Name: מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: למדו שיטת השלמה מבנית לניטור אינטראקציות GPCR-β-arrestin בזמן אמת בתאים חיים. שיטה זו מאפשרת גילוי תרופות חדשות עם תופעות לוואי מינימליות ומסייעת בחקר פרמקולוגיה של קולטנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המחקר (NRF-2015M3A9E7029172) של הקרן הלאומית למחקר של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד המדע, התקשוב, ותכנון עתידי.

1. פריימר אסטרטגיית עיצוב
<ol><li>עיצוב התחל להציג גנים של עניין לתוך pBiT 1.1-C [TK/LgBiT], pBiT 2.1-C [TK/SmBiT], pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] וקטורים.</li>
	<li>בחר לפחות אחד משלושת האתרים האלה כאחד משני אנזימי ההגבלה הייחודיים הדרושים לשכפול כיוונים בשל נוכחותם של מסגרת עצירה במסגרת שמפרידה את האתר הרב כמוצג באיור11.</li>
	<li>שילוב רצף נוקלאוטיד לתוך התחל כפי שמוצג בטבלה 1 כדי לקודד את שאריות המקשר המוצגים באדום בטבלה 211.</li>
	<li>עבור pbit 1.1-c [tk/lgbit] ו-pbit 2.1-c [tk/smbit] וקטורים, ודא כי 5 התחל מכיל atg קודון רצף הסכמה חזקה של קוזק (gccgccacc).</li>
	<li>עבור pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] וקטורים, להבטיח כי 3 התחל מכיל לעצור codon. הערה: כל וקטור מכיל את היזם HSV-TK כדי למזער שיוך לא ספציפי ולהפחית את הממצאים הניסיוניים, גם לכל וקטור יש קלטת ביטוי עבור עמידות אמפיצילין בחיידקים.</li>
</ol>2. PCR
<ol><li>להגדיר ולהפעיל את התגובות PCR כדי להגביר את ה-DNA להוסיף את הגן של העניין באמצעות התחל מעוצב משלב 1. חשוב להשתמש באמינות גבוהה DNA פולימראז כדי למזער מוטציות.</li>
	<li>השתמש בדיוק בסדר הבא כדי להכין 50 μL של תגובת ה-PCR. להוסיף 35.5 μL של מים מזוקקים, 5 μL של 10x פולימראז מאגר, 5 μL של התערובת dNTP (2.5 mM כל אחד), 1 μL של תבנית פלאמיד (200 ng/μL), 1.25 μL של קדימה והפוך תחל (10 μM) ו-1 μL של באיכות גבוהה פולימראז (5 U/</li>
	<li>שימוש בציקלטרזה הגדיר את תוכנית הגברה הבאה של הדנ א<ol>
<li>הספרות 95 ° c עבור 5 דקות.</li>
		<li>חזור על 25 פעמים את המחזור התרמי הבא: 95 ° צ' עבור 30 s, 60 ° c עבור 1 דקות, 72 ° צ' עבור 2 דקות לכל 1 kbp להיות הוגדל.</li>
		<li>הפעל הארכה אחרונה ב 72 ° c עבור 10 דקות.</li>
		<li>החזיקו את הדגימות ב -4 ° c בתוך הציקלטרנר התרמוטראני. הערה: מומלץ מאוד להשתמש פולימראז באיכות גבוהה כדי למזער את מוטציות הנקודה במיוחד אלה המתרחשים במהלך הגברה של רצפים ארוכים. כמו אמפליקון הופך ארוך יותר, מידת הדיוק של השכפול של ה-DNA פוחתת. עבור תגובת ה-PCR, בחר את טמפרטורת הריפוי המבוססת על טמפרטורת ההיתוך של האזור שבו האוליגוס ישירות מhybridize עם תבנית ה-DNA ולא עם כל הרצף של המפתח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מוצרים לטיהור<ol>
<li>בודד את מוצר ה-PCR משאר תגובת ה-PCR באמצעות ערכה מיצרן של העדפה12. מוצר ה-PCR מוכן כעת לעיכול הגבלה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. העיכול
<ol><li>עבור העיכול המוצר PCR להכין 50 μL של תגובת העיכול כדלקמן.<ol>
<li>באמצעות שפופרת 1.5 mL, להוסיף 12 μL של מים מזוקקים.</li>
		<li>הוסף 5 μL של מאגר 10x עם התאימות הטובה ביותר עם אנזימי הגבלה.</li>
		<li>משלב 2.4 להוסיף 30 μL של המוצר PCR</li>
		<li>לבסוף, הוסף 1.5 μL של כל אנזים הגבלה.</li>
		<li>לערבב בקצרה על ידי מערבולת ו-מודטה ב 37.5 ° c בלילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור העיכול של המטופל הפלמיד להכין 50 μL של תגובת העיכול כדלקמן:<ol>
<li>באמצעות שפופרת 1.5 mL, להוסיף 23 μL של מים מזוקקים.</li>
		<li>הוסף 5 μL של מאגר 10x עם התאימות הטובה ביותר עם אנזימי הגבלה.</li>
		<li>להוסיף 15 μL של הנמען פלמיד (200 ng/μL).</li>
		<li>הוסף 1.5 μL של כל אנזים הגבלה.</li>
