Name: הייצור של עמילואיד-β-הפרשה Alginate מיקרו חרוזי לשימוש ב דוגמנות מחלת אלצהיימר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למדו שיטת ייצור מיקרו-חרוזי אלגינט המכילים תאים לשחרור מבוקר של עמילואיד-β. הפרוטוקול משמש למחקר מחלת אלצהיימר ומאפשר בחינת מנגנוני מחלה ופיתוח טיפולים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות למר קייג'ן סובוד, ד ר ג'ונתן ווקטו, מר דומיניק גרודנסקי, מיס צ'ן ז'או, וד ר תיירי פיילוט לעזרתם במיטוב ייצור מיקרוחרוזים של אלגיאט, תרבות תא וזיהוי Aβ, ומדעי שימושי דיונים.

1. ההכנות
<ol><li>הכינו 100 mL של ~ 4% (w/v) פתרון מניות קילוף פלסטיצידיות.<ol>
<li>שוקל 4.4 g של קילוף פלסטיצידיות נתרן מלח ולהוסיף את אבקת יבש כדי 100 mL של מלוחים hepes-באגירה (hbs, 20 מ"מ hepes (0.477 g) עם 150 מ"מ (0.877 g) במים מיוחים המאפשרים משקה.</li>
		<li>השתמש במהירות מגנטית ב-~ 500 מהפכות לדקה (rpm) וחום עד 50 ° צ' כדי לאפשר מנשאי שתיה מלאה. הערה: האלגיאט עשוי להזדקק לשעתיים או שעתיים להתייבש לחלוטין. כדי לחסוך בזמן, פתרון קילוף פלסטיצידיות יכול להיות מורכב יום לפני פרוטוקול אנקפסולציה ומאוחסן ב 4 ° c עד למחרת. כאשר קילוף פלסטיצידיות כבר מקורר, חום בעדינות כדי 37 ° c באמצעות אמבט מים או צלחת חמה מתפרעים עם משטירר מגנטי מיד לפני השימוש.</li>
		<li>מסנן סטרילי הפתרון קילוף פלסטיצידיות באמצעות 0.22 יקרומטר נקבובית polyethersulfone (PES) מסנן לפני השימוש. הסינון מומלץ ב-37 ° c כדי לאפשר זרימה קלה של אלגיאט. צמיגות יגדל אם הטמפרטורה מותר לרדת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו 1,000 מ ל של 0.5 M CaCl2.<ol>
<li>שוקל 55.49 g של הידרומטר CaCl2 ומתמוסס ב 1,000 ML של hbs (20 מ"מ hepes ו 150 מ"מ נרוג בשנת 1,000 mL של מים מוהים).</li>
		<li>מסנן סטרילי באמצעות מסנן PES 0.22 יקרומטר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו 100 מ ל של ערבוב התפרקות.<ol>
<li>הכינו 100 mM HEPES (23.83 g) ו 500 mM trisodium צידימיים (147.05 g) הפתרון בתמיסת מלח פוספט באגירה.</li>
		<li>התאם ל-pH 7.4 באמצעות NaOH או HCl.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הגדרת מערכת האנקפסולציה
<ol><li>נקה את המכסה של הזרם הלבינארי.<ol>
<li>לחטא את כיסוי הזרימה למינארי המכיל את encapsulator באמצעות חשיפה UV ואחריו ריסוס עם 70% v/v פתרון אתנול.</li>
		<li>ריקון מערכת encapsulator עם 10 mL של 70% v/v פתרון אתנול ואחריו 10 מ ל של מים מעוקרים סטרילי.</li>
		<li>חבר את הזרבובית 300 יקרומטר וחזור על 2.1.2 שלב.</li>
		<li>רסס את הבקבוק המכיל את הפתרון קילוף פלסטיצידיות מסוננים, את הבקבוק המכיל את הפתרון סידן כלוריד מסוננים וכל כלים, ציוד ולוחות התרבות הריקה שישמשו עם 70% v/v מענה האתנול ולמקם אותם לתוך כיסוי הזרימה לבינארי. לפני השימוש, להפעיל אור UV שוב עבור 30 דקות כדי לחטא ביסודיות.</li>
		<li>הכינו מיכל פסולת מלא בתמיסת חיטוי ביולוגית ומניחים את הגביע במכסה המנוע.</li>
		<li>ממלאים גביע עם 100 mL של הפתרון CaCl סטרילי2 (מימית) ולהוסיף מערבב מגנטי. הגדר את מהירות הערבוב ל 100 סל ד. מניחים את הגביע על מצע מגנטי בגובה של 18 ס מ מקצה הזרבובית. גביע זה ישמש כדי לאסוף חרוזים קילוף פלסטיצידיות ולאפשר את הגלגנציה שלהם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן תאים לאנקפסולציה.<ol>
<li>הסרת תאים מהאינקובטור וניתוק מהבקבוקון הקרוב-confluent באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA פתרון ו-דגירה ב 37 ° צ' עבור 5-10 דקות.</li>
		<li>בודד מדגם להערכת צפיפות התא ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 1,000 rpm עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה תא.</li>
		<li>השהה מחדש את הגלולה ב HBS (20 מ"מ HEPES ו 150 מ"מ היאl) כדי להכפיל את הריכוז הסופי הרצוי התא (למשל, עבור ריכוז סופי של 1.5 x 106 תאים/mL, להשעות את התאים ב hbs כדי להשיג ריכוז של 3 x 106 תאים/mL).</li>
		<li>ב שפופרת צנטריפוגה 50 mL, לערבב את ההשעיה התא ביחס 1:1 עם ~ 4% (w/v) קילוף פלסטיצידיות פתרון להשיג השעיה הסופי המכילה את הריכוז הרצוי התא (למשל, 1.5 x 106 תאים/mL) ב ~ 2% (w/v) קילוף פלסטיצידיות פתרון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הגדר את פרמטרי האנקפסולציה.<ol>
<li>להגדיר את המהירות של מכונת encapsulator למהירות ההבלטה המקסימלית (8.9 mL/min), את מתח 1.0 kV ואת תדירות 5,500 Hz. הערה: פרמטרים אלה היו ממוטבים בעבר כדי לקבל מיקרוחרוזים של 550 יקרומטר קוטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הייצור
<ol><li>. הרכיבו את המיקרוחרוזי<ol>
<li>ב 20 מ ל מזרק, טען 5 מ ל של התא-alginate השעיה ולצרף מזרק לencapsulator.</li>
		<li>התחל את הencapsulator על ידי הפעלת הזרם אשר ידחוף את התא-alginate ההשעיה דרך המזין. זרם של טיפות יהיה הבלטת דרך הזרבובית.</li>
		<li>לאסוף את 1 mL הראשון בגביע הפסולת כדי לבטל את הזרם הראשוני שאינו אחיד.</li>
		<li>המשך להפעיל את הנותרים 4 mL המאפשר טיפות ליפול לתוך האמבטיה2L 2 gelation. ניתן להפעיל כל מיליליטר בנפרד (אך ברציפות) ולאסוף בארבעה אמבטיות שונות במידת הצורך. הערה: בעת המגע עם אמבטיית הגלוציה, האלגיאט בטיפות החוצה באופן מיידי עם יוני הסידן באמבט הגגנציה ויוצרים מיקרוחרוזים כדוריים.</li>
		<li>לאחר דקה אחת, הסירו את גביע הגלציה מהפלטפורמה המגנטית והניחו למיקרוחרוזים לשבת במשך 4 דקות נוספות ללא עצבנות (זמן הכרחי כדי לאפשר השלמה מלאה על פני המיקרוחרוזים בטמפרטורת החדר).</li>
	</ol>
</li>
	<li>. להחזיר מיקרוחרוזי מיקרו<ol>
<li>הסר את כל הפסולת או חפצי האמנות הגדולים באמצעות זוג מלקחיים סטריליים, ולאחר מכן השתמש בפיפטה פלסטיק סטרילי כדי להעביר למסנן רשת שינוי מ74 יקרומטר כדי לאחזר את המיקרוחרוזים מאמבט הגלוציה.</li>
		<li>להעביר את המיקרוחרוזי לתוך צינורית צנטריפוגה באמצעות בינוני התרבות המתאים ולאפשר להדיה עבור 5 דקות במדיום תרבות התא.</li>
		<li>העברה לבקבוקון, צלחת או צלחת פטרי לדגירה וניסויים נוספים. הערה: אין לעשות שימוש חוזר באמבט גלציה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. בדיקות ושימוש בחרוזי מיקרו
<ol><li>מבחן איכות מיקרוחרוז.<ol>
<li>כדי להעריך את הכדאיות התאית (או קריאות ביולוגיות אחרות) לאחר כימוס ותרבות, בעדינות לשבש את המיקרוחרוזים כדי לשחרר את התאים שעברו אנקפסולציה באמצעות ערבוב התפרקות. הערה: הנפח הנדרש של ערבוב התפרקות תלוי במספר המיקרוחרוזים המשמשים לבדיקה. המנה המוצעת היא 4 מ ל של ערבוב התפרקות לכל 1 מ ל של תאים שעברו אנקפסולציה. צעד זה רק צריך להתבצע על מדגם אחד לפני כל אוכלוסיית מיקרוחרוז.</li>
		<li>דגירה התאים בחממה תרבות התא שיושלם עם 5% CO2 ב 37 ° c עבור 10 דקות.</li>
		<li>הערכת הכדאיות של התא עבור תאים כעת בפתרון כרגיל על-ידי צביעת תאים באמצעות טרי, כחול ובאמצעות תא הומוציטוטומטר. הערה: אם נעשה שימוש במוני תאים אוטומטיים לצורך הערכות של הכדאיות בתאים, יש לנקוט טיפול כדי להימנע מיצירת חפצי אמנות המפריעים לספירות. במקרים אלו, ספירת. תאים של נאואל מומלץ</li>
		<li>להערכת יציבות מיקרוחרוז, למדוד את הקוטר הממוצע עבור מדגם מכל אוכלוסיית מיקרוחרוז במהלך הזמן באמצעות מיקרוסקופ ותוכנת דימות. וריאציות דרמטיות העוקבות בקוטר יכול להיות מעיד על השפלה מאלגיאט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש במיקרוחרוזים לאיתור הAβ המופרש.<ol>
<li>לדוגמה מדיית תרבות התא מתאים 7PA2 המתורבת בתנאים סטנדרטיים (2D) במרווחי זמן של 24 שעות ומאחסנים ב-20 ° c לצורך ניתוח נוסף.</li>
		<li>דגימת מדיה של תרבות התא מתאים מסוג 7PA2 המתורבתים בתנאים סטנדרטיים (3D) במרווחי זמן של 24 שעות ומאחסנים ב-20 ° c לצורך ניתוח נוסף.</li>
