איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של מוטציות הקשורות לגידול וכיום מחמיא הליכים כירורגיים פולשניים. חוזק נוסף הוא היכולת להשתמש בפרוטוקול זה כדי לפקח על עומס מוטציה הגידול שעות נוספות. הטכניקה מאפשרת גידול genotyping ללא צורך ביופסיה רקמה כירורגית בפועל אשר מועיל במיוחד עבור גידולים במקומות מאתגרים, כמו גזע המוח עם גישה מוגבלת לרקמות.

בהיעדר ביופסיה חוזרת, נתונים מולקולריים אורך אינו זמין להחמיא MRI. ניטור PCR דיגיטלי מאפשר תוסף מבוסס מולקולרית לאבחון, ומאפשר תהליך קבלת החלטות טיפול מושכל יותר. שיטות דומות ניתן להשתמש כדי לזהות את הביטוי של גנים במערכת מסוימת, עם גשושיות קונבנציונליות Fluo-4 ו quencher מקושר אבל עם רגישות גבוהה יותר מאשר עם PCR כמותי.

לפני תחילת הליך PCR דיגיטלי טיפה, לנקות את שטח הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול בעדינות מערבולת בקצרה צנטריפוגה כל reagents, למעט טיפה מייצב שמן. ודא כי גליל גז חנקן דחוס מחובר למכשיר יצירת טיפה כי מיכל הצילינדר מוגדר ב 90 פאונד לאינץ 'מרובע. ו 38 microliters של תערובת תגובת PCR דיגיטלית ישירות לתוך החלק התחתון של כל באר של רצועת צינור PCR שמונה היטב, הסרת כל בועות עם קצה פיפטה נקי.

הוסף 12 מיקרוליטרים של דגימת DNA מוגברת מראש ב- triplicate ל הבאר המתאימה של רצועת הצינור. בעדינות pipette את הנפח המלא 10 פעמים כדי לערבב את תערובת התגובה עם מדגם ה-DNA ו pipette את הנפח המלא מכל באר לתוך ערוצי A עד H המתאים של שבב מכשיר יוצר טיפה. הכנס רצועת צינור PCR חדשה לתוך מכשיר יצירת טיפה ולסרוק את טיפה יצירת מזהה שבב מכשיר לתוך התוכנה במחשב המכשיר.

לאחר מכן לחץ על התחל את 'הפעלה' כדי להתחיל בפילוח דגימות. לאחר השלמת dropletization, להסיר את רצועת צינור PCR ולהחיל כובעי רצועת צינור. מעבירים את רצועת הצינור למחזור תרמי ומאזנים את הצינור עם רצועת צינור נוספת המכילה 80 מיקרוליטרים של מים ל הבאר.

לאחר מכן הפעל את רוכב האופניים התרמי בתנאי הרכיבה התרמית המתאימים. החלף את כובעי הפסים באותיות גדולות. לאחר השלמת הרכיבה התרמית, העבר את רצועת הצינור למכשיר הכימות, לחץ על הגדר ריצה בתוכנת המכשיר והצב את רצועת הצינור בכלי הכימות.

מניחים את מגן המתכת על גבי שבב מכשיר כימות חדש, סורקים את מזהה השבב לתוך המכשיר ומכניסים את השבב למכונה. סגור את מכסה המכשיר. בתוכנת המחשב, הזן שם עבור הפעלת PCR דיגיטלית עבור כל אחד משמונת הערוצים, לאחר מכן בחר מצב מהיר ולחץ על התחל כדי להתחיל לכמת.

כדי לנתח את הנתונים הספקטרליים הגולמיים, הפעל את תוכנת האנליסטים ופתח את קבצי fcs. תחת תצוגת ניתוח, בחר ללא פגע. תחת תצוגה לדוגמה, לחץ על התיבות לצד כל אחת משמונה הדגימות.

התוכנה תתלה את האותות עבור אללים מסוג מוטנטים ופראיים לאורך ציר x ו- y בהתאמה. השתמש בפונקציית המטריצה המחושבת כדי להגיש בקשה לפיצוי ספקטרלי על טיפות שלמות, בהתאם למדריכים של היצרנים ולהתאים את הגדרות הציר תחת אפשרויות ציר. הגדר את ציר ה- x למינימום של אפס ומקסימום של 30, 000 וציר y למינימום של מינוס 5, 000 ומקסימום של 10, 000.

לאחר שזוהו אשכולות טיפות, התאימו את הציר כדי להקטין את השטח הריק בגרף. בחר את הדגימה המתאימה לדנ"א הגנומי של רקמת הגידול בשליטה חיובית כדי להגדיר את שערי המוטנטים השליליים ואת שערי סוג הבר, כדי להבטיח שהאשכולות נבדלים וזוהו בקלות. לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר החל את כל ההגדרות על דוגמאות נבחרות כדי להחיל את הגדרות השער עבור הפקד החיובי על כל הדוגמאות.

תחת התצוגה הגרפית, לחץ על דוגמאות מרובות כדי להציג את ההתוויות עבור כל הדוגמאות שנבחרו ולייצא את התמונה כקובץ tif. לאחר מכן, תחת סביבת עבודה, בחר ניתוח ייצוא ושמור את קובץ הנתונים שנותח כקובץ csv. כאן, תוצאות מייצגות לגילוי מוצלח של מוטציה בפלזמה מוגברת מראש ותא נוזלי השדרתי ללא DNA משני ילדים עם גליומה מפוזרת באמצע הקו מוצגים.

בניסוי זה, הפרדה ברורה בין אשכולות מוטנטים וסוגי בר ניתן לראות לאורך ציר x ו- y בהתאמה. אשכולות חזקים מסוג פראי מצביעים על כך שאיבת הדנ"א ללא תאים הצליחה מכיוון שדנ"א של תבנית קיים. עבור חולים אלה, אשכולות המוטנטים מראים תדירות אללית מוטציה של 1.6 ו 39.32 אחוזים עבור דגימות פלזמה ונוזל השדרתי בהתאמה בהתאם למצב מוטציה הגידול כפי שאושר על ידי ניתוח גנומי של רקמת הגידול ביופסיה.

השליטה השלילית לעומת זאת מראה אפס מוטנטים ואפס טיפות מסוג בר המצביעים על כך שלא היה זיהום של תערובת תגובת PCR. ה-DNA הגנומי של רקמת הגידול בשליטה חיובית מראה את המוטציה שזוהתה בתדר הכלילי הצפוי עבור דגימת הגידול המסוימת שנבחרה. היעדר זיהוי מוטציה בתוך הפלזמה לא יכול להיות הכרחי אומר כי החולה הוא סוג פראי עבור מוטציה של עניין כמו שליליות שווא להתרחש.

לדוגמה, בחולה זה, למרות המוטציה של עניין לא זוהה, מצב המוטציה אושרה על ידי ניתוח גנומי של רקמת הגידול. PCR היא טכניקה רגישה מאוד הדורשת טיהור תכופים של אזור העבודה וציוד, כדי למנוע רכישת נתונים חיוביים כוזבים.