Name: קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למד כיצד לכמת קואנזים A בתאים וברקמות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור שינויים מטבוליים ומחלות נוירודגנרטיביות הקשורות לנתיב הביוסינתזה של CoA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים במימון עבור מחקר ממומן שסופק על ידי CoA Therapeutics, Inc., חברת בת של ברידג LLC, המכונים הלאומיים להענקת מענק בריאות GM34496, ו לבנון האמריקאית הקשורים ארגוני צדקה.

נוהל בעלי החיים המכונה בפרוטוקול זה בוצע על פי פרוטוקולים 323 ו 556 ואישר במפורש על ידי בית החולים סנט ג'וד מחקר לילדים ועדת השימוש בעלי חיים מוסדיים.
1. הכנת פתרונות
הערה: השתמש במים אולטרה-טהורים עבור כל הפתרונות וכאשר נקבע בהליכים.
<ol><li>הכינו 1 מ"מ אשלגן הידרוקסיד (KOH) במים.</li>
	<li>להכין 0.25 M KOH במים.</li>
	<li>להכין 1 M טריזמה-HCl במים ולהתאים ל-pH 8.0.</li>
	<li>להכין 100 mM מונורומואובאיאן (mBBr) ב acetonitrile (אופטימה כיתה). פתרונות מניות של mBBr הם יציבים ב-20 ° c במשך חודשים רבים בתנאי שהם נשמרים בחושך כמו חשיפה לאור יכול photolyze המונרומביאן כדי בלטן26.</li>
	<li>הכנת מאגר כביסה עבור מיצוי השלב המלא (SPE): 50% מתנול (אופטימה כיתה) + 2% חומצה אצטית.</li>
	<li>הכן מאגר הימנעות עבור עמודת SPE: 95% אתנול (כיתה) המכילה 50 מילימטר אמוניום.</li>
</ol>2. הכנת תקן תעודת CoA-בימרו
<ol><li>רכוש תקן CoA באיכות גבוהה ממקור בעל מוניטין (למשל, אוואנטי שומנים קוטביים, Inc.).</li>
	<li>הכנת פתרון מלאי ריכוז גבוה של CoA ב 20 מ"מ טריס, pH 8. כמות תעודת המקוריות במלאי הריכוז הגבוה נקבעת או אושרה על-ידי spectrophotometric בינס ב-λ 260 nm (Ɛ = 16,800 M-1∙ ס"מ-1). הוסף את העודף הטוחנת של 4 מב2 של mBBr; ערבולת. בגובה של 10 ס מ לדוגמה, ל-CoA של 10 מ"מ במאגר, הוסף 40 mM mBBr. ה-mBBr נוסף לעודף כדי להבטיח שכל תעודת המקוריות תהיה ללעג.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר עבור 4 שעות בחושך בלי לרעוד כדי לדון את תעודת המקוריות עם mBBr. mbbr מגיב עם הקבוצה תיול של תעודת המקוריות, והוא הטמפרטורה התלויה ב-pH ו-27. תוספת של mBBr ממיר את תעודת המקוריות לפלורסנט מסיסים במים (או לספיגה אולטרה סגולה) CoA-בימרו (CoA-בימרו; איור 2).</li>
	<li>הוסף 100 μL חומצה אצטית ומערבולת על גבוה עבור 10 s כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 15 דקות כדי להסיר את כל הזרז.</li>
	<li>נקה את הסופרנטנט באמצעות עמודת ה-SPE כדי להסיר את ה-mBBr שאינו מגיב (המתואר להלן). הסינון והצנטריפוגה של האלוטה אינו נחוץ לאחר ניקוי העמודה SPE (סעיף 5.8).</li>
	<li>אסוף את החומק מעמודת ה-SPE המכילה את ה-CoA-בימרו בצינור טרום שקילה, יבש תחת גז חנקן, לשקול ולבנות עקומת כיול סטנדרטית עם כמויות ידועות של CoA-בימרו.<ol>
<li>בדוק את תקן ה-CoA-בימרו לטוהר באמצעות האבחון (ראה להלן) עם זיהוי ספיגת בשני λ 260 (adenine moiety) ו λ 393 (בליטות moiety) וצירופי מקרים של שתי הפסגות ב כרומאטוגרם.</li>
		<li>לאשר את כמות התקן CoA-בימרו במלאי ריכוז גבוה באמצעות λ 260 nm (Ɛ = 16,800 M-1∙ ס"מ-1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>רשום את זמן ההחזקה לזיהוי תעודת הזהות של CoA-בימרו בדגימות נסיוניות באמצעות התקן CoA-בימרו.</li>
	<li>אחסון מלאי הריכוז הגבוה של תקן ה-CoA-בימל מוגן מפני אור ומאוחסן ב-20 ° c עד 2 שנים. . הימנע מלהפשיר ולקפוא מחדש</li>
</ol>3. הוצאה והוצאת תעודת מקוריות בתאים מתורבתים
<ol><li>הקציר תאים מחסיד בתרבות כאשר מתקרבים צפיפויות subconfluent מאוחר. לדוגמה, התאים האנושיים HepG2/C3A גדלים לצפיפות של 6-8 x 106, או Hek 293t תאים גדלים לצפיפות של ~ 1.3 x 107 לכל 100 מ"מ מנה.<ol>
<li>השתמש בתרביות כפולות או טרילקאט באופן שגרתי עבור דטרמינציות CoA. מודטה מנות תרבות נפרדות במקביל לתרביות תאים לדוגמה כדי לקבוע מספר תא בר קיימא. חשב את כמות ה-CoA ל-106-10 תאים לאחר הכשלי טיהור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>. מוריד את מדיום התרבות ממנה במהירות לשטוף את התאים על הצלחת עם הקרח קר פוספט מלוחים מאגור (PBS) כדי להסיר את כל המדיום שרידי ומכה את הPBS את הצלחת. במהירות לשטוף את התאים עם מים קרים קרח כדי להסיר PBS שיורית ולהשקות את המים ממנה במהירות. הימנעו מהפרעה לתאים החסיד בעת הוספת ה-PBS או המים.</li>
	<li>הוסיפו 1 מ ל של מים קרים בקרח לצלחת התרבות. לגרד תאים לתוך המים הקרים בצלחת ולהעביר את ההשעיה התא לצינור בדיקת זכוכית המכילה 400 μL של 0.25 M KOH ו 1.5 mL של מים.<ol>
<li>לערבב את ההשעיה במרץ על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s. ואז לכסות היטב עם הסרט פרפין ו דגירה ב 55 ° c עבור 1 h בלי לרעוד באמבט מים. ה-pH של המדגם צריך להיות ≥ 12. PH גבוהה חשוב הhydrolyze תעודת המקוריות והוא יכול להיות מותאם עם הרבה יותר מאשר בתוספת של KOH במידת הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תאים הקציר תרבותי גדל ההשעיה על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה: 136 x g עבור 6 דקות ב 4 ° c. שטוף פעם אחת עם הקרח קר PBS, ואז לשטוף בקצרה שוב עם מים קרים, ולבסוף להשעות מחדש 2.5 mL של מים קרים פלוס 400 μL 0.25 M KOH. מערבבים במרץ ו-דגירה ב 55 ° צ' כפי שמתואר לעיל.</li>
	<li>הוסף 160 μL של 1 M טריזמה-HCl ו 10 μL של 100 mM mBBr ו מערבבים על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s. זה מביא את ה-pH כ 8 כדי לתמוך בתגובת mBBr עם CoA חינם. לכסות ולטשטש דגימות בטמפרטורת החדר עבור 2 h בחושך עבור mbbr להגיב עם תיול של תעודת המקוריות.</li>
