Name: סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: למדו את שיטת TRAP-seq לבידוד RNA מסוג תא ספציפי מהפטוציטים המתחדשים בכבד העכבר. השיטה מאפשרת ניתוח שינויי ביטוי גנים במהלך התחדשות הכבד וזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי המענקים הבאים: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW), ו P30-DK050306 (פיילוט מענק KJW).

<ol><li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Lee, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etiologies+of+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Etiologies of acute liver failure.</a> Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).</li>
<li>Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+of+hepatocellular+carcinoma+and+consequences+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Oncologist%22%5BJournal%5D)">The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment.</a> The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).</li>
<li>Jadlowiec, C. C., Taner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+transplantation%3A+Current+status+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver transplantation: Current status and challenges.</a> World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Science. 276 (5309), 60-66 (1997).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration+after+partial+hepatectomy%3A+critical+analysis+of+mechanistic+dilemmas%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas.</a> The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).</li>
<li>Grompe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fumarylacetoacetate+hydrolase+is+responsible+for+the+neonatal+hepatic+dysfunction+phenotype+of+lethal+albino+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice.</a> Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).</li>
<li>Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+for+somatic%2C+lifelong+manipulation+of+multiple+genes+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver.</a> Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).</li>
<li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-seq+identifies+cystine%2Fglutamate+antiporter+as+a+driver+of+recovery+from+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Agilent Technologies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Agilent+RNA+6000+Pico%3A+User+Manual%22">Agilent RNA 6000 Pico: User Manual</a>. , Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).</li>
<li>NEBNext. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBNext+Ultra+RNA+Library+Prep+Kit+for+Illumina%3A+User+Manual%22">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual</a>. , Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).</li>
<li>NanoDrop. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222000%2F2000c+Spectrophotomerter%3A+User+Manual%22">2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual</a>. , Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+translational+profiling+in+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cell-specific translational profiling in acute kidney injury.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).</li>
<li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glutathione+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of glutathione synthesis.</a> Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).</li>
<li>Wang, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+chromatin+architecture+of+the+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Zahm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+in+vivo+screen+to+identify+microRNA+epistasis+in+the+repopulating+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Stork, C., Zheng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Profiling+of+RNA-Protein+Interactions+Using+CLIP-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+antioxidant+pathway+activity+and+reserve+determine+toxicity+and+specificity+of+the+biliary+toxin+biliatresone+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish.</a> Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).</li>
<li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+spatial+reconstruction+reveals+global+division+of+labour+in+the+mammalian+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver.</a> Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).</li>
<li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+communication+regulates+human+liver+bud+development+from+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency.</a> Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).</li>
<li>Wang, Y. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+of+the+Pancreatic+Islets--a+Promise+Not+yet+Fulfilled%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled?</a> Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

מלכודת seq היא טכניקה עבור סוג תא ספציפי בידוד של תרגום mRNA באמצעות אפיזומים מתויג ומציג חלופה לגישות FACS, כפי שהוא מוגבל מגבלות כגון דרישות הזמן של FACS9. במקום זאת, המלכודת מאפשרת בידוד מהיר ויעיל של RNA ישירות מרקמות בצובר, ומסייע למנוע כל שינוי בביטוי הגנים. מלכודת seq מתאימה במיוחד לשימוש באכלוס מחדש של פה-/- הכבד של העכבר, כמו הרחבת hepatocyte לאחר ההסרה של nitisinone הוא אוטונומי התא ומאפשר ביטוי גנים פרופיל של קבוצת המשנה של hepatocyte עם משולב . הגנים הטרנסג וקטור ה...