		<li>זיהוי הפרשת הAβ מתאי 7PA2 לתוך מדיה ממוזגת שנאספה על-ידי שיטת חיסוני מקושרת באמצעות אנזים (אליסה) (איור 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש במיקרוחרוזים למחקר נוסף ביישומים רלוונטיים. הערה: ניתן להשתמש בתאים מסוג 7PA2 באנקפסולציה כדי להעריך את ההשפעות של הפרשה Aβ מתמשכת בדגם כלשהו או במודל.<ol>
<li>עבור מיקרוחרוז מיקרו בתוך ההיפוקמפוס עכברוש במוח, ליצור 1 מ"מ סעיפים ילתית עבה של המוח עכברוש ולהשתמש בכלים כירורגי כדי להוסיף מיקרוחרוזי לתוך האזור הרצוי (איור 5).</li>
		<li>מכמס סוגי תאים שונים במיקרוחרוזי מיקרו לאחר הפרוטוקולים המתוארים להערכת השחרור המתמשכת של biomolecules הריבית. רלוונטי מבחנה ובמערכות vivo ניתן להוסיף במודל.</li>
		<li>לזהות את הביטוי של סמנים מאוגדים ממברנה של תאים שעברו אנקפסולציה באמצעות זרימה cy, ו/או אימונוoforסנס. הערה: דוגמה של השימוש בשיטה דומה לייצור של מידול מיקרוחרוזים בשלבים המוקדמים של צמיחה המסה הגידול ביטוי ביטויים מתואר על ידי ריוס 20.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hardy, J. A., Higgins, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis.</a> Science. 256, 184-185 (1992).</li>
<li>Karthick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-dependent+effect+of+oligomeric+amyloid-%CE%B2+%281-42%29-induced+hippocampal+neurodegeneration+in+rat+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Time-dependent effect of oligomeric amyloid-β (1-42)-induced hippocampal neurodegeneration in rat model of Alzheimer's disease.</a> Neurological Research. 41 (2), 139-150 (2018).</li>
<li>Watremez, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+Low-n+Amyloid-%CE%B2+Oligomers+Induce+Robust+Novel+Object+Recognition+Deficits+Associated+with+Inflammatory%2C+Synaptic%2C+and+GABAergic+Dysfunction+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Stabilized Low-n Amyloid-β Oligomers Induce Robust Novel Object Recognition Deficits Associated with Inflammatory, Synaptic, and GABAergic Dysfunction in the Rat.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 62 (1), 213-226 (2018).</li>
<li>Brouillette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxicity+and+memory+deficits+induced+by+soluble+low-molecular-weight+amyloid-%CE%B21-42+oligomers+are+revealed+in+vivo+by+using+a+novel+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-β1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model.</a> Journal of Neurosciences. 32 (23), 7852-7861 (2012).</li>
<li>Solana, C., Tarazona, R., Solana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosenescence+of+Natural+Killer+Cells%2C+Inflammation%2C+and+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Immunosenescence of Natural Killer Cells, Inflammation, and Alzheimer's Disease.</a> International Journal of Alzheimer's Disease. , 3128758(2018).</li>
<li>Sturchler-Pierrat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+amyloid+precursor+protein+transgenic+mouse+models+with+Alzheimer+disease-like+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (24), 13287-13292 (1997).</li>
<li>Tomiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+amyloid+beta+oligomers%3A+their+contribution+to+synaptic+alteration%2C+abnormal+tau+phosphorylation%2C+glial+activation%2C+and+neuronal+loss+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A mouse model of amyloid beta oligomers: their contribution to synaptic alteration, abnormal tau phosphorylation, glial activation, and neuronal loss in vivo.</a> Journal of Neurosciences. 30 (14), 4845-4856 (2010).</li>
<li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+App+knock-in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neurosciences. 17 (5), 661-663 (2014).</li>
<li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple-Transgenic+Model+of+Alzheimer%27s+Disease+with+Plaques+and+Tangles%3A+Intracellular+A+and+Synaptic+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Triple-Transgenic Model of Alzheimer's Disease with Plaques and Tangles: Intracellular A and Synaptic Dysfunction.</a> Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).</li>
<li>Leon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Transgenic+Rat+Model+with+a+Full+Alzheimer%27s-Like+Amyloid+Pathology+Displays+Pre-Plaque+Intracellular+Amyloid-%CE%B2-Associated+Cognitive+Impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">A Novel Transgenic Rat Model with a Full Alzheimer's-Like Amyloid Pathology Displays Pre-Plaque Intracellular Amyloid-β-Associated Cognitive Impairment.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 20 (1), 113-126 (2010).</li>
<li>Prince, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dementia+UK%3A+Second+Edition+-+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Society%22%5BJournal%5D)">Dementia UK: Second Edition - Overview.</a> Alzheimer's Society. , 61(2007).</li>
<li>Cavanaugh, S. E., Pippin, J. J., Barnard, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+Alzheimer+disease%3A+historical+pitfalls+and+a+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+animal+experimentation%22%5BJournal%5D)">Animal models of Alzheimer disease: historical pitfalls and a path forward.</a> Alternatives to animal experimentation. 31 (3), 279-302 (2014).</li>
<li>Oakley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraneuronal+%CE%B2-Amyloid+Aggregates%2C+Neurodegeneration%2C+and+Neuron+Loss+in+Transgenic+Mice+with+Five+Familial+Alzheimer%27s+Disease+Mutations%3A+Potential+Factors+in+Amyloid+Plaque+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intraneuronal β-Amyloid Aggregates, Neurodegeneration, and Neuron Loss in Transgenic Mice with Five Familial Alzheimer's Disease Mutations: Potential Factors in Amyloid Plaque Formation.</a> The Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).</li>
<li>Forny-Germano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+Disease-Like+Pathology+Induced+by+Amyloid-%CE%B2+Oligomers+in+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's Disease-Like Pathology Induced by Amyloid-β Oligomers in Nonhuman Primates.</a> Journal of Neuroscience. 34 (41), 13629-13643 (2014).</li>
<li>Masliah, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+expression+of+synaptic+proteins+occurs+early+during+progression+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Altered expression of synaptic proteins occurs early during progression of Alzheimer's disease.</a> Neurology. 56 (1), 127-129 (2001).</li>
<li>Lepelletier, F. X., Mann, D. M. A., Robinson, A. C., Pinteaux, E., Boutin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+in+extracellular+matrix+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Early changes in extracellular matrix in Alzheimer's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (2), 167-182 (2017).</li>
