובפעילות המטבולית.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת התערבויות מבטיחות להמשך פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת השפעות של התערבויות על הרכב המיקרוביוטה.
- מייצר פלטים כמותיים כגון pH, רמות לקטט וחומצות שומן קצרות שרשרת לצורך ניתוח השוואתי.
- תומך בסריקה ניתנת להרחבה של מספר תרכובות או משטרי טיפול במסלולי עבודה מקביליים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro לחתימות מיקרוביום הרלוונטיות למחלה לצורך רצף תרגומי.
- מאפשרת קידום של מועמדים מותאם סיכונים בהתבסס על מדדי קריאה מכניסטיים ומטבוליים.
- תומכת בגילוי סמנים ביולוגיים על ידי קישור שינויים המושרים על ידי התערבות לפלטים מדידים.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
מודל תרבית-אצווה (batch-culture) במערכת in vitro זו מתאים לממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification), ומספק נתונים ברי-יישום לפני מחקרים פרה-קליניים in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מודולציה של המיקרוביום והשפעות על מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך השוואת התערבויות.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח סטטיסטי של הרכב המיקרוביוטה ושינויים מטבוליים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים in vitro לוולידציה פרה-קלינית כאשר הדבר נתמך על ידי פלטים של מטבוליזם וגיוון.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכה שוטפת של מועמדים מגוונים המכוונים למיקרוביום.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי המכוון למיקרוביום.
- ערך תפעולי: מתקנן את זרימות העבודה ומשפר את השחזוריות לאורך קמפיינים של סריקה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת הקצאת ההון על ידי אספקת נתונים מוקדמים וניתנים ליישום.
- השפעה על תיק הפעילות: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מווילימיקרוביום להמשך קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוביולוגיה אנאירובית ובטכניקה אספטית.
- דורש גישה לתאי אנאירוביים ולפלטפורמות אנליטיות לאפיון מטבוליטים ומיקרוביום.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדית בין צוותים לטיפול בדגימות ולניתוח נתונים.
- ייתכן הצורך בהתאמה עבור מקורות תורמים שונים או סוגי התערבות שונים.
- סכנות פוטנציאליות מריאגנטים כימיים מחייבות הקפדה על פרוטוקולי בטיחות.