		<li>לערבב בקצרה על ידי מערבולת ו-מודטה ב 37.5 ° c בלילה. הערה: חשוב להשתמש 3 μg של מרכז הניקוי של הנמען על מנת להשיג חומר מספיק לאחר בדיקת ה-DNA ג'ל טיהור. זה גם רלוונטי לעזוב את העיכול DNA לילה באמצעות שתי האנזימים כדי להשיג יעילות שיבוט גבוהה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. דנ א ג'ל לטיהור ושיבוט
<ol><li>הכן 1% agarose ג'ל להפעיל את ה-DNA מתעכל באמצע ומוסיף ולהמשיך לחתוך את הלהקות המתאימות. לאחר להקות וקטור המקביל להוסיף כבר purified12, לקבוע את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרוסקופיה.</li>
	<li>בצע הארכה ל-DNA כדי להחדיר את ההכנסה לפלאמיד הנמען.</li>
	<li>להכין תגובות הנוגע בסביבות 100 ng של דנ א סה כ כולל 50 ng וקטור פלמיד.</li>
	<li>כוונן את היחס הבין-פלסטי לנמען של כ-1:3; ניתן לחשב אותו באמצעות מחשבון מוסף וקטורי13.</li>
	<li>כוונן פקדים שליליים במקביל. לדוגמה, הארכה של ה-DNA של הנמען ללא כל הוספה תספק מידע לגבי מידת הרקע של האדם הבלתי מתעכל או הליגמיד של הנמען.</li>
</ol>5. טרנספורמציה של שיבוטים
<ol><li>מניחים שפופרת של תאים DH5α המוסמכת מהמקפיא ב-80 ° c ומיד להעביר אותו על הקרח 20 דקות.</li>
	<li>לאחר מכן, לקחת 55 μL של DH5α תאים מוכשרים ולהוסיף 4 μL של תגובה לאחר ולערבב על ידי מצליף הצינור ולאחסן על קרח עבור 45 דקות.</li>
	<li>מניחים את הצינור באמבט מים שחומם בעבר ב 42 ° צ' עבור בדיוק 48 s ומיד לקבל את הצינורות חזרה על הקרח עבור 3 דקות נוספות.</li>
	<li>הוסף 600 μL של לוריא ציר (LB) בינוני שחומם בעבר 37.5 ° צ' ו דגירה עם רעד עבור 1 שעה ב 200 rpm.</li>
	<li>העבר 200 μL לצלחת אגר המכיל אמפיצילין 100 μg/mL ולהתפשט בעדינות על פני השטח עם הנוזל הוא נספג בעיקר.</li>
	<li>כדי לראות את המושבות. בבוקר הבא הנמען הפלמיד על לוחית ההכנסה צריך להיות באופן משמעותי יותר מושבות מאשר הנמען לבדו פלמיד לבד.</li>
</ol>6. בידוד פלמיד המוגמר
<ol><li>לבחור 3-10 מושבות חיידקי בודדים להעביר לתוך 1 מ ל של LB בינונית המכילה אמפיצילין (100 μg/mL) ו-דגירה עבור 6 h.</li>
	<li>קח 200 μL של השעיה בקטריאלי והעברה 5 מ ל ליברות בינונית המכילה את אותו ריכוז של אמפיצילין כמו בשלב 6.1 ו דגירה לילה ב 37.5 ° צ' עם טלטול ב 200 rpm.</li>
	<li>באמצעות מיני הכנה לטיהור ערכת ה-dna, לבצע מיני הכנה DNA משתמש באמצעות 5 מ ל של LB גדל לילה לאחר הוראות היצרן14.</li>
	<li>כדי לזהות הטיות מוצלחות, הגדר את תגובות ה-PCR באותו אופן כמו בסעיף 2 באמצעות ה-DNA המתקבל משלב 6.3 כתבנית עם אותו התחל כמו בסעיף 2 במהלך ה-PCR הראשון. שיבוטים חיוביים יפיק מוצרים PCR עם הגודל המתאים.</li>
	<li>לאחר טיהור גדול ה-DNA להכנה של שיבוטים חיוביים, התנהלות הגבלת העיכול של 500 ng של דנ א מטוהרים עם אנזימים המשמשים בשלב השיבוט ולהפעיל את המוצרים מתעכל על 1% agarose ג'ל. צריך להיות שתי להקות: אחד בגודל של הווקטור ואחד בגודל של הכנס החדש.</li>
	<li>בדוק את רצף הבנייה לפי רצף באמצעות התחל הבאה: קדימה 5 '-aaggtgacgcgaac-3 ' והפוך 5 '-gcatttttttcttagtt-3 '. הערה: כאשר ה-DNA משוכפל באמצעות ה-PCR, תמיד יש את האפשרות של שגיאות במהלך הגברה גם כאשר באמצעות פולימאז באיכות גבוהה, ולכן חשוב מאוד לרצף את המבנים הסופיים.</li>
</ol>7. מעבר וביטוי חלבונים
<ol><li>ב בעבר פולי-L-ליזין מצופה לבן 96 היטב צלחת, לבצע זריעת תאים יום אחד לפני היפוך ב 2.5 x 104 תאים לכל טוב באמצעות בינונית שונה של הנשר של דולבקו שיושלם עם 10% סרום שור עוברי, 100 U/ML פניצילין G, and 100 μg/ סטרפטומיצין mL.</li>
	<li>השתמש רק 60 הבארות הפנימיות כדי למזער את הפוטנציאל עבור מעברי חום על פני הצלחת ואפקטים הקצה מן האידוי. הוסף 200 μL של מים מזוקקים סטרילי כדי 36 בארות מחוץ ו 150 μL ב החללים בין בארות ו-דגירה הלילה ב 37.5 ° צ' ו 5% של CO2.</li>
	<li>למחרת בבוקר לבצע החצייה באמצעות 100 ng של דנ א מוחלט (50 ng כל בניית).</li>
	<li>כוונן ארבע שילובים שונים פלביניים (קולטן: β-בפיגור) לפי איור 2b.</li>