<li>Calafiore, R., Basta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+microencapsulated+islets%3A+Actual+prospectives+on+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical application of microencapsulated islets: Actual prospectives on progress and challenges.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 67-68, 84-92 (2014).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li>
<li>Tran, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogel+protects+encapsulated+hepatic+HuH-7+cells+against+hepatitis+C+virus+and+other+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogel protects encapsulated hepatic HuH-7 cells against hepatitis C virus and other viral infections.</a> PLoS One. 9 (10), 109969(2014).</li>
<li>Rios de la Rosa, J. M., Wubetu, J., Tirelli, N., Tirella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+tumor+3D+in+vitro+models%3A+advantages+of+biofabrication+for+the+recapitulation+of+early+stages+of+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Physics+%26+Engineering+Express%22%5BJournal%5D)">Colorectal tumor 3D in vitro models: advantages of biofabrication for the recapitulation of early stages of tumour development.</a> Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (4), 045010(2018).</li>
<li>Tirella, A., Orsini, A., Vozzi, G., Ahluwalia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+diagram+for+microfabrication+of+geometrically+controlled+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">A phase diagram for microfabrication of geometrically controlled hydrogel scaffolds.</a> Biofabrication. 1 (4), 045002(2009).</li>
<li>Smalley, K. S. M., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+ins%27t+flat%3A+Taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Life ins't flat: Taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 42 (8-9), 242-247 (2006).</li>
<li>Podlisny, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+secreted+amyloid+beta-protein+into+sodium+dodecyl+sulfate-stable+oligomers+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture.</a> Journal of Biological Chemistry. 270 (16), 9564-9570 (1995).</li>
<li>Portelius, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+amyloid-%CE%B2+species+in+the+7PA2+cell+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of amyloid-β species in the 7PA2 cell model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 33 (1), 85-93 (2013).</li>
<li>Welzel, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+amyloid+%CE%B2-proteins+in+a+cell+culture+model+include+N-terminally+extended+peptides+that+impair+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Secreted amyloid β-proteins in a cell culture model include N-terminally extended peptides that impair synaptic plasticity.</a> Biochemistry. 53 (24), 3908-3921 (2014).</li>
<li>O'Hare, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+bioavailable+small+molecule+drug+protects+memory+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Orally bioavailable small molecule drug protects memory in Alzheimer's disease models.</a> Neurobiology of Aging. 34 (4), 1116-1125 (2013).</li>
<li>Nedović, V., Willaert, R. Fundamentals of Cell Immobilisation Biotechnology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNedovi%C4%87%2C+V+%22Methods+and+Technologies+for+Cell+Immobilisation%2FEncapsulation%22">Methods and Technologies for Cell Immobilisation/Encapsulation</a>. , Focus on Biotechnology book series, Springer Link (FOBI, volume 8A) 185-204 (2004).</li>
<li>Omer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Normoglycemia+in+Rats+Receiving+Transplants+with+Encapsulated+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term Normoglycemia in Rats Receiving Transplants with Encapsulated Islets.</a> Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השיטה המותווה במאמר זה שימושית לencapsulating תאים העושים התפלגות בגודל צר של מיקרוחרוזי מיקרו27. הוא גם מעניק את היתרון של התאים הגדלים בסביבה חיסונית מבודדת17,19, הגנה עליהם מפני מתח חיצוני. בנוסף, כימוס של תאים בתוך קילוף פלסטיצידיות מחקה באופן מקרוב יותר מצבים פיזיולוגיים, במיוחד לגבי אינטראקציות תא לתאים ונוקשות מטריקס20. גורמים אלה הם קריטיים במיוחד לשימוש הבאים ביישומים רלוונטיים, כגון בvivo, מנעה את תגובות החיסון הפוטנציאלי ברקמות המקיפות17. יתרה מזאת, יתרון גדול של פרוטוקול זה הוא הtuneability הקלה בהתאם ליישום הריבית: ניתן לשנות את הפרוטוקול ולמטב את הפרמטרים לייצור של חרוזים גדולים יותר או קטנים יותר, ומחרוזות רכות יותר או יותר. השיטה המתוארת משמשת ליצירת חרוזים קטנים מספיק כדי להיות מוזרק עם שיטות פולשניות מינימלית, ומספיק גדול כדי לארח מספר תאים ולספק שחרור מספיק של Aβ כדי לגרום להשפעות התנהגותיות ופתולוגיים בעת הזרקה בדגמי בעלי חיים.
הצלחת פרוטוקול זה תלויה במספר שלבים קריטיים. הטיפול בתאים זהירים וטכניקות תאים מיטביים של תא הינן חשובות לשמירה על הכדאיות התאית והפונקציה20,28. שימוש בתנאי תרבות סטנדרטיים מבטיח שימור של פונקציה נורמלית של תאים 7PA2, כפי שנצפתה. זה מאפשר פרופיל שחרור דומה עבור Aβ1-42 מתאים כימופ בהשוואה לתרבויות דו-ממדיות. בנוסף, על הפרוטוקול לעבוד בצורה אופטימלית, פתרון בעל צמיגות נמוכה מבטיח תוצאות טובות יותר בהשוואה לפתרון בעל צמיגות גבוהה. הדבר מבטיח שסילון למינארי הומוגנית ינוכה דרך הזרבובית והפצת תאים אפילו בתוך המטריצה של החרוזים הבדויים27. חומרים המשמשים לכמס תאים חייב להיות מנגנון gelation מהיר מאוד, המאפשר שמירה של צורה.
צעד קריטי נוסף בפרוטוקול זה הוא טיפול של מיקרוחרוזים מפוברק אחרי הגלציה. כאן, אנו מראים את האיחזור של מיקרוחרוזים באמצעות מפתח פלסטיק גדול הצמצם להעביר את החרוזים. לחילופין, שפיכת פתרון סידן כלוריד המכיל את המיקרוחרוזים לתוך מסנן רשת שינוי ניתן להשתמש לאחזור חרוז. ניתן להשתמש בצנרת שלמה גדולה (5, 10 או 25 מ"ל) בכדי לשרטט את המיקרוחרוזים ולאחר מכן לשטוף את מסנן הרשת במקום לשפוך. היתרון של זה הוא ביטחון גבוה יותר עקרות ההליך בהשוואה לשפוך. עם זאת, מן המגבלות היא כי כמה חרוזים עלולים להיות מעוותים אם הם דחוסים על ידי הפיפטה, בנוסף לסיכון תשואה נמוכה יותר אם חלק גדול של חרוזי מיקרו לא חולצו.
גישה זו שימש לכמס קווי תאים שונים למודל וללמוד מחלות שונות (למשל, שחרור של אינסולין מתוך איון הלבלב כדורית). החידוש של הגישה שלנו הוא החרט של המיקרוחרוזים שנוצר באמצעות פרוטוקול זה כשיטה שימושית במידול היבטים חשובים של מחלת אלצהיימר ב vivo. כאשר משווים את פרופיל השחרור של Aβ מתאים באנקפסולציה (איור 4) לרמות של Aβ שנוצרו על ידי הזרקת בולוס (כגון זה דיווח במחקרים אחרים3,26), שחרור כרוני יותר ומתמשכת של Aβ יכול להיות צפוי. איור 6 ממחיש את הנטייה החזויה שניתן להשיג. באמצעות מערכת זו עבור מידול vivo רלוונטי יותר לאופן ההתקדמות המחלה יכול להיות שימושי יותר בגילוי ופיתוח של סמים.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig6.jpg"> איור 6 : פרופיל שחרור חזוי של Aβ1-42 מ-7pa2 כימוע תאים לעומת הזרקת בולוס. הפרופיל של Aβ שחרור מתוך מיקרומפיצים 7PA2 המכיל מיקרו חרוזים מאפשר בדיקות של ההשפעות של Aβ כרונית ומתמשכת במודל חיה של רלוונטיות ל-AD. לעומת זאת, הזרקת בולוס תיצור יתד ברמות Aβ לאורך זמן קצר, ואחריו הרשאה מהירה של Aβ מהמוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