	<li>הוסף 100 μL של חומצה אצטית לערבב על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s כדי לעצור את התגובה</li>
	<li>צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 15 דקות כדי להסיר שרידים של תאים זירז.</li>
	<li>הסר ושמור supernatant במבחנה זכוכית לניקוי העמודה SPE המתואר להלן.</li>
</ol>4. הוצאה והוצאת תעודת מקוריות ברקמות
<ol><li>לנתח את החלקים רקמת החיות, כ 0.5 ס"מ קוטר או קטן יותר, ו למחוק בקצרה (1-2 s) על נייר סופג ולאחר מכן הקפאת הקפאה בחנקן נוזלי ולאחסן ב-80 ° צ' עד העיבוד. תעודת מקוריות ברקמות היא הידרוליזה או המרה ל-thioester אם לא הבזק קפוא. שלב זה חשוב לקבל את התשואה המירבית של תעודת המקוריות ברקמות.</li>
	<li>שוקלים חתיכות רקמה קפואה (5 – 60 mg) במהירות לפני תחילת הניתוח, ולהקליט את המשקל עבור כל מדגם. הגדרה זו של משקל רטוב משמשת לחישוב תוכן ה-CoA בעקבות טיהור השימוש באמצעות המאמר. להימנע מוחלטת ההפשרה של חתיכות הרקמה.</li>
	<li>הוסף 2 מ מ של 1 מ"מ KOH לצינור בדיקת זכוכית (g., 13 מ"מ x 100 מ"מ חד פעמי) המיועד להוספה של שיבוש בדיקה ורקמות עם הומוגניצר רוטור. . תשאיר את השפופרת על הקרח עד השימוש הדבר נעשה על מנת להבטיח שדגימות הומוגניים בטמפרטורה קרה ותעודת המקוריות לא תיהרס בשל החום שנוצר במהלך הומוגון.</li>
	<li>העברה והומומטר רקמות (30 – 40 mg) בצינור בדיקת זכוכית (המכיל קר 1 mM KOH) עבור 30 s. להימנע להשלים את החלקה של הרקמה.</li>
	<li>הוסף 500 μL של 0.25 M KOH; ומערבולת על גבוה 10 s ולשמור על הקרח עד כל הדגימות הם הומוגניים. זה יביא את ה-pH של המדגם מעל 12 כדי hydrolyze תעודת המקוריות כדי להניב תעודת מקוריות (CoA חינם והידרוליזה תעודת מקוריות).</li>
	<li>מודטה דגימות ב 55 ° c עבור 2 h באמבט מים מבלי לרעוד כדי לתמוך הידרוליזה.</li>
	<li>הוסף 150 μL של 1 M טריזמה-HCl ו 10 μL של 100 mM mBBr; ערבולת בגובה של 10 שניות זה מביא את ה-pH כדי 8 כדי לתמוך בתגובת mBBr עם תעודת מקוריות בחינם.</li>
	<li>מודטה דגימות בטמפרטורת החדר עבור 2 בחושך כדי להבטיח את כל תעודת המקוריות הוא ללעג עם mBBr.</li>
	<li>הוסף 100 μL של חומצה אצטית ומערבולת על גבוה עבור 10 s כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 15 דקות כדי גלולה גרם להריסות התאים.</li>
	<li>הסר ושמור supernatant במבחנה זכוכית לניקוי העמודה SPE (המתואר להלן).</li>
</ol>5. דגימת נקיון עם עמודת מיצוי הפאזה (SPE)
<ol><li>בטמפרטורת החדר, משקל כל חד פעמי 2-(2-pyridyl)-אתיל סיליקה ג'ל עמודה (1 mL גודל) עם 1 mL של מאגר לשטוף כדי להבטיח כי הקבוצה הפונקציונלית pyridyl הוא protonated ו יפעל כמו anion מחליף. 2-(2-pyridyl)-אתיל סיליקה ג'ל הוא מחליף חלש האניב שהוא אידיאלי עבור CoA-בימרו ב pH בסיסי. 2-(2-pyridyl)-אתיל סיליקה ג'ל יש pKa של 6 ו משחררזציה נעשה pH ≥ 7.</li>
	<li>הוסף לדוגמה supernatant (שלב 4.11) לטור ולאסוף משחרלי.</li>
	<li>שטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ ל של שטיפת מאגר כדי להסיר כל מינים שלא נשמרו.</li>
	<li>שטוף עמודה פעם אחת עם 1 מ ל של מים.</li>
	<li>לשטוף את הטור פעמיים עם 1 מ ל של מאגר האלוטור לתוך צינור בדיקת זכוכית נפרדת (12 מ"מ x 75 מ"מ) כדי לאסוף את תעודת המקוריות-בימרו.</li>
	<li>בדיקת תעודת המקוריות בתוך הצינור מתחת לגז חנקן עד יובש. המדגם היבש יציב בטמפרטורת החדר עד לשימוש נוסף. לאטום ולכסות לחלוטין את הצינור ואת החנות.</li>
	<li>כאשר מוכן לניתוח האנליזה, להשעות מחדש את המדגם 300 μL של מים ומערבבים במרץ על ידי מערבולת על גבוה עבור 10 s.</li>
	<li>העברת דגימה מחדש למסנן צנטריפוגה שפופרת (0.22 יקרומטר תאית אצטט, 2 mL גודל) ו צנטריפוגה ב 5,000 x g עבור 10 דקות כדי להסיר את כל הזרז.</li>
	<li>העבר דגימה מסוננת לבקבוקון זכוכית המתאים להזרקה.</li>
</ol>6. היקף הטיהור והמדידה של CoA-בימרו
<ol><li>. הכן מאגרים מאגר A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; מאגר ב: בעלי משקל (אופטימה כיתה).</li>
	<li>הכוח את מערכת המערכת. הערה: מערכת המבחנות במעבדה שלנו היא ווטרס e2695 הפרדות מודול מצויד 2489 אולטרה סגול-גלוי (UV-Vis) בספיגת גלאי ו 2475 מזהה פלואורסצנטית נשלט עם העצמת 3 תוכנה. במערכת יש גם מזרק אוטומטי לדוגמה.</li>
	<li>להזריק כל מדגם (למשל, 20 μl) עבור הפרדה על סי18 תאומים, 3 יקרומטר 100 Å, 4.6 mm x 150 mm עמודה באמצעות התוכנית בטבלה 1 עם קצב זרימה של 0.5 mL/min. טמפרטורת הטור היא 25 ° c. מדוד את ספיגת גלאי UV/גלוי ב λ 393 nm, וזיהוי פלורסנט ב λex = 393 nm, λem = 470 nm. זמן השמירה נקבע על-ידי הפעלת עקומה סטנדרטית של CoA-בימרו לפני כל ערכת דגימות.</li>
	<li>הקלט את האזור תחת השיא של תעודת המקוריות של CoA-בימל לכל דוגמה, והשווה עם העקומה הסטנדרטית לחישוב pmol של CoA-בימרו על העמודה ' בדיקת המידע '. העיקול הרגיל של מבנה תעודת המקוריות משמש לדגימות רקמה, והעקומה הסטנדרטית של CoA-בימרו משמשת לדגימות של תרבות הרקמה.</li>
	<li>כאשר ערכי תעודת המקוריות מייצגים את תעודת המקוריות הכוללת עבור כל דוגמה, מנרמל את מספר התאים הפעילים עבור דגימות התרבות, או mg משקל רטוב עבור דגימות רקמה (איור 6). לחלופין, חשב את ערכי ה-CoA הכוללת לאחר נורמליזציה ל-DNA או לתוכן חלבונים עבור כל דוגמה. DNA או תוכן החלבון ניתן לקבוע בנפרד באמצעות מדגם ali, כי יוסרו במהלך ההכנה לדוגמה לפני בנוסף KOH.</li>
</ol>