	<li>עבור כל להשתמש בשילוב פלסטלינה 20 μL של שונה מדיה חיוניים מינימלי של הנשר באגירה עם HEPES באמצעות 0.3 μL של מגיב התקשורת הליפידית לטובה.</li>
	<li>הוסף 20 μL של העברה למעלה מגיב-DNA לתערובת היטב ולערבב את הצלחת במעגלים עבור 10 s.</li>
	<li>שינוי מדיום טרי לאחר 6 שעות דגירה ב 37.5 ° צ' ו 5% CO2.</li>
	<li>מודקת את הצלחת 24 שעות ב 37.5 ° צ' ו 5% CO2.</li>
</ol>8. קולטן ניטור-β-arrestin1/2 אינטראקציות ב HEK293 תאים
<ol><li>המדיום להוסיף ומוסיפים 100 μL של שינוי מדיה חיוניים מינימלי של הנשר באגירה עם HEPES לכל באר ולתת את הצלחת לייצב ב RT עבור 10 דקות.</li>
	<li>להכין את המצע הזועם על ידי שילוב 1 נפח של מצע 100x עם 19 כרכים של מאגר דילול LCS (דילול 20-קיפול)11, יצירת מלאי 5x לערבב עם מדיום תרבות התאים.</li>
	<li>הוסף 25 μL של 5x הזועם כל טוב ולערבב בעדינות עיגולים עבור 10 s.</li>
	<li>מדידת האור עבור 10 דקות עבור ייצוב אותות ב RT. הערה: על-ידי שימוש באות בסיסית זו כדי לנרמל את התגובה של כל באר, היא תסייע להפחית את השונות שנגרמת כתוצאה מהבדלים במספר התאים המצופה בטוב, גם הבדלים ביעילות הדרך ועוד. לאחר חישוב, ממוצע התגובה המנורמלת משכפול בארות עבור טיפול תרופתי מסוים.</li>
	<li>הכינו 13.5 x ליגנד פתרון ב שינוי מינימלי של הנשר מדיה חיוניים באגירה עם hepes.</li>
	<li>עבור ניסויים בטמפרטורת החדר עם 10 μl של 13.5 x ליגנד בנוסף, להוסיף את תרכובות באמצעות מרססים או פיפטה רב-ערוצי ולערבב את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (20 s ב 200 rpm).</li>
	<li>לניסויים ב 37.5 ° c עם 10 μl של 13.5 x ליגנד בנוסף, מרססים להשתמש כדי לחלק תרכובות ולערבב באמצעות מכשיר מסלולית שייקר. במקרה של לא שימוש מרססים, להסיר את הצלחת מן הלומטר, להוסיף את הליטרים ולערבב את הצלחת ביד או באמצעות שייקר מסלולית (20 s ב 200 rpm). הערה: השימוש מרססים ו שייקר בתוך כלי הזיהוי כדי למזער תנודות בטמפרטורה הקשורים להסרת הצלחת מתוך לומימטר. ניתן להשתמש באפשרות זו באמצעות מדידת שחקן רגיל לשימוש עבור שיטת הפעולה. השתמש בזמן שילוב של 0.25 – 2 s.</li>
</ol>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pharmacology+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li>
<li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li>
<li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li>
<li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+%CE%B2-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li>
<li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li>
<li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+signalling%3A+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li>
<li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+signatures+in+%CE%B2-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nanobit+Protein+Protein+Interaction+System+Protocol%22">Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22HiYield+Gel%2FPCR+Fragments+Extraction+Kit%22">HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit</a>. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).</li>
<li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ligation+Calculator%22">Ligation Calculator</a>. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cosmo+Genetech%22">Cosmo Genetech</a>. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS=
 (2019).</li>
<li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+incretins%3A+GLP-1+and+GIP%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li>
<li>ProMega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoGLO+Endurazine+and+Vivazine+Live+Cell+Substrates+Technical+Manual%22">NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים על אינטרסים מתחרים.