דוגמנות מחלות ניווניות הוא מאתגר בשל האופי המורכב והמורכב של המוח. במחלת האלצהיימר (AD), הפסד פרוגרסיבי של תפקוד סינפטית ומוות של הנוירונים הוא האמין להיות אפקט הזרם של הפקת יתר מתמשכת והצטברות של ביתא עמילואיד (Aβ) פפטידים לאחר עיבוד נורמלי של הקודמן של עמילואיד חלבון (APP) לפי השערת העמילואיד1.
כדי להבין את המנגנונים של הפתולוגיה הנגרמת זה עמילואיד ולסייע בזיהוי מטרות הטיפול הרומן, מדענים פיתחו שונים במודלים vivo פרה. קטגוריה אחת של דגמים משתמשת הזרקת בולוס של Aβ פפטיד סינתטי לתוך המוח חולדה2,3,4. המגבלה העיקרית של מודלים כאלה היא שהם סומכים על הנקודה היחידה או חוזר על טיפולים עם פפטידים Aβ בריכוזים גבוהים הופקד על כל אחד ללכת. זה לא מתיישב עם האופי הכרוני, המתמשכת של שחרורו של Aβ במחלה5. קטגוריה נוספת של vivo מודלים היא טרנסגניים מודלים בעלי חיים המבטא אחד או יותר מוטציות גנטיות הקשורות הווריאציות המשפחתית של המחלה6,7,8,9, 10. עם זאת, מאז AD המשפחתית רק חשבונות עבור פחות מ 5% של כל המקרים של אלצהיימר11, הרלוונטיות של מודלים אלה בתרגום לספירה למעלה בבני אדם מוטלת בספק12. חיסרון נוסף של הגישה הטרנסגניים היא היווצרות Aβ מואצת מלידה, אשר מתרגמת לתוך התפקוד הקוגניטיבי שינויים פתולוגיים מהר מדי באגרסיביות כדי להידמות התקדמות המחלה בשנת לספירה בחולים12 . לדוגמה, המודל תחביב 5x מייצר לוחיות קטן כמו 1.5 חודשים13.
מעניין, שתי הקטגוריות הללו כתוצאה משינויים בתפקוד הקוגניטיבי של רלוונטיות למחקר המודעה2,3,4,5,6, ולפעמים הם מלווים על ידי ה הופעה של סימנים פתולוגיים של המחלה כגון שלטי עמילואיד6,8, טאו זירחון6,7 ו/או הפסד סינפטית ונוירואליות7,9, . ארבע עשרה אבל בעוד סוגים אלה של מודלים יכול לתת לנו תובנה על ההשפעות של רמות גבוהות של עמילואיד במוח, אשר משויכים לעתים קרובות עם שלבים מאוחרים יותר של AD, הם נכשלים לשקף את השינויים המוקדמים הציגו בתגובה לחשיפה כרונית ומתמשכת Aβ פפטיד12, כגון ביטוי שונה של סמנים סינפטית15 ורכיבים במטריצה המתכלים16. לכן, עדיין יש צורך ליצור מודל כרוני ממחיש יותר במדויק את ההשפעות של הפרשה Aβ מתמשכת על קוגניציה vivo וממחישה שינויים פתולוגיה.
למטרה זו, פיתחנו מערכת המאפשרת את הפרשה המתמדת והמתמשכת של Aβ באופן מבוקר על-ידי הפרשת עמילואיד בתאי הפרשה בתוך מיקרוחרוזי הידרוג'ל, אשר ניתן להשתיל לאחר מכן בתוך מוח החולדה המבוגר להיבטים מדגם של לספירה.
Alginate היה ביומטריה שנבחרו כפי שהוא ביולוגי תואם לא לגרום לתגובות שליליות כאשר מושתל ב vivo17. עטיפת התאים באלגיאט הידרוג כבר הוקמה במהלך ארבעת העשורים האחרונים. הדוגמא הראשונה של התרגום לקליניקה דווחה לטיפול בסוכרת מסוג 117. הדו ח המוקדם ביותר של מחזור מוצלח של איי לנגרהנס משנת 1980. השתלת מיקרוחרוזים המכילים אינסולין הפרשה תאים מהפכה אפשרויות טיפול עבור חולי סוכרת כפי שהיא שוחזרה תפקוד הלבלב, ביטול הצורך טיפול בהזרקה אינסולין18. עבודות אלה מדווחות על האופן שבו עטיפת התאים יכולה להגן עליהם מלחצים חיצוניים, בין אם מכני או כימי. למעשה, חרוזים קילוף פלסטיצידיות לפעול כמכשול ולבודד תאים מהסביבה המקיפה שמירה על פנוטיפים שלהם, תוך מתן גישה מספקת לתקשורת המקיפים עבור חומרים מזינים והרשאה של לוואי הסלולר19. יתר על כן, השימוש קילוף פלסטיצידיות מאפשר התאמה של תכונות מכניות של רקמה רכה20. קילוף פלסטיצידיות הידרוג יכול להיות מכוון יש נוקשות של 1-30 kPa, על ידי שינוי פשוט של ריכוז קילוף פלסטיצידיות וצפיפות מרובת קישור20,21. זהו היבט חיוני, לא רק כדי לשמור על הביטוי הפנואני של התאים המוכהים בתחום החוץ, אלא גם כדי למנוע כל השפעות דלקתיות לאחר העפיב vivo22.
בפרוטוקול זה, 7PA2 תאים-שורה סינית שחלה אוגר קו כי הוא מנוכר באופן מאוד עם יישום אנושי V717F מוטציה גן23 -משמשים. תאים אלה ברציפות לייצר מוצרים קטליטי של APP, כולל Aβ1-4224,25, והשתמשו כדי לייצר Aβ כחלופה לייצור סינתטי ב preclinical, חריפה במחקרים vivo26. אנו מתארים שיטת הייצור לשתק תאים 7pa2 בתוך "רך" קילוף פלסטיצידיות מיקרוחרוזי מיקרו, נועד לאפשר הפרשה מתמשכת של biomolecules. כהוכחה למושג, אנו מדווחים על שחרורו של Aβ1-42 פפטיד לאורך זמן. קילוף פלסטיצידיות כי משמש הוא בצמיגות נמוכה קילוף פלסטיצידיות עם משקל מולקולרי של 120000-190000 g/מול ו mannuronic ליחס guluronic של 1.56 (M/g).
במחקרים נוספים, מיקרוחרוזים אלה יכולים להיות מושתלים בבטחה באזורים של מוח החולדה של רלוונטיות למודעה (למשל, ההיפוקמפוס) כדי ללמוד את ההשפעות של הפרשה Aβ כרונית על התנהגות vivo ו פתולוגיה vivo. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של שחרור Aβ כרונית ב מבחנה ביישומים vivo לשעבר. למשל, 7pa2-מיקרוחרוזי קילוף פלסטיצידיות אלגיאט יכול להיות co-תרבותי בתוך מבחנה עם תרבויות נוירואליות או אסטרוציטוטיות כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה כרונית Aβ על מנגנונים סלולריים הקשורים AD. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון את הקשר בין ייצור Aβ כרונית והפוטנציאל לטווח ארוך של vivo electrophysiology לשעבר.
גולת הסימון של פרוטוקול זה היא מודולריות וגמישות של שיטת הייצור, אשר מאפשר ייצור של חרוזים קילוף פלסטיצידיות עם מימד היעד על ידי כוונון משובח פרמטרים הייצור. בהתאם ליישום, ניתן לכוונן את הפרוטוקול כדי לקבל מטרות העידו ביחס לגודל microbead, צפיפות של התאים שעברו אנקפסולציה, ונוקשות מיקרוחרוז. פרוטוקול זה יכול לשמש לעטיפת מגוון של סוגי תאים, פיתוח רלוונטי יותר תלת מימדי (3D) במודלים מבחנה כדי ללמוד פתווגיות שונות. אנו דיווחו לאחרונה על איך התאים alginate כדוריות יכול לשמש למודל בשלבים המוקדמים של התקדמות הסרטן20.
המושג של תהליך אנקפסולציה מבוסס על שחול של סילון למינארי של תאים הושעו בפתרון קילוף פלסטיצידיות דרך זרבובית. ראש רוטט משבש את הסילון עם תדר מבוקר וכתוצאה מכך טיפות בגודל alginate מבוסס במידה שווה. שדה חשמלי חיצוני מאפשר הפרדה של טיפות alginate מבוסס שנוצר, אשר במגע עם פתרון מועשר ביוני דינטי, כגון יוני סידן, יכול לחצות במהירות, לשמר את הצורה הכדורית שלהם. דגירה בתמיסה מאפשרת היווצרות של מיקרוחרוזים כדוריים המכילים תאים בתוך הידרוג'ל פיזי הומוגנית27. גודל היעד של מיקרוחרוזים ו קילוף פלסטיצידיות הידרוג מאפשר מזינים<s>s</s> והחלפת חמצן עם מדיה תרבות התא לפרקי זמן ארוכים (שבועות). איור 1 הצגת ייצוג סכמטי של מנגנון האנקפסולציה המשמש (איור 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig1.jpg"> איור 1 : מערכת עטיפת המחשב. (א) ייצוג סכמטי של מערכת האנקפסולציה. ההשעיה תא alginate הוא נטען לתוך מזרק (2) וניזון דרך מאגר במהירות ההבלטה להגדיר על משאבת מזרק (1). במאגר, כובע רטט (3) רוטט בתדר שנקבע על ידי גנרטור בצורת גל (4) כדי לשבש את הזרם במרווחי זמן שווים, ויוצרים טיפות בגודל שווה. כאשר הפתרון הוא ניזון דרך זרבובית (5) ו טיפות נוצרות, פוטנציאל אלקטרוסטטי מוחל על גבי אלקטרודה (7) שנקבע על ידי גנרטור מתח (6), אשר מטעני מעט את פני השטח של טיפות, ומאפשר לזרם להתפשט כתוצאה של מעבר כוחות אלקטרוסטטית. כמו טיפות לעסוק באמבט gelation (8), Ca2 +מונחה הקישור החוצה של תוצאות קילוף פלסטיצידיות היווצרות של מיקרוחרוזים כדוריים. (ב) צילום של הencapsulator לפני הייצור של מיקרו חרוזי אלגיאט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
גודל מיקרוחרוז ניתן לשנות בהתאם לשימוש המיועד. על מנת לשלוט בגודל המיקרוחרוז, הפרמטרים השונים המתוארים באיור 1א ובפרוטוקול מותאמים בהתאם. בקוטר הפנימי של הזרבובית שבשימוש יש השפעה ניכרת על גודל הטיפות; עוד התאמת פרמטרי אנקפסולציה, כלומר מהירות ההבלטה, תדר רטט ומתח, הוא המפתח להשגת התפלגות בגודל עקבי. טבלה 1 מתאר כיצד הפרמטרים השונים יכולים לשנות את גודל המיקרוחרוזים שהושגו עם מערכת זו.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">פרמטר</td>
			<td>גודל חרירים</td>
			<td>תדר רטט</td>
			<td>שיעור זרימה</td>
			<td>מתח אלקטרודה</td>
		</tr>
<tr>
<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
		</tr>
<tr>
<td>גודל חרוז</td>
			<td>
<img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg">
</td>
			<td><img alt="Image 2" src="/files/ftp_upload/59597/59597img02.jpg"></td>
			<td><img alt="Image 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597img01.jpg"></td>
			<td>–</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: הייצור פרמטרים השפעתם על גודל מיקרוחרוז. הטבלה ממחישה כיצד כל פרמטר יכול להשפיע על גודל התוצאה של מיקרוחרוזים מפוברק, ללא קשר לזרבובית ולצמיגות של הפתרון המשמש.