כמו איבר חילוף החומרים העיקרי של בעלי חוליות, הכבד אחראי על הומאוסטזיס גלוקוז, סרום חלבון סינתזה, הפרשה חומצה מרה, ומטבוליזם xenoביוטי ודטוקסיפיקציה. הכבד בעל יכולת יוצאת דופן כדי לחדש את כימוכימה הפצועים בעת החשיפה לרעלים כדי למנוע כשל כבד מיידית1. עם זאת, כישלון של התחדשות יכול להתרחש בהגדרה של פרצטמול או אלכוהול צריכת יתר, אשר יכול להוביל לכשל כבד אקוטי2. יתר על כן, פגיעה בכבד כרונית נגרמת על ידי דלקת הפטיטיס ויראלי, מחלת כבד שומני, ו steatohepatitis יכול לגרום פיברוזיס בכבד, שחמת, ו סרטן hepatocellular3. הטיפול הרפואי היחיד הזמין עבור מחלת הכבד בשלב הסופי הוא השתלת אבל הוא מוגבל על ידי המחסור איברים, מניעת טיפול יעיל עבור כל המטופלים4. הבנה טובה יותר של תהליך ההחלמה לאחר פגיעה בכבד רעיל הוא אפוא חיוני לפיתוח של טיפולים לעורר התחדשות מספיק כדי להציל את תפקוד האיבר החולה.
המערכת הרחבה ביותר מודל שימושית לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת המעי חלקית במכרסמים, שבו חלק גדול של הכבד הוא resected כדי לעורר הרחבת hepatectomy מהירה5. עם זאת, כריתת הפפאציט חלקית לא לכידה התרחבות hepatectomy בעקבות פגיעה בכבד רעיל בשל היעדר חדירת תאים חיסוניים ונמק תא hepatectomy נצפו לעתים קרובות בקביעת פציעה חמורה בכבד בבני אדם6. מערכת מתאימה יותר כדי לדגמן צורה זו של התחדשות איברים הוא פה -/- עכבר, אשר חסר פונקציונלי fumarylacetoacetate (אח) נדרש עבור חילוף החומרים הנכון טירולה, מפתחת נזק כבד חמור המוביל למוות7. עכברים אלה יכולים להישמר במצב בריא ללא הגבלה על ידי טיפול עם התרופה nitisinone במים השתייה. לחילופין, ביטוי פה יכול להיות משוחזר על ידי המסירה הטרנסגנטית לקבוצת משנה של hepatocytes, אשר תרחיב לאכלס את הכבד על ידי הסרת nitisinone8.
כדי לפרופיל את השינויים בביטוי הגנים של אכלוס מחדש של hepatocytes, כלי כדי לבודד באופן ספציפי שכפול hepatocytes ב-פה-/- עכבר ללא זיהום של hepatocytes השכןנפגע וסוגי תאים אחרים נדרש. למרבה הצער, מיון תאים בסיוע בלתי מבוקר (FACS) של hepatocytes הוא קשה מאז (1) שבריאת האכלוס מחדש של hepatocytes מוביל להחלמה ירודה לאחר הכבד פרזיה, (2) שכפול hepatocytes הם מאוד משתנה בגודל, עושה בידוד של אוכלוסייה טהורה על ידי facs קשה, ו (3) את זמן ההליך מתוך זלוף הכבד כדי בידוד RNA הוא גדול מ 2 h, ולכן פרופילי ביטוי גנים עשויים לעבור שינויים מלאכותיים משמעותי לפני שנרכשו דגימות9.
לחילופין, הביטוי של אפימוטים-מתויג הריבוזומים במיוחד באכלוס מחדש של hepatocytes מאפשר הבידוד המהיר של באופן פעיל בתרגום mRNA כרוך על ידי הריבוזומים באמצעות טיהור אהדה מיד לאחר הקציר איברים, עם כבד בתפזורת רקמות כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבצע תרגום-ריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת)10 ולאחריה תפוקה גבוהה RNA-רצף (השמנה-seq), כדי לבודד במיוחד פרופיל mrna באכלוס מחדש של hepatocytes ב- אח-/- עכבר9. Coexpression של חלבון פלורסנט ירוק-מתויג חלבון ריבוזומלי (GFP: RPL10A) עם פה מאפשר טיהור אהדה של תרגום mRNA כרוך על ידי פוליזומים המכילים GFP: RPL10A. שיטה זו מונעת כל שלבי הדיסוציאציה של התאים, כגון מיזוג כבד כדי לבודד את האכלוס מחדש של המופיציטים. במקום זאת, היא משתמשת הליזה של רקמת איברים שלמים ונוגדנים לחלץ במהירות RNA במיוחד מתאי היעד. בסופו של דבר, בידוד שופע של mRNA באיכות גבוהה באמצעות השמנה-seq מאפשר יישומים במורד הזרם כגון ניתוח רצף לפרופיל השינוי הדינאמי של ביטוי הגנים במהלך תהליך האכלוס מחדש.