באמצעות השיטה המוצגת כאן, אינטראקציות בין כל GPCR ו β-arrestin1/2 יכול להיות מנוטרים בזמן אמת מערכות החיים באמצעות זה GPCR-β-בפיגור מבניים שיטת השלמת. בהקשר זה, היינו מסוגלים לצפות הβ הדיפרנציאלי מפיגור הגיוס בין שני β-מפיגור של שניים על ידי GLP-1r (מחלקה פרוטו אופיינית B GPCR), ראינו גם דיסוציאציה של הקומפלקס קולטן-β-בפיגור כמה דקות לאחר שהגיע המקסימום . אות זורח
על מנת לקבל את הרגישות הטובה ביותר במערכת מבנית מבנה מבניים, זה הוקרן עם ארבעה מרחבי מרחבית שונים בין הקולטן ואת כל β בפיגור והאחד ...

GPCRs מייצגים את היעד של כמעט 35% התרופות הנוכחיות בשוק1,2 והבנה ברורה של פרמקולוגיה שלהם הוא חיוני בפיתוח תרופות טיפוליות הרומן3. אחד ההיבטים המרכזיים בגילוי הסמים GPCR, במיוחד במהלך התפתחות של אגוניסטים מוטה הוא האפיון של ליגונים הרומן לקראת קולטן-β-מפיגור של אינטראקציות4 ו-β-מפיגור עם חלבונים אחרים ציטוסולונים כגון כקלרין5
זה תועד כי β-מפיגור איתות משחק תפקיד מפתח בהפרעות נוירולוגיות כגון הפרעה דו-קוטבית, דיכאון חמור, ו סכיזופרניה6 וגם תופעות לוואי חמורות בתרופות מסוימות כגון מורפיום7.
השיטות הנוכחיות המשמשות לניטור האינטראקציות הללו בדרך כלל לא מייצגים רמות אנדוגניים בפועל של החלבונים במחקר, במקרים מסוימים הם מראים אות חלשה, photobleaching לבנת ובהתאם GPCR זה יכול להיות מאתגרת טכנית להגדיר8. זה מבנה הרומן מבנית משתמש וקטורים ביטוי נמוך מקדם כדי לחקות רמות פיזיולוגיות אנדודוגני ומספק רגישות גבוהה לעומת שיטות נוכחיות9. באמצעות גישה זו, ניתן היה לאפיין בקלות את הקולטן Galanin-β-arrestin1/2 וגם β-arrestin2-clathrin רין אינטראקציות10. מתודולוגיה זו יכולה לשמש רבות לכל GPCR של עניין מסוים שבו β-הפיגור לשחק פונקציה פיזיולוגית מפתח או האיתות שלהם רלוונטי מחלות מסוימות.