<table><tbody><tr><td>ומיקרו; מנהל תוכנה</td><td>Vale Lab, UCSF, ארה"ב</td><td>v.1.46</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um PES מסנן</td><td>Merck, בריטניה</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"מ Netwell הכנס 74 אום רשת מסנן</td><td>Constar, ארה"ב</td> <td>#3477</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אלגינית מלח נתרן מאצות חומות</td><td>Sigma-Aldrich, uk</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich, uk</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>תא טיטר96&nbsp; AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Assay</td><td>Promega, ארה"ב</td><td>G3580</td><td></td></tr><tr><td>Encapsulator</td><td>Inotech</td><td>IE-50</td><td>מס' סידורי 05.002.01-2005</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, uk</td><td>H4024</td><td></td></tr><tr><td>Hu A&beta; 1-42 ELISA</td><td>ThermoFisher, בריטניה</td><td>KHB3441</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>ImageJ</td><td>v1.49p</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Leica</td><td>Leica מיקרוסיסטמס, בריטניה</td><td>DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS מצלמה</td><td>אנדר, בריטניה</td><td>5.5</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>433209</td><td></td></tr><tr><td>טריספדיום ציטראט דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ', בריטניה</td><td>פתרון W302600-K</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, בריטניה</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

הייצור של עמילואיד-β-הפרשה alginate מיקרו חרוזי לשימוש ב דוגמנות מחלת אלצהיימר

Fabrication of Amyloid-&#946;-Secreting Alginate Microbeads for Use in Modelling Alzheimer's Disease

על פי השערת העמילואיד, הגורם המוקדם ביותר בהתפתחות של מחלת אלצהיימר (AD) היא הצטברות של הβ עמילואיד רעילים (Aβ) שברי, בסופו של דבר מוביל את התכונות הקלאסיות של המחלה: הפלאק עמילואיד, מסבך נוירופיבריליאן והפסד עצבי. העדר של מודלים רלוונטיים טרום הטרנסגניים שאינם משקפים התקדמות המחלה הוא אחד הגורמים העיקריים מהווה את התגלית של טיפולים יעילים תרופות. לצורך זה, פיתחנו פרוטוקול לייצור של מיקרוחרוזים קילוף פלסטיצידיות המכילים הפרשה עמילואיד שימושי למחקר של ההשפעות של ייצור Aβ כרונית.
שחלות האוגר הסיני התאים בעבר מנוכר עם גן האדם APP, הפרשה Aβ (כלומר, 7PA2 תאים), שימשו במחקר זה. תלת מימדי (3D) מודל מבחנה עבור שחרורו מתמשכת של Aβ היה מפוברק על ידי עטיפת התאים 7PA2 ב alginate. התהליך היה ממוטב למקד קוטר חרוז של 500-600 יקרומטר להמשך במחקרים vivo. אופטימיזציה של מעטיפת התאים 7pa2 ב קילוף פלסטיצידיות בוצע שינוי הפרמטרים הייצור, למשל, קילוף פלסטיצידיות ריכוז, שיעור זרימת ג'ל, פוטנציאל אלקטרוסטטי, תדר הראש תנודות, פתרון ג'לי. רמות של Aβ מופרש נותחו לאורך זמן ולעומת חרוזים קילוף פלסטיצידיות ושיטות התרבות תאים סטנדרטיים (עד 96 h).
ריכוז של 1.5 x 106 7pa2 תאים/mL וריכוז קילוף פלסטיצידיות של 2% (w/v) באגירה עם hepes ובעקבות הגגנציה ב 0.5 M סידן כלוריד עבור 5 דקות נמצאו להמציא מיקרוחרוזים יציבים ביותר. מיקרוחרוזים מפוברק היו 1) של גודל אחיד, 2) עם קוטר ממוצע של 550 μm, 3) המכיל על 100-150 תאים לכל גרגרי ו 4) מסוגל להפריש Aβ.
לסיכום, השיטה האופטימיזציה שלנו לייצור מיקרוחרוזים יציבים קילוף פלסטיצידיות המכילים עמילואיד הפקת תאים 7pa2 עשוי לאפשר מידול של היבטים חשובים של AD הן מבחנה ובvivo.