<ol><li>Abiko, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbiko%2C+Y+%22Metabolic+Pathways%22">Metabolic Pathways</a>. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).</li>
<li>Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+A%3A+Back+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Coenzyme A: Back in action.</a> Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).</li>
<li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+A+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme A biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).</li>
<li>Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate-limiting+step+and+control+of+coenzyme+A+synthesis+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle.</a> Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).</li>
<li>Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inborn+errors+of+coenzyme+A+metabolism+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pantothenate+kinase+gene+%28PANK2%29+is+defective+in+Hallervorden-Spatz+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome.</a> Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).</li>
<li>Dusi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequence+reveals+mutations+in+CoA+synthase+as+a+cause+of+neurodegeneration+with+brain+iron+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation.</a> American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).</li>
<li>Dansie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+pantothenate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the pantothenate kinases.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).</li>
<li>Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+kinase+1+is+required+to+support+the+metabolic+transition+from+the+fed+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state.</a> PLoS ONE. 5, 11107(2015).</li>
<li>Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pank1+deletion+in+leptin-deficient+mice+reduces+hyperglycaemia+and+hyperinsulinaemia+and+modifies+global+metabolism+without+affecting+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance.</a> Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).</li>
<li>Israel, B. C., Smith, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+ingestion+on+pantothenate+and+CoA+status+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats.</a> The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).</li>
<li>Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+deletion+of+pantothenate+kinases+1+and+2+reveals+the+key+roles+for+CoA+in+postnatal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism.</a> PLoS One. 7, 40871(2012).</li>
<li>Corbin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+coenzyme+A+reduces+skeletal+muscle+performance+and+strength+in+mice+overexpressing+human+PANK2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).</li>
<li>Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Nudt7+decreases+bile+acid+levels+and+peroxisomal+fatty+acid+oxidation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver.</a> Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).</li>
<li>Shumar, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neuron-specific+degradation+of+Coenzyme+A+models+pantothenate+kinase-associated+neurodegeneration+by+reducing+motor+coordination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice.</a> PLoS ONE. 10, 0130013(2015).</li>
<li>Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+a+genetic+deficiency+in+pantothenate+kinase+1+using+phosphopantothenate+replacement+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).</li>
<li>Sharma, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+therapeutic+approach+to+pantothenate+kinase+associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration.</a> Nature Communications. 9, 4399(2018).</li>
<li>Alvarez-Cordoba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantothenate+Rescues+Iron+Accumulation+in+Pantothenate+Kinase-Associated+Neurodegeneration+Depending+on+the+Type+of+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation.</a> Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+neuronal+models+of+PANK2-associated+neurodegeneration+reveal+mitochondrial+dysfunction+contributing+to+early+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease.</a> PLoS One. 12, 0184104(2017).</li>
<li>Di Meo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetyl-4%27-phosphopantetheine+is+stable+in+serum+and+prevents+phenotypes+induced+by+pantothenate+kinase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency.</a> Scientific Reports. 7, 11260(2017).</li>
<li>Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+missing+link%3A+a+single+unifying+mechanism+for+diabetic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+Supplements%22%5BJournal%5D)">The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications.</a> Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).</li>
<li>Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+CoA+and+CoA+derivatives+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples.</a> Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).</li>
<li>Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+Detection+of+Tissue+Coash+and+Long-Chain+Acyl-Coa+by+Reversed-Phase+High-Performance+Liquid-Chromatography+after+Precolumn+Derivatization+with+Monobromobimane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane.</a> Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).</li>
<li>Shimada, K., Mitamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+Thiol-Containing+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of Thiol-Containing Compounds.</a> Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).</li>
<li>Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+isolation+procedure+for+short-%2C+medium-%2C+and+long-chain+acyl-coenzyme+A+esters+from+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue.</a> Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).</li>
<li>Newton, G. L., Fahey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+biothiols+by+bromobimane+labeling+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography.</a> Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).</li>
<li>Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimanes+.17.+%28Haloalkyl%29-1%2C5-Diazabicyclo%5B3.3.0%5DOctadienediones+%28Halo-9%2C10-Dioxabimanes%29+-+Reactivity+toward+the+Tripeptide+Thiol%2C+Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione.</a> Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).</li>
<li>Zhang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+knockout+of+pantothenate+kinase+reveals+the+metabolic+and+genetic+program+responsible+for+hepatic+coenzyme+A+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis.</a> Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).</li>
<li>Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toyoda+A%2CChohnan+S.+Coenzyme+A+and+its+thioester+pools+in+fasted+and+fed+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).</li>
<li>Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-performance+liquid+chromatography+determination+of+coenzyme+A%2C+dephospho-coenzyme+A%2C+and+acetyl-coenzyme+A+in+normal+and+pantothenic+acid-deficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats.</a> Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).</li>
<li>Chohnan, S., Takamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+micromethod+for+measurement+of+CoASH+and+its+use+in+measuring+the+intracellular+levles+of+CoASH+and+short+chain+acyl-CoAs+in+Escherichia+coli+K12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).</li>
</ol>