<table><tbody><tr><td>אנטיביוטיקה פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td> חממת חיידקים <td>פניצילין/סטרפטומיצין</td></tr><tr>חממת<td>חיידקים</td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>(מעיל אוויר),</td></tr><tr><td>מדיום תרבית תאים</td> בסיסי <td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM מדיום תרבית</td></tr><tr><td>תאים מדיום תרבית תאים</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Optimem 1X מדיום</td></tr> <tr>תרבית תאים<td>חממת CO2</td><td>NUAIRE</td><td>NU5720</td><td>חממת CO2 חום ישיר</td></tr><tr>אמבט<td>מים דיגיטלי</td><td>מעבדה טכנולוגית</td><td>LWB-122D</td><td>מעבדת אמבט מים דיגיטלית טכנולוגית</td></tr><tr><td>DNA פולימראז קריאת הוכחה</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td><td>PfU DNA פולימראז</td></tr><tr><td>ערכת טיהור DNA</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepLaboPass Purificartion Kit פלסמיד מיני</td></tr><tr><td>DNA Taq פולימראז</td><td>Enzynomics</td><td>P750</td><td>nTaq DNA פולימראז</td></tr><tr><td>הגבלת אנזים BglII</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>מאגר הגבלת אנזים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X</td></tr><tr><td>הגבלת אנזים חיץ EcoRI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>הגבלת אנזים NheI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R01315</td><td></td></tr><tr><td>הגבלת אנזים XhoI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco קנדה</td><td>12483020</td> ג'ל <td>סרום בקר עוברי</td></tr><tr><td>/ PCR DNA MiniKit</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield ג'ל / PCR DNA MiniKit</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>אולימפוס</td><td>CKX53SF</td><td>CKX53 מיקרוסקופ אולימפוס</td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה ליפידים</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>ליפופקטמין 2000</td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>ביוטק / פישר 12504386</td><td></td><td>מדעי סינרגיה 2 קוראי מיקרופלייט רב-מצבים</td></tr> מערכת <tr><td>NanoBiT Promega</td><td></td><td>N2014</td><td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td></tr><tr><td>מצע Nanoluciferase</td><td>Promega</td><td>N2012</td><td>Nano-Glo מערכת בדיקת תאים חיים</td></tr><tr><td>PCR ציקלר תרמי</td><td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>מאסטר ציקלר Nexus SX1</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4707-50ML</td><td>תמיסת פולי-L-ליזין</td></tr><tr><td>טריפסין EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>טריזין EDTA 10X</td></tr><tr><td>תרבית תאים לבנים 96 צלחות באר</td><td>קורנינג</td><td>3917</td><td>צלחת בדיקה 96 צלחת באר</td></tr></tbody></table>