התאים 7PA2 הם בהצלחה באנקפסולציה של מיקרוחרוזי אלגיאט לאחר ההכנה, מיקרודיסים אחידים וכדוריים מופקים בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה. התמונות באיור 2להלן להציג דוגמה של איך שינוי אחד הפרמטרים (כלומר, מתח) משנה את הזרימה ואת הפיזור של זרם קילוף פלסטיצידיות טיפות. איור 2 ב מראה דוגמה של חרוזים קילוף פלסטיצידיות מיד לאחר תהליך gelation.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig2.jpg"> איור 2 : אופטימיזציה שיטת ייצור. (א) תצלומים המציגים שינויים בפיזור הזרימה. (ב) תמונת שדה בהיר המציגה קילוף פלסטיצידיות מיקרוחרוזים כדוריים מיד לאחר הייצור. (ג) דוגמה של צעד אופטימיזציה: כוונון פרמטרים שנבחרו הייצור כדי להשיג את גודל מיקרוחרוז היעד. גרפים נבחרים כדי להמחיש את הקשר בין כל פרמטר לבין גודל המיקרו-חרוזים (התפלגות גודל מתוך לפחות n = 100 מיקרוגרמות). שימו לב כי הקוטר הפנימי של הזרבובית, צמיגות של הפתרון ותנאי הגלינג עלולים להשפיע גם על הגודל של חרוזים מפוברק. קווי שגיאה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig2large.jpg" target="_blank">מייצגים את ש גויטיין נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
הפרוטוקול המתואר הוא גמיש ומאפשר ייצור של גדלים שונים של מיקרוחרוזים מבוססי alginate, משתנה בקומפוזיציה על פי האפליקציה. באיור 2C, אנו מדווחים על ההשפעה של קילוף פלסטיצידיות שיעור זרימה, מתח ותדר על גודל מיקרוחרוז באמצעות 2% (w/v) הפתרון קילוף פלסטיצידיות ב hepes (pH 7.2) הבלטת באמצעות זרבובית 300 יקרומטר.
ככל שהטווח של מחקר זה היה לייצר מיקרוחרוזים שניתן להטביע בתוך המוח עכברוש, התאמתי את הפרמטרים הייצור כדי להשיג קוטר מיקרוחרוז ממוצע בטווח של 500-600 μm. למטרות בקרת איכות, השיטה היתה ממוטבת לשינויים מינימליים ברחבי האוכלוסייה של חרוזים מפוברק (כלומר, התפלגות בגודל הצר). אנא שימו לב כי (1) המיוצר חרוזים ניתן להזריק במוח עכברוש באמצעות מזרק המילטון מצויד מחט 20G; ו-(2) האונה האחת של מוח החולדה יכול לארח עד שניים או שלושה חרוזים בגודל זה.
לאחר אופטימיזציה, encapsulating 7PA2 תאים בריכוז של 1.5 x 106 תאים/mL מושעה 2% (w/v) הפתרון מאגור עם hepes וירד באמבטיה 0.5 M כלוריד סידן כלורי הניב את המיקרוחרוזים הרצוי. איור 3 A להלן מציגה תאים 7PA2 כדורית מופץ באופן שווה ב מיקרוחרוזים לאחר יום אחד בתנאי תרבות תא סטנדרטי. הפצת תאים 7PA2 נבדקה באמצעות שיטת MTS לפי פרוטוקול היצרן. לא היה הבדל משמעותי בין ההתנהגות של התאים 7pa2 גדל עם או בלי קילוף פלסטיצידיות מעל תקופה של שבעה ימים (איור 3ב). בעת הדגירה של תאים כדורית בתנאי תרבות סטנדרטיים, תאים צפויים להמשיך להתרבות במשך הניסוי, ומדרגות קטנות של בריחה תא ניתן לצפות כתוצאה מכך, כפי שדווח בעבודות אחרות28. ההשפעות של זה ניתן לטפל על ידי encapsulating בצפיפות התא קטן יותר או לצמצם את הריכוז סרום שבו מיקרוחרוזים מודבטים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig3.jpg"> איור 3 : תאים 7PA2 באנקפסולציה. (א) תמונה בשדה בהיר של תאים 7pa2 כדורית מראה אפילו התפלגות התא לאורך מיקרוחרוז קילוף פלסטיצידיות. פרמטרים הייצור נקבעו כדי להשיג ~ 150 7PA2 תאים לכל חרוז. לא וריאציה משמעותית של חרוזים קילוף פלסטיצידיות נצפתה מעל 7 ימים של תרבות. (ב) לא היה הבדל נצפה בין התפשטות כוללת של 7pa2 תאים מודבטים עם קילוף פלסטיצידיות נגד תאים מודבטים ללא קילוף פלסטיצידיות. התאים 7pa2 לצמוח ולהגר על הנפח של חרוזים קילוף פלסטיצידיות; הפחתת ריכוז הסרום ניתן לראות כדי להאט את צמיחת התאים. קווי שגיאה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig3large.jpg" target="_blank">מייצגים את ש גויטיין נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מיקרו חרוזים encapsulating 7PA2 התאים הם יציבים לאורך זמן כדי לחקור את הגודל והצורה של מיקרו מיקרוחרוזי קילוף פלסטיצידיות, ניתוח מיקרוסקופ בוצע לאחר הייצור ואת הגלציה. הקוטר הממוצע עבור מיקרוחרוזים שהושגו באמצעות הפרוטוקול שנבחר הוא 550 ± 2 μm.
באופן תיאורטי, מספר התאים הצפויים ב-550 μm בקוטר מיקרוחרוז יכול להיות מחושב כדלקמן:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59597/59597eq1.jpg">
כאשר V = עוצמת הקול ו r = רדיוס. נפח של מיקרוחרוז יחיד הוא V = 8.8 x 10-5 מ ל; לכן, מספר התאים לכל מיקרוחרוז בזמן אנקפסולציה = (1.5 × 106) x (8.8 x 10-5) ≈ 130 תאים.
ניסויים, ספרנו את מספר התאים שעברו אנקפסולציה מיד לאחר הייצור. החרוזים של אלגינקה שובשו בעדינות באמצעות ערבוב התפרקות והתאים היו מוכתמים בתמיסה כחולה טריכרונית. שערוך הכדאיות וספירת תאים בוצע באמצעות הומוציטוטומטר; תוצאות שהתקבלו הראו ממוצע של 116 ± 17 תאים חיים לכל מיקרוחרוז (n = 5, הנתונים לא דווחו). כצפוי, הבדל מזערי בין ספירת תאים תיאורטית וניסויית מיד לאחר שנצפתה האנקפסולציה. עבור יישומים מסוימים, ובמיוחד כדי לקבוע את כמות Aβ שוחרר לאורך זמן, חשוב לנבא את מספר התאים שעברו אנקפסולציה של כל חרוז קילוף פלסטיצידיות.
מעניין, לתהליך האנקפסולציה אין השפעה משמעותית על הכדאיות בתאים. תוצאות מדווחים בעבודה קודמת, שבו תאים סרטניים המעי הגס (כלומר, hct-116) היו באמצעות שיטה דומה, ללא הבדלים בכדאיות התאים ב קילוף פלסטיצידיות מיקרוחרוזי בהשוואה 2d שולטת20.
כדי למדוד את היציבות של האלגיאט המשמש בתהליך האנקפסולציה, מדדנו קטרים של מיקרודיטרים לאורך תקופה של 14 ימים (n = 100). לא היו שינויים בקוטר הממוצע 14 ימים לאחר אנקפסולציה לעומת מיד לאחר אנקפסולציה (נתונים לא דווחו).
תאים 7PA2 באנקפסולציה לשחרר Aβ לאורך זמן מדיה ממוזג נותחו מ 2D ותרבויות 3D של 7PA2 תאים לחשוף עלייה מתמדת Aβ1-42 רמות. התקשורת התרבותית של התאים הייתה בשימוש בכל 24 שעות, ועד ארבעה ימים, ונותחו באמצעות אליסה. הנתונים שלנו מראים כי שיעור השחרור של Aβ1-42 מ מיקרוחרוזים (3d) דומה בפרופיל כי שוחרר מן התרבות הדו (איור 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig4.jpg"> איור 4 : קצב של Aβ1-42 הפרשה מ 7pa2 תאים. (A) Aβ release (% מנורמל לאחר 4 ימים) מ-2d ו-3d במודלים של מבחנה יש פרופיל דומה. שני הדגמים מראים עלייה מתמדת ברמות Aβ בתקופה של ארבעה ימים, וכצפוי, לא ניתן להגיע לריכוז קבוע. (ב) ריכוז של Aβ1-42 מנורמל מספר התא ההתחלתי, המציג הפרשה דומה של Aβ1-42 לאורך זמן, ללא קשר לשיטות culturing. לא הנוכחות של קילוף פלסטיצידיות ולא את התהליך של כימוס (3d במודל חוץ גופית) לשנות את הפרשה של Aβ1-42. קווי שגיאה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig4large.jpg" target="_blank">מייצגים את ש גויטיין נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
יישום פוטנציאלי של תאים 7PA2 כימוס אנו מדווחים כי תאים 7pa2 מכהים במיקרו מיקרוחרוזי קילוף פלסטיצידיות ניתן להשתמש ביעילות עבור שחרור מתמשך של Aβ1-42, ומכאן משמש כדי לבחון את ההשפעה של הפרשה Aβ כרונית בכל מודל קדם קליני. באיור 5 להלן, אנו מראים את היתרונות של השימוש קילוף פלסטיצידיות מיקרוחרוזים כי ניתן להזריק בקלות ממוקם בתוך המוח של חולדה. מקטעים vivo Ex הם כאן משמש למטרות המחשה, השוואת מילימטר קילוף פלסטיצידיות חרוז לעומת קילוף פלסטיצידיות מפוברק מיקרוחרוזים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59597/59597fig5.jpg"> איור 5 : שימוש במיקרוחרוזי מיקרו-קליני ליישומים רלוונטיים. מיקרוחרוזים עבור חרט במוח עכברוש חייב להיות קטן מספיק כדי להיות מוטבע מבלי ליצור הנגע גדול מדי כדי למנוע נזק למוח בתוך כימומה ולהשפיע לרעה על תפקוד המוח נורמלי. תמונה (A) מראה השוואת גודל בין חרוז בקנה מידה מילימטר וחרוז מיקרומטר מוקטן זה לצד זה. (ב) שתילת חרוז מילימטר בתוך המוח למטרות vivo לא יעבדו. תמונה (ג) מראה מיקרוחרוז מפוברק באמצעות פרוטוקול זה. הגודל מתאים להוספה בתוך ההיפוקמפוס של החולדה מבלי השפעה מזיקה על הפיזיולוגיה נורמלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59597/59597fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
התמונות לעיל להדגיש את החשיבות של שליטה בגודל של מיקרוחרוז למחקרים כאלה. כאן, אנו מדגימים את היתרון של שימוש בחרוזי מיקרו קטרים תחת 600 μm. זה מאפשר את השימוש של הזרקה פולשנית (למשל, מזרק המילטון) כדי לשלוט טוב יותר את המיקום של חרוזים מוזרק בתוך המוח.
לסיכום, encapsulating 7PA2 תאים מעניקה שליטה על גודל של מיקרוחרוזים, מספר תאים כימוס וחיזוי של Aβ מופרש מן המיקרוחרוזים (למשל, ריכוז, פרופיל שחרור). שליטה בגודל של מיקרוחרוזים חיונית משתי סיבות: 1) כדי לאפשר שליטה מכוון עדין על הריכוז של שוחרר Aβ, ו 2) כדי לאפשר השרשה באזור מבוקרת של המוח העכברוש. התוצאות שהתקבלו כאן לתאר את כוונון נתיישב של מיקרו חרוזי מיקרוגינג ולהדגיש יישומים פוטנציאליים למחקרים נוספים.