MWF, CS ו-SJ כתב את הנייר, MWF ו CS סיפק את הנתונים והאיורים, COR עיצב את הניסויים וביקורתית ביקורת על כתב היד. SJ ו-COR הם ממציאים על יישום פטנטים ממתינים (PCT/US17/39037) "מולקולה קטנה של מודולים של פנטסים" שנערך על ידי בית החולים סנט ג'וד ילדים מחקר המכסה את מתחם PZ-2891 מופנה במאמר זה.

כאן אנו מדגימים הליך אמין, צעד אחר צעד כדי לכמת תעודת מקוריות בתאים ורקמות בעלי חיים עם מגוון רחב של זיהוי ליניארי, כי הוא נגיש במעבדות רבות כי יש בדיקות עם ספיגת או מזהה הפלט הפלואורסצנטית. לחילופין, ספקטרומטר מסה היא טכניקה נפוצה להערכת תעודת המקוריות ותעודת המקוריות, אך אינה זמינה באופן נרחב בשל עלות המכשור והידע הדרוש לפיתוח מתודולוגיה ופרשנות של נתונים. Isotopically התווית CoA המתאימה לשימוש כתקן פנימי לקוונפיקציה של תעודת מקוריות בחינם בספקטרומטר המסה אינה זמינה מבחינה מסחרית, ותעודת מקוריות בחינם אינה מזוהה על-ידי...