מעקב gpcr-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

אינטראקציות בין חלבון G מצמידים קולטנים (GPCRs) ו-β-הפיגור הם תהליכים חיוניים עם השלכות פיזיולוגיות של חשיבות רבה. כיום, האפיון של תרופות הרומן כלפי האינטראקציות שלהם עם β-מפיגור וחלבונים אחרים ציטוסולוריג הוא בעל ערך רב בתחום של גילוי תרופות GPCR במיוחד במהלך המחקר של GPCR מוטה האגניזם. כאן, אנו מראים את היישום של הרומן מבנה מבנית הספר כדי לפקח במדויק על β-מפיגור של אינטראקציות במערכות החיים בזמן אמת. שיטה זו היא פשוטה, מדויקת יכול להיות מורחב בקלות לכל GPCR של עניין וגם יש לו את היתרון כי הוא מתגבר על אינטראקציות לא ספציפיות עקב נוכחות של מקדם ביטוי נמוך נוכח בכל מערכת וקטורים. זה מבנה קומפלמנטציה מספקת תכונות מפתח המאפשרות ניטור מדויק ומדויק של קולטן-הβ-מפיגור האינטראקציות, מה שהופך אותו מתאים במחקר של אגוניזם מוטה של כל מערכת GPCR, כמו גם הסוף GPCR c-הטרמינוס ' זירחון קודים שנכתבו על ידי GPCR שונים (GRKs) ו פוסט-טרנסלtional שינויים של הפיגור הייצוב או יציבות הקולטן-β-מורכב.

באמצעות ההליך המוצג כאן, אינטראקציות בין הפרוטוקול GPCR ושני β בפיגור היו מנוטרים. Glucagon כמו קולטן פפטיד (GLP-1r) בנייה נעשו באמצעות התחל המכיל NheI ו EcoRI אתרי הגבלת אנזימים משוכפל לתוך וקטורים pBiT 1.1-C [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-C [TK/SmBiT] תוך במקרה של β-הפיגור, שני וקטורים נוספים היו השתמשו ב-pBiT 1.1-N [TK/LgBiT] ו-pBiT 2.1-N [TK/SmBiT] באמצעות אתרי הגבלת אנזימים BgIII ו EcoRI במקרה של β-arrestin2 ו-NheI ו XhoI במקרה של β-arrestin1. תאים HEK293 היו מזוהמים באמצעות 50 ng של GLP-1r-LgBiT/SmBiT ו 50 ng של β-בפיגור עם...