פרוטוקול זה ממחיש שיטת עטיפת תא על-ידי הגגנציה פיזית מהירה של קילוף פלסטיצידיות כדי לשתק תאים. מיקרוחרוזי מיקרו מאפשרים הפרשה מבוקרת ומתמשכת של עמילואיד-β לאורך זמן, ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעות של המופרש עמילואיד-β ב מבחנה ומודלים vivo.

הייצור של עמילואיד-β-הפרשה Alginate מיקרו חרוזי לשימוש ב דוגמנות מחלת אלצהיימר

According to the amyloid cascade hypothesis, the earliest trigger in the development of Alzheimer&#8217;s disease (AD) is the accumulation of toxic ...

פרוטוקול זה מסביר ייצור של microbeads, אשר ישמש כדי לסייע בשליטה על קצב השחרור ואת כמות עמילואיד שהוא חלבון של עניין. המיקרוביאדים ישתקו תאים בביו-חומר מתאים ויגן עליהם מסביבתם, כמו גם יאפשר להם להחליף תוצרי לוואי וחומרים מזינים בסביבתם. אנקפסולציה של תאים באמצעות טכניקה זו מבטיחה שליטה הדוקה בגודל החיידק כמו גם במספר התא, ואנחנו עושים זאת על ידי התאמת פרמטרי ייצור שונים.אז אנקפסולטוריה של התאים המתוארים בפרוטוקול זה תיתן לנו יותר שחרור כרוני של עמילואיד לשימוש הן במערכות במבחנה והן במערכות במבחנה, והרעיון יהיה שזה ייתן לנו הבנה טובה יותר של מנגנוני המחלה וגם יאפשר לנו לבדוק טיפולים חדשים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לגבש מערכת מבוקרת וללמוד את שחרורו של כל biomolecules עבור סוגי תאים רבים, בין אם לבד או בשילוב. כדי להתחיל, להסיר בקבוק כמעט confluent מהחממה.טפל בתאים עם 0.25%פתרון טריפסין-EDTA ודגירה ב 37 C במשך חמש עד 10 דקות כדי לנתק את התאים. לאחר הוספת אמצעי DMEM/F12, לאסוף את התאים לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 1000 סל"ד במשך חמש דקות.הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה ב- HEPES אגירת מלוחים להכפיל את ריכוז התא הרצוי הסופי. בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, לערבב את ההשעיה תא זה ביחס אחד לאחד עם 4% משקל ונפח alginate פתרון כדי להשיג השעיה סופית המכילה את הריכוז הרצוי של התא בתתבר 2%משקל נפח alginate. כדי להגדיר את פרמטרי האנאקפסולציה, הגדר את המהירות של מכונת אנקפסולטור למהירות ההבלטה המרבית ולאחר מכן הגדר את המתח ואת התדר.כדי להמציא את המיקרוביאדים, במזרק 20 מיליליטר, לטעון חמישה מיליליטר של ההשעיה התא-אלגינט ולצרף מזרק אנקפסולטור. כדי להתחיל את encapsulator, להפעיל את הזרימה אשר ידחוף את ההשעיה תא אלגינט דרך המאכיל, וזרם של טיפות יובלט דרך הזרבובית. לאסוף את המיליליטר הראשון בסקולר הפסולת כדי למנוע את הזרם הלא אחיד הראשוני.לאחר מכן המשיכו להריץ את ארבעת המיליליטרים הנותרים המאפשרים ל טיפות ליפול לאמבט ג'לציה סידן כלורי. במגע עם אמבט הג'לציה, האלגינט ב טיפות מיד חוצה קישורים עם יוני הסידן באמבט gelation, ויוצרים microbeads כדורי. לאחר דקה אחת, הסר את מקור הג'לציה מהפלטפורמה המגנטית ואפשר למיקרוביאדים לנוח במשך ארבע דקות נוספות ללא תסיסה כדי להשלים את הג'לציה שלהם בטמפרטורת החדר.כדי לאחזר את המיקרוביאדים, השתמש תחילה בזוג פינצטה סטרילית כדי להסיר פסולת אלגינט גדולה או חפצים. לאחר חיתוך הקצה של פיפטה פלסטיק, להשתמש בו כדי להעביר את microbeads מאמבט gelation למסנן רשת 74 מיקרומטר מוחזק מעל פסולת. כדי להבטיח הצלחה, אנחנו תמיד חותכים את הקצה של פיפטה פלסטיק כדי למנוע נזק microbeads ואנחנו עושים את זה בכל פעם שאנחנו מעבירים חרוזים מכלי אחד לאחר אנקפסולציה.היפוך מסנן רשת מעל צינור צנטריפוגה. פיפטה מדיום התרבות המתאים על זה לשטוף את חרוזים במורד הצינור ולאפשר להם לצייד במדיום זה במשך חמש דקות. לאחר מכן להעביר אותם בקבוקון מלא בעבר עם המדיום המתאים עבור דגירה וניסויים נוספים.כדי להעריך את הכדאיות של התא לאחר אנקפסולציה ותרבות, להוסיף תערובת פירוק כדי לשבש בעדינות את microbeads ולשחרר את התאים אנקפסולציה. דגירה התאים באינקובטור תרבות התא בתוספת 5%פחמן דו חמצני ב 37 C במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. להעריך את הכדאיות התא של תאים אלה על ידי הכתמת אותם עם כחול trypan ושימוש בתא hemocytometer.כדי להעריך את יציבות החיידקים, למדוד את הקוטר הממוצע עבור מדגם מכל אוכלוסיית חיידקים לאורך קורס זמן באמצעות מיקרוסקופ ותוסדת הדמיה. לאחר ההכנה, חיידקים אלגינטים אחידים וספירתיים נוצרו בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה. לאחר יום אחד בתנאי תרבות תאים סטנדרטיים, 7PA2 תאים אנקפסולציה חולקו באופן שווה microbeads.כאשר התפשטות תאים 7PA2 נבדק באמצעות מבחן MTS, לא היה הבדל משמעותי בין ההתנהגות של 7PA2 תאים גדל עם או בלי alginate על פני תקופה של שבעה ימים. מדיה מותנה ניתח מ 2D ו 3D תרבויות של תאים 7PA2 גילה עלייה מתמדת עמילואיד-בטא 1-42 רמות בשתי התרבויות. קצב השחרור של עמילואיד-בטא 1-42 ממיקרוביאדים, או תרבות תלת מימד, דומה בפרופיל לזה ששוחרר מתרבות הדו-מימד.7PA2 תאים אנקפסולציה microbeads אלגינט יכול לשמש ביעילות לשחרור מתמשך של עמילואיד-בטא. חיידקים לחריטה במוח החולדה חייבים להיות קטנים מספיק כדי להיות מוטבעים מבלי ליצור פגיעה גדולה. השתלת חרוז בקנה מידה מילימטרי בתוך המוח למטרות vivo לא יעבוד, ואילו microbead מפוברק באמצעות פרוטוקול זה יש גודל מתאים להכנסה בתוך ההיפוקמפוס של החולדה.כדי לוודא שיש לנו חלוקה אחידה של תאים במוצר הסופי, חשוב לערבב ביסודיות את התאים בהשעיית אלגינט התא, וזה מבטיח שחרור אחיד של עמילואיד מכל חיידק.