Co A (CoA) הוא קופקטור חיוני בכל האורגניזמים החיים, והוא מסונתז מחומצה פנטותימית, המכונה גם פנטוידאט (מלח החומצה הפנטותית) או ויטמין B5. CoA הוא המוביל התאיים העיקרי של חומצות אורגניות, כולל חומצות שרשרת קצרות כגון אצטט ו סוזיטה, הענף חומצות שרשרת כגון propionate ו מתילמאלonate, חומצות שומן ארוכות כגון palmitate והרדוף, חומצות שומן מאוד ארוך שרשרת כגון חומצות שומן בלתי רוויות, ו xenobiotics כגון חומצה ולפרואית. החומצה האורגנית יוצרת הצמדה מבחינה דקדוקית באמצעות CoA כדי לאפשר את השימוש בה כמצע ביותר מ 100 תגובות בחילוף החומרים1. תעודת המקוריות הן גם מחוקקים אלוסטרוקים ומפעילים מפעילי הרכב. כעת מוערך2 כי הספק תעודת המקוריות של הסלולר מוסדר3,4; לפיכך, ניתן להגביל את זמינות ה-CoA ושליקויים בתעודת המקוריות עלולים להיות קטסטרופליים, כפי שניתן למשל בהפרעות גנטיות שעברו בירושה, המשפיעים על תעודת המקוריות של CoA5. פנטופיפיאט קינאז מזרז את הצעד הראשון בביוסינתזה של CoA (איור 1) ופנטופיפיאט קינאז, שנקרא pkan, נגרמת על ידי מוטציות ב- PANK2 gene6. CoA סינתאז, מקודד על ידי הגן Coasyn , מזרז את שני השלבים האחרונים בביוסינתזה CoA (איור 1) ו Coasy חלבון הקשורים נוירוניוון, נקרא copan, נגרמת על ידי מוטציה ב- coasyn גן7. הן PKAN ו CoPAN עוברות בירושה מחלות ניווניות הקשורים הצטברות ברזל במוח וליקויים CoA באופן בלתי מידי הפתווגיות המחלה.
רמות הסלולר של תעודת המקוריות משתנות בין הרקמות8 והמקוריות הכוללות יכולות להגדיל או להצטמצם תחת מגוון של מצבים פיזיולוגיים, פתולוגיים ופרמקלוגיים. תעודת הכבד מגדילה במהלך מיתוג הדלק מתוך הפדרלילמצבהבית, ורמות coa של הכבד גבוהות באופן חריג בעכברים שמנים לפטין לקויה10. תעודת הכבד מקטינה בתגובה בליעה אתנול כרונית11. רמות CoA של המוח במודל העכבר Pank2 מדוכאים במהלך תקופת הזמן הקצוב, אך מאוחר יותר בתוכן תעודת המקוריות של המוח בשלב מבוגר מקבילה לרמות מסוג פראי, המציינות תגובת CoA מסתגלת במהלך הפיתוח12. מניפולציה של תוכן תעודת הרקמה על ידי טרנסגנזה או שיטות משלוח גנטי משפיע על פונקציות מטבולית ועצביים13,14,15. פיתוח טרום קליני של טיפולים פוטנציאליים pkan או copan כולל תא או מדידות תעודת הרקמה כאינדיקטורים של יעילות16,17,18,19,20 . הערכה של כל התנאים הללו וההשלכות המטבולית או הפונקציונליות שלהם מחייבת שיטה כמותית למדידה של תעודת המקוריות הכוללת.
שיטת מדידה מדויקת ואמינה למדידת תעודת מקוריות בדגימות ביולוגיות היא אתגר טכני במעבדות רבות. למרבה הצער, אין בדיקה זמינים כדי להעריך או לכמת CoA או CoA thioesters בתאים שלמים, למרות האנלוגיות של תעודת מקוריות הטבע השתמשו באופן נרחב כמו בבדיקות מכניסטיות במחקרים של אסתר מקוריות ניצול אנזימים21. ההמרה של תעודת המקוריות, עם הmoiety הסולפקסיל (-SH) ללא תשלום, לתעודת המקוריות (או להיפך) מהירה בתאים או ברקמות בעלי חיים במהלך העברה לסביבה שונה ובמהלך הפירוק התאים. מספר רב של מערכות הפעלה של acyl-CoA ו-acyl-CoA מוחק בתאים מתווך בין המרות בתוך בריכת ה-CoA, ואנזימים נוספים המשתמשים בתעודת המקוריות בחומרים מעורבבים נשארים פעילים בדגימות ביולוגיות עד לאחר התניית על ידי כימיה או פיזית אומר. מחוץ לטעינה של acyl-קבוצות מתוך CoA ל קרניטין על ידי העברת התקן הוא דוגמה אחת בתוך רשת של תגובות שיכולות לשנות את התפלגות תעודת המקוריות/coa. ניתן להשתמש במשדרים רדיואקטיביים כדי למדוד שיעורי סינתזה של CoA בתאים. שיטות נוכחיות למדידת נגזרות CoA ו-CoA בדגימות ביולוגיות נבדקו22 וכוללות מצמידים spectrophotometric מגמטיים, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה ופרוצדורות מבוססות-ספקטרומטר מסה. עם זאת, שיטות אלה מתמקדות לרוב במינים מולקולריים מסוימים של CoA ועיוורים לווריאציה של בריכת ה-CoA הכוללת. מצמידים אנזימטיים באופן כללי דורשים כמויות גדולות יותר של חומר קלט בשל רגישויות לזיהוי נמוך ויש להם מגוון מוגבל של יניאריות.
המעבדה שלנו פיתחה הליך אמין לקוונפיקציה של תעודת מקוריות בתאים מתורבתים ורקמות בעלי חיים. האסטרטגיה כוללת הידרוליזה של כל תעודת המקוריות כדי להניב רק תעודת מקוריות במהלך הכנת המדגם, במקום לבצע מאמצים לשמור ולנתח את כל הספקטרום של מינים CoA. ההליך הוא אוסף של שיטות שפורסמו בנפרד לקראת הכנה לדוגמא, תעודת זהות, טיהור וזיהוי בעקבות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות), וכימות של תעודת המקוריות על ידי ספיגת המידע או זיהוי של קרינה פלואורסצנטית23,24,25. דטרמינציות ה-CoA המתקבלות באמצעות הליך זה אפשרו את הבנתנו את רגולציה של תעודת המקוריות ואת פיתוח הגישה הטיפולית לטיפול בליקויים בתעודת המקוריות.