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

פרוטוקול זה יש השפעה גבוהה בתחום גילוי ופיתוח סמים, במיוחד בפיתוח של תרופות חדשניות, ראשון מסוגו עם תופעות לוואי מינימליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיות מיושם על כל מערכת GPCR, ושמש כדי לקבל מידע מדויק על פרמקולוגיה קולטן במערכות חיים בזמן אמת. ההשלכות של טכניקה זו קשורות קשר הדוק לטיפולים חדשים במיוחד כאשר בטא-עצורים רלוונטיים.אלה כוללים קולטני אופיוד בכאב, קולטני דופמין בסכיזופרניה. שיטה זו יכולה להיות שימושית בתחומים רבים של מחקר מדעי רפואי מנוירולוגיה למחלות לב וכלי דם. הדגמת PCR של השיטה שלנו חשובה, כי זה מאפשר הצגה מפורטת של השלבים הקריטיים בפרוטוקול, אשר לא יהיה אפשרי עם פרסום קונבנציונלי.התחל בתכנון פריימרים כדי להציג גנים מעניינים לווקטורים pBiT. בשל קודון עצירת המסגרת המחלק את האתר מרובה השיבוטים, בחר לפחות באחד משלושת האתרים כאחד משני אנזימי ההגבלה הייחודיים הדרושים לשיבוט כיווני. עיין בכתב היד עבור רצפי נוקלאוטידים כדי לקודד את שאריות המקשר ולשלב אותם לתוך פריימרים.עבור pBiT1.1-C ו pBiT2.1-C לוודא כי פריימר קדימה מכיל קודון ATG ורצף קונצנזוס קוזאק חזק. עבור pBiT1.1-N ו pBiT2.1-N ודא כי פריימר הפוך מכיל קודון עצירה. השתמש פריימרים מעוצבים כדי להגביר את DNA הכנס של הגן של עניין.שלב את רייגנטים PCR על פי הוראות כתב יד, הקפד להשתמש פולימראז DNA נאמנות גבוהה כדי למזער מוטציות. תכנת את התרמוצ'ילר ותתחיל את התגובה. לאחר השלמת PCR, לעכל את המוצר בתגובת עיכול 50 מיקרוליטר.בצינור 1.5 מיליליטר, לשלב 12 microliters של מים מזוקקים, חמישה microliters של מאגר עיכול הגבלת 10X המתאים, ו 30 microliters של מוצר PCR. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיקרוליטרים של כל אנזים הגבלה. וורטקס תערובת התגובה.ודגירה לילה ב37.5 מעלות צלזיוס. הכינו תגובה שנייה לעיכול הפלסמיד של המטופל. בצינור 1.5 מיליליטר, לשלב 23 microliters של מים, חמישה microliters של מאגר עיכול הגבלת 10X המתאים, 15 microliters של פלסמיד הנמען, ו 1.5 microliters של כל אנזים הגבלה.מערבבים בקצרה את הצינור. ודגירה לילה ב37.5 מעלות צלזיוס. ביום שלאחר השיבוט והטרנספורמציה, בחרו שלוש עד עשר מושבות חיידקים בודדות והעבירו אותן למיליליטר אחד של מדיום LB עם אמפיצילין.דגירה התאים במשך שש שעות. ואז להעביר 200 microliters של השעיה חיידקית לחמישה מיליליטר של מדיום LB טרי עם אמפיצילין. הדגירה את התרבות ב 37.5 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד לילה.ביום שלמחרת, לבודד את הפלסמיד עם ערכת טיהור DNA מיני הכנה. מסך פלסמיד מטוהרים עבור קשירה מוצלחת עם PCR. יום אחד לפני ההטמקה, זרע את התאים על צלחת פולי-L-ליסין מצופה 96 בארות באמצעות מדיום הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור עוברי, 100 יחידות למיליליטר של פניצילין G, ו 100 microliters למיליליטר של סטרפטומיצין.הוסף תאים רק ל-60 בארות הפנימיות כדי למזער את הפוטנציאל למילויים הדרגתיים תרמיים לאורך הלוח ואפקטי קצה מאידוי. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים ל-36 בארות החיצוניות, ו-150 מיקרוליטרים לחללים שבין בארות. ואז להת הדגירה את הצלחת לילה ב 37.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.ביום שלמחר, לבצע transfection באמצעות סך של 100 DNA ננוגרם. הגדר ארבעה שילובי פלסמיד שונים על פי הוראות כתב היד. באמצעות 20 microliters של מדיה חיונית מינימלית של הנשר שונה במאגר עם HEPES, ו 0.3 microliters של רגנט transfection השומנים לכל באר.מוסיפים 20 מיקרוליטרים של רגנט טרנספרפיד ליפידי ותערובת DNA לכל באר, ומערבבים את הצלחת במעגלים במשך 10 שניות. דגירה הצלחת ב 37.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. רענן את המדיום.ותתגרה עוד 24 שעות. לאחר הדגירה, שאפו את המדיום והוסיפו 100 מיקרוליטרים של המדיה החיונית המינימלית של הנשר שעברה אגירה עם HEPES לכל באר. אפשר לצלחת להתייצב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.בינתיים, להכין את המצע furimazine על ידי שילוב נפח אחד של מצע 100X עם 19 כרכים של מאגר דילול LCS, יצירת מלאי 5X לערבב עם מדיום תרבות התא. כאשר התאים מוכנים, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של המניה לכל באר, ומערבבים בעדינות את הצלחת במשך 10 שניות. לאחר מכן למדוד את אור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לייצוב אות.לניסויים עם תוספת ליגנד, הכינו את פתרון הליגנד פי 13.5 במדיה החיונית המינימלית של Eagle עם HEPES, והוסיפו 10 מיקרוליטרים לעין באמצעות פיפטה רב-ערוצית. ואז לערבב את הצלחת ביד או עם שייקר מסלולית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לחקר אינטראקציות בין GPCR prototypical ושני isoforms בטא-arrestin.ארבעה צירופי פלסמיד שונים הוקרנו, וזה עם האות הגבוה ביותר שנבחר לניסויים נוספים. ערכי EC50 עבור כל איזופורם בטא-arrestin נקבעו באמצעות עקומות תגובה מינון, אשר התקבלו מן התגובה המרבית של כל ריכוז מחקרים קינטיים. זה קריטי להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת עיצוב פריימרים PCR.פיתוח המבנים הנכונים חיוני להצלחתם של מתנאים אלה. בעקבות מתודולוגיה זו, תוכל לפקח על אינטראקציות קולטן-בטא-arrestin, כמו גם אינטראקציות קולטן עם חלבונים ציטוסוליים אחרים. מתודולוגיה זו תסייע לענות על שאלות בסיסיות בתחום הפרמקולוגיה GPCR על ידי לימוד כיצד אינטראקציות GPCR-בטא-arrestin ניתן לווסת על ידי שינויים במבנה ligand.