fabrication-amyloid-secreting-alginate-microbeads-for-use-modelling

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תכונה אחת של מחלת אלצהיימר היא העלאת...

הכנת Oligomeric β עמילואיד 1-42 ו אינדוקציה של ירידת ערך הפלסטיות הסינפטית על Slices בהיפוקמפוס

בסעיפים הבאים, אנו המתאר הליכי ההכנה של אלגינט microspheres לשימוש ביישומים ביו. אנחנו במיוחד להמחיש את הטכניקה ליצירת אלגינט microspheres רב שכבתי למטרה כפולה של התא אנקפסולציה חלבון כטיפול פוטנציאלי לסוכרת מסוג 1.

דור של אלגינט microspheres עבור יישומים ביו

סרטון זה מדגים את ההליך של הזרקת פפטידים עמילואידים מונומריים למוחם הקדמי של דגי זברה בוגרים כדי ליצור רעילות עמילואידית, המחקה את הנזק העצבי שנראה במחלת...

ביסוס מודל מחלת אלצהיימר במוח של דגי זברה באמצעות הזרקת פפטיד עמילואיד

סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת פפטידים עמילואיד-בטא, אלומיניום כלורי וגורם גדילה נוירו-דלקתי, אשר ביחד מסייע בהיווצרות רובד עמילואיד רעיל באזור ההיפוקמפוס. זה גורם לפגיעה בזיכרון בחולדה, האופיינית למחלת אלצהיימר.

ביסוס מודל חולדות למחלת אלצהיימר באמצעות הזרקת פפטיד עמילואיד-בטא

סרטון זה מדגים שיטה לייצור מיקרו-חרוזים פולימריים העוטפים תאים מפרישי עמילואיד-בטא נוירוטוקסיים. תרחיף התא-פולימר מעובד באמצעות מכשיר לייצור מיקרו-חרוזים, כאשר ג'לציה פולימרית מושגת באמצעות קישור צולב של סידן, ויוצר מיקרו-חרוזים כדוריים סביב התאים. הפולימר מאפשר התפשטות תאים תוך שחרור מבוקר וארוך טווח של עמילואיד-בטא, המדמה את הצטברותו במחלת אלצהיימר.

ייצור מיקרו-חרוזים פולימריים משחררי עמילואיד-בטא למידול מחלת אלצהיימר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לעירוי מוח סטריאוטקסי ישיר של עמילואיד-בטא. מתודולוגיה זו מספקת מודל עכבר in vivo חלופי לטיפול בהשפעות קצרות הטווח של עמילואיד-בטא על נוירונים במוח.

עירוי stereotaxic של Oligomeric עמילואיד-ביתא להיפוקמפוס העכבר

כדי לחקור את ההשפעות של Aβo in vivo, פיתחנו מודל המבוסס על עירויים חוזרים ונשנים של Aβo מסיס בהיפוקמפוס יחד עם עירוי רציף של נוגדן Aβo (6E10) בהיפוקמפוס באמצעות משאבות אוסמוטיות כדי לנטרל את ההשפעה הנוירוטוקסית של Aβo.

מוחיים במודל חיה של עמילואיד-ביתא כרונית oligomer העירוי נוטרלה על ידי נוגדן טיפול חדורי משאבות אוסמוטי

פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של כמעט כל אירוע phagocytic in vivo.

3D כמוני סיליקו דוגמנות (q3DISM) של Phagocytosis עמילואיד-ביתא מוחין במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר

זהו פרוטוקול לחקות מחלת אלצהיימר אצל חולדות על ידי הערכה של ליקוי זיכרון מרחבי, שינויים פתולוגיים עצביים, בטא עמילואיד עצביים חלבון (Aβ) נטל ושילב מצבור קשרים neurofibrillary, המושרה על ידי ההזרקה של Aβ25-35 עם אלומיניום trichloride, האדם רקומביננטי צורה של גורם גדילה-β1.

הקמת לחקות יקר של מחלת אלצהיימר במודל בעלי חיים עכברים באמצעות הזרקת Intracerebroventricular החלבון בטא עמילואיד שערכת

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

כאן, אנו מתארים מערכת שמרים המשחזרת γ-הפרשה אנושית. מערכת זו מאפשרת זיהוי ומחקר של מוטציות המשפיעות על הפעילות ובדיקת מעכבי γ-סקרטאז (GSI). תוך ניצול תכונות אובדן התפקוד של מוטציות משפחתיות של מחלת אלצהיימר, ניתן לסנן מאפנני γ-סקרטאז (GSM).

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) מודלים של מחלת אלצהיימר לסינון גנים, מוטציות וכימיקלים המשפיעים על ייצור בטא עמילואיד על ידי γ-secretase

למדו שיטת ייצור מיקרו-חרוזי אלגינט המכילים תאים לשחרור מבוקר של עמילואיד-β. הפרוטוקול משמש למחקר מחלת אלצהיימר ומאפשר בחינת מנגנוני מחלה ופיתוח טיפולים חדשים.

הייצור של עמילואיד-β-הפרשה Alginate מיקרו חרוזי לשימוש ב דוגמנות מחלת אלצהיימר

גלה סרטונים נוספים