<table><tbody><tr><td>2-(2-פירידיל)-אתיל סיליקה ג'ל SPE עמוד SPE</td><td>Millipore-Sigma</td><td>54127-U</td><td></td></tr><tr><td>קו-אנזים A</td><td>אוונטי קוטב ליפידים</td><td>870700</td><td></td></tr><tr><td>Gemini C18 3 &mu; מ 100 וארינג; עמודת HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>monobromobimane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>M-1378</td><td></td></tr><tr><td>משבש רקמות בדיקה Omni</td><td>International</td><td>32750H</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>PowerGen 125 הומוגנייזר סטטור רוטור ממונע</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0530997</td><td></td></tr><tr><td>Spin-X מסנן צינור צנטריפוגה</td><td>CoStar</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Fisher</td><td>T395-1</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2475 גלאי פלואורסצנטי</td><td>Waters</td><td>2475</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2489 גלאי UV-Vis</td><td>Waters</td><td>2489</td><td></td></tr><tr><td>Waters e2695 מודול הפרדות</td><td>Waters</td><td>e2695</td><td></td></tr></tbody></table>

קוונפיקציה של קואנזים a בתאים ורקמות

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

המחקר המתעוררים חשף כי הספק הסלולר (CoA) האספקה יכול להיות מגביל עם השפעה מזיקה על צמיחה, חילוף החומרים והישרדות. מדידת תעודת המקוריות הסלולרית היא אתגר בשל השפע הנמוך יחסית וההמרה הדינמית של תעודת המקוריות לתעודת המקוריות, אשר בתורו, משתתפות בתגובות מטבוליות רבות. שיטה מתוארת כי מנווט באמצעות מלכודות פוטנציאליות במהלך הכנת המדגם כדי להניב בדיקות עם טווח ליניארי רחב של זיהוי המתאים לשימוש במעבדות ביו-רפואיים רבים.

שיטה מהירה ואמינה יחסית לאיתור תעודת המקוריות הכוללת בתאים וברקמות שפותחו על-ידי השימוש בשיטת ה-coa לסוכן פלורסנט באמצעות mBBr, ולאחר מכן מטהרת את תעודת הזהות של תעודת הזהות באמצעות היפוך הפאזה. עקומה סטנדרטית נוצרת לראשונה, כאשר הכמויות הידועות והגדלות של תקן ה-CoA-בימרו מוזרקים בנפרד והאזורים שמתחת לפסגות ב-CoA-בימרו כרומטוגרמות מותווים כפונקציה של תעודת המקוריות-בימרו (איור 4). תעודת המקוריות של CoA-בימרו מרבית ב-λ 393 nM ובפרופיל המערכת מציגה את זמן ההחזקה של תקן תעודת המקוריות בסי18 (<s...

שיטה זו מתארת הכנה לדוגמא מתאים מתורבתים ומרקמות בעלי חיים, מיצוי והלקות של הקוקוקון A בדגימות, ואחריו כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה לטיהור וכימות של קומית הלגלתית A על ידי ספיגה או גילוי של קרינה פלואורסצנטית.