monitoring-gpcr-arrestin12-interactions-real-time-living-systems-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

שיטות פשוטות לזיהוי הפעלה סלקטיבית של חלבוני G על ידי קולטנים מצומדים לחלבון G נותרו אתגר יוצא דופן באיתות תאים. כאן, חיישנים ביולוגיים של העברת אנרגיית תהודה (FRET) של Fӧrster פותחו על ידי קשירה זוגית של פפטידי חלבון GPCR ל-G כדי לחקור שינויים קונפורמטיביים בריכוזים מבוקרים בתאים חיים.

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

בהינתן כי GPCRs הם מטרות druggable אטרקטיבי, gpcr ליגנד הקרנה היא הכרחית ובכך לזיהוי תרכובות עופרת ולמחקרים de aniטיזציה. לקראת מאמצים אלה, אנו מתארים את פרסטו-טנגו, פלטפורמת משאב מקור פתוח המשמש ליצירת פרופיל סימולטני של גיוס β-arrestin2 ארעי ב כ 300 GPCRs באמצעות שיטת העיתונאי מבוסס TEV.

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות תת-משפחת קולטני S1P (S1PRs). כאן, צינור מתואר כדי להרחיב על המבנים והתפקוד של S1PRs.

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ  במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי BRET למדידה בזמן אמת של הפעלת חלבון G בתאי HEK293 חיים על גירוי ליגנד קולטן מצומד לחלבון G. כאן, קולטן β2-אדרנרגי וקולטן קנבינואיד מסוג 1 משמשים כדוגמאות להדגמת היעילות של חיישנים עבור מספר תת-סוגים של חלבון G ועל פני GPCRs שונים.

חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

למדו שיטת השלמה מבנית לניטור אינטראקציות GPCR-β-arrestin בזמן אמת בתאים חיים. שיטה זו מאפשרת גילוי תרופות חדשות עם תופעות לוואי מינימליות ומסייעת בחקר פרמקולוגיה של קולטנים.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

גלה סרטונים נוספים