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

קואנזים A, הנקרא CoA בקיצור, הוא גורם חשוב בחילוף החומרים התאי. מדידות כמותיות חושפות שינויים שקורים עם מצבי תזונה והורמונים במודלים של בעלי חיים. שיטה זו מכמתת את הכמות הכוללת של CoA הסלולר, כולל נגזרות CoA ו- CoA חינם, בשיטה פשוטה ואמינה.מספר סוגים של ניוון עצבי עם הצטברות ברזל במוח קשורים עם מוטציות בגנים של המסלול הביוסינתטי CoA. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת ביולוגית מאז כל האורגניזמים דורשים CoA להישרדות, צמיחה, ותפקוד. חוקר בפעם הראשונה עשוי להיאבק עם הצעדים הראשונים בהכנת מדגם, שם חשוב לשמור על הדגימות קר לחלוטין ולאחר מכן להעביר אותם במהירות אשלגן הידרוקסיד.להגביל את מספר הדגימות באצווה לפני העברה אשלגן הידרוקסידי, ולתרגל עם ההעברה לפני העבודה עם דגימות הניסוי. חוקרים רבים אינם מכירים מיצוי בשלב מוצק בהכנת דגימות ביולוגיות לניתוח ביוכימי מאוחר יותר. ראשית, דגירה צלחות תרבות טריליקט במקביל, שניים לניתוח ביוכימי ואחד לקביעת מספר תא קיימא.כאשר התרבות מתקרבת צפיפות תת מודע מאוחר, למשל, תאי HepG2/C3A האנושי גדל לצפיפות של שש עד שמונה פעמים 10 לשישה או HEK 293T תאים גדל לצפיפות של כ 1.3 פעמים 10 כדי שבעה לכל צלחת 100 מילימטר, לקצור את התאים חסידים בתרבות. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של מים קרים כקרח לאותה מנה תרבותית. מגרדים תאים למים הקרים בצלחת, ומעבירים את מתלי התא למבחנה מזכוכית המכילה 400 מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד 0.25 טוחן ו -1.5 מיליליטר מים כדי להביא את ה- pH מעל 12.מערבבים את ההשעיה במרץ על ידי מערבולת על גבוה במשך 10 שניות. ואז לכסות בחוזקה עם סרט פרפין, דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בלי לרעוד באמבט מים. לאחר מכן, להוסיף 160 microliters של פתרון אחד טוחן Trizma-hydrochloride ו 10 microliters של 100 מילימולאר mBBr.מערבבים על ידי מערבולת על גבוה במשך 10 שניות. זה מביא את ה-pH לשמונה בערך כדי לתמוך בתגובת mBBr עם CoA חינם. מכסים את הצינור עם סרט פרפין, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בחושך עבור mBBr להגיב עם thiol של CoA.לאחר שעתיים, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חומצה אצטית, ומערבבים על ידי מערבולת במשך 10 שניות כדי לעצור את התגובה. משקעים נוצרים בצינור. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g במשך 15 דקות.כדי להסיר את פסולת התאים המוזרזים, להעביר ולשמור את supernatant במבחנת זכוכית לניקוי עמוד החילוץ בשלב מוצק. לפני תחילת הניתוח, להוסיף שני מיליליטר של אשלגן הידרוקסיד מילימולרי אחד למבחנה זכוכית המיועדת להכנסת בדיקה שיבוש רקמות עם homogenizer רוטור-סטטור. שמור את הצינור על קרח עד השימוש.לשקול את חתיכות רקמה קפואה במהירות, ולתזמן את המשקל הרטוב עבור כל מדגם. מעבירים את הרקמה לצינור הזכוכית, ומעבירים את הרקמה להומוגניזציה למשך 30 שניות. הימנע הפשרה מלאה של הרקמה.מוסיפים 500 מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד 0.25 טוחן. מערבולת על גבוה במשך 10 שניות, ולשמור על קרח. זה מביא את ה- pH של המדגם מעל 12 כדי הידרוליזה thioesters CoA להניב CoA הכולל.מכסים את הצינור עם סרט פרפין. הכנת תאים מתורבתים והכנת רקמות הם הצעדים הקריטיים ביותר בהליך זה. חשוב להוסיף אשלגן הידרוקסיד גבוה במהירות כדי למנוע השפלה CoA.דגירה הדגימות ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעתיים באמבט מים מבלי לרעוד כדי לתמוך הידרוליזה. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של אחד טוחן Trizma-hydrochloride ו 10 microliters של 100 מילימולאר mBBr להביא את ה- pH על שמונה לתמיכה בתגובת mBBr עם CoA חינם. מערבולת על גבוה במשך 10 שניות.מכסים את הצינור עם סרט פרפין, ודגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים בחושך כדי להבטיח את כל CoA נגזר עם mBBr. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של חומצה אצטית, ומערבולת על גבוה במשך 10 שניות כדי לעצור את התגובה. צנטריפוגה ב 2, 000 פעמים g במשך 15 דקות כדי גלולה פסולת תאים זירז, ולהעביר את supernatant לתוך מבחנה זכוכית לניקוי עמוד החילוץ בשלב מוצק.בטמפרטורת החדר, לצייד כל עמוד ג'ל חד פעמי חד-מיליליטר 2-2-פירידל-אתיל סיליקה עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף כדי להבטיח כי הקבוצה הפונקציונלית פירידל הוא protonated ויתפקד כמחליף אניון. לאחר מכן, פיפטה על-טבעי מדגם על העמודה, ולאסוף את eluate. לשטוף את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף ופעם אחת עם מיליליטר אחד של מים כדי להסיר כל מינים נגועים.לאחר מכן, לתוך מבחנה זכוכית נפרדת, לשטוף את העמוד פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ אלוטיון כדי לאסוף את CoA-bimane. יבש את דגימת CoA-bimane בצינור תחת גז חנקן. לאטום, לכסות לחלוטין את הצינור, ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס.כאשר אתה מוכן לניתוח HPLC, יש למצות את הדגימה ב-300 מיקרוליטרים של מים, ולערבב במרץ על-ידי מערבולת גבוהה למשך 10 שניות. מעבירים את הדגימה המתווסת למסנן צינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה ב 5, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות כדי להסיר כל תריס. לאחר מכן, העבר את הדגימה המסוננת לבקבוקון זכוכית המתאים להזרקת HPLC.במחקר זה, פרופיל HPLC מייצג מציג את זמן השמירה של תקן CoA-bimane בעמודה C18 HPLC. כמויות הולכות וגדלות של תקן CoA-bimane הוזרקו בנפרד, ואת האזורים מתחת לפסגות הכרומטוגרמות CoA-bimane היו התווה כפונקציה של CoA-bimane קלט. העקומה הסטנדרטית שיקפה את עוצמת הספיגה של CoA-bimane באורך גל של 393 ננומטר.הפלואורסצנטיות של CoA-bimane באה לידי ביטוי גם באורך גל העירור של 393 ננומטר ואורך גל פליטה של 470 ננומטר. הפרדת HPLC עוקבת ופרופילי זיהוי אופייניים עבור כבד עכבר או תאי C3A מתורבתים אנושיים מסומנים כאן על ידי פסגות אדומות, עם זמן שמירה בין 11 ל -12 דקות באמצעות תוכנית האלוטיון. אם התגובה עם mBBr אינה מניבה תוצאות הניתנות לגילוי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את כמות Trizma-HCl כדי להוריד את ה- pH לשמונה בקירוב.ניתן לזהות מולקולות תאיות נוספות המכילות מותי סולף-הידרויל או תיואסטר כנגזרות בימאן. לדוגמה, ניתן לזהות גלוטתיון-בימאן בשיטת HPLC. טכניקה זו תאפשר לחוקרים אחרים לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של תפקוד לקוי של CoA הקשורים לחוסר איזון מטבולי, כגון מודלים של בעלי חיים של סוכרת מסוג 2.החוקרים צריכים להשתמש בציוד מגן אישי בעת עבודה עם ממיסים אורגניים המשמשים להפקת שלב מוצק.

quantification-of-coenzyme-a-in-cells-and-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים טכניקת כימות עבורCO2 המשתחרר במהלך חמצון המצע באמצעות 14מצעים בעלי תווית רדיו C. 14CO2 ששוחרר לכוד בתמיסה בסיסית ומכומת על ידי מונה נצנצים. חמצון של מצעים שונים משתנה בין רקמות ומשקף את המצב הפתופיזיולוגי של הרקמה.

בדיקת חמצון המצע בתאים בתרבית: בדיקת מבחנה לכימות חמצון המצע בתאים על ידי מדידת אותות רדיואקטיביים מ- CO2 לכוד

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה להערכת זמינות ביולוגית של ברזל במקורות מזון מורכבים. הטכניקה משלבת סימולציה של עיכול אנושי יחד עם ספיגת ברזל על ידי תאי Caco-2 ממוינים. היווצרות פריטין תוך תאי פועלת כסמן לספיגת ברזל תאי.

Caco-2 cell bioassay: שיטה חוץ גופית למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במקורות מזון מורכבים

רמות heme תוך-תאיות משתנות קשורות למחלות נפוצות כגון סרטן. לפיכך, יש צורך למדוד את רמות הביוסינתזה של הם בתאים מגוונים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ורגישה למדידה והשוואה של רמות סינתזת הם בתאים שונים.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

כאן אנו מראים טסיות אדם מבודדים יכולים לשמש נגיש vivo לשעבר מודל ללמוד עיבודים מטבוליים בתגובה במתחם שאני מעכב rotenone. גישה זו מעסיקה עקיבת איזוטופי וכימות ביחס ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה הנוזלית וניתן ליישם במגוון רחב של עיצובי מחקר.

ניתוח LC-MS של טסיות האדם כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם מיטוכונדריאלי

חמצון β חומצות שומן הוא מסלול מטבולי חיוני האחראי על הפקת אנרגיה בסוגי תאים רבים ושונים, כולל הפטוציטים. כאן אנו מתארים שיטה למדידת חמצון-β חומצות שומן בהפטוציטים ראשוניים שזה עתה בודדו באמצעות 14חומצה פלמיטית המסומנת כ-C.

מדידה של חומצת שומן β-חמצון בהשעיה של הפטוציטים עכברים מבודדים טריים

פרוטוקול זה מתאר בדיקה השוואתית, תוך שימוש בפעילויות מורכבות מיטוכונדריאליות CI+CIII ו-CII+CIII בנוכחות או בהיעדר Na+, כדי לחקור את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית.

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 לזמינות ביולוגית של ברזל (Fe) מייצגת גישה חסכונית ורב-תכליתית להערכת הזמינות הביולוגית של Fe ממזונות, מוצרי מזון, תוספי מזון, ארוחות ואפילו משטרי תזונה. הוא מאומת ביסודיות למחקרים בבני אדם, ומייצג את מצב האמנות למחקרים על זמינות ביולוגית של Fe.

הבדיקה הביולוגית של תאי Caco-2 למדידת זמינות ביולוגית של ברזל במזון

ספרואידים רב-תאיים של גידולים תלת-ממדיים הוכנו עם תאי אדנוקרצינומה של הריאה, פיברובלסטים ומונוציטים, ולאחר מכן בידוד של פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAFs) מהספרואידים האלה. CAFs מבודדים הושוו לפיברובלסטים רגילים כדי להעריך את בריאות המיטוכונדריה על-ידי חקירת הפוטנציאל הטרנס-ממברני של המיטוכונדריה, מיני חמצן תגובתי ופעילויות אנזימטיות.

הערכה של בריאות המיטוכונדריה בפיברובלסטים הקשורים לסרטן שבודדו מספרואידים של גידולי ריאה רב-תאיים תלת-ממדיים

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

פרוטוקול זה מפרט בדיקת מבחנה למדידת ספיגת שומנים תאיים בתאי אנדותל בעת גירוי עם אנלוגים פלואורסצנטיים BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16 של חומצות שומן רוויות ארוכות שרשרת וארוכות שרשרת מאוד. שיטה זו יעילה וניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, ומציעה גישה שימושית לחקר חילוף החומרים של השומנים.

כימות ספיגת חומצות שומן אנדותל באמצעות אנלוגים של חומצות שומן פלואורסצנטיות

למד כיצד לכמת קואנזים A בתאים וברקמות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה. שיטה זו מאפשרת למדענים לחקור שינויים מטבוליים ומחלות נוירודגנרטיביות הקשורות לנתיב הביוסינתזה של CoA.

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

גלה סרטונים נוספים