<table><tbody><tr><td>מטחנת רקמות 10 מ"ל, Potter-Elv, מצופה</td><td>DWK מדעי החיים (Wheaton)</td><td>358007</td><td></td></tr><tr><td>ערכת Absolutely RNA Miniprep Agilent</td><td></td><td>400800</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים נגד GFP</td><td>Memorial Sloan-Kettering נוגדן & Bioresource Core</td><td>GFP Ab #19C8 ו-GFP Ab #19F7</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין, ללא IgG, ללא פרוטאז</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, ללא EDTA קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>רוש</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>ציקלוהקסמיד</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>חומצה דאוקסיקולית, DOC</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2510</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז, דקסטרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד פטרי צלחות עם מכסה שקוף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x), סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, תמיסה 1 M, pH 7.3, דרגת ביולוגיה מולקולרית, אולטרה-טהור, תרמו מדעי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד, MgCl2&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר מדעי</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>VV-83061-00</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Poly(A) mRNA מודול בידוד מגנטי</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>E7490S</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הכנה לספריית NEBNext Ultra RNA עבור Illumina</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>E7530S</td><td></td></tr><tr><td>נונילפניל פוליאתילן גליקול, NP-40. IGEPAL CA-630</td><td>Millipore Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז, לא</td><td>אמביון</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>בוחש תקורה</td><td>DWK מדעי החיים (וויטון)</td><td>903475</td><td></td></tr><tr><td>מאגר PBS (פי 10), pH 7.4</td><td>אמביון</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>פירס חלבון רקומביננטי L, ביוטינילציה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>29997</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit & ריאגנטים</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase תמיסת טיהור</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNasin מעכבי ריבונוקלאז</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד, NaN3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט, NaHCO3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&middot; במעכב RNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2694</td><td></td></tr></tbody></table>

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

אוכלוסיית הכבד לאחר הפציעה היא תכונה קריטית של יונקים אשר מונע כשל איברים מיידיים ומוות לאחר חשיפת רעלים סביבתיים. הבנה עמוקה יותר של השינויים בביטוי הגנים המתרחשים במהלך האוכלוסיה יכולה לסייע בזיהוי מטרות טיפוליות כדי לקדם את שיקום תפקודי הכבד בקביעת הפציעות. עם זאת, שיטות לבודד במיוחד את האכלוס מחדש של hepatocytes מעוכבים על ידי חוסר של סמנים תא, מספרי תאים מוגבלים, ואת שבריאת התאים האלה. ההתפתחות של תרגום הריבוכמה הזיקה של טיהור (מלכודת ) הטכנולוגיהבשילוב עם פה-/- מודל העכבר כדי לשחזר את האוכלוסייה מחדש במסגרת של פגיעה בכבד מאפשר פרופיל ביטוי גנים של האכלוס מחדש הפטציטים. עם המלכודת, סוג תא ספציפי לתרגם mRNA הוא במהירות וביעילות מבודד. פיתחנו שיטה אשר משתמשת מלכודת עם אהדה מבוססת בידוד של תרגום mRNA מ hepatocytes כי באופן סלקטיבי לבטא את חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מתויג חלבון ריבוזומבית (RP), GFP: RPL10A. ההשמנה מפעילה את פרק הזמן הארוך הנדרש למיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית שיכולה לשנות את פרופיל ביטוי הגנים. יתר על כן, מאז רק האכלוס מחדש של hepatocytes לבטא GFP: RPL10A היתוך חלבון, mRNA המבודד הוא נטול זיהום של hepatocytes הפצועים שמסביב וסוגי תאים אחרים בכבד. MRNA מטוהר האהדה הוא באיכות גבוהה ומאפשר במורד הזרם PCR או התפוקה הגבוהה ניתוח מבוסס רצף של ביטוי גנים.

כדי לפרופיל ביטוי הגנים באכלוס מחדש של hepatocytes של פה -/- עכבר, gfp: Rpl10a fusion ו- פה transgenes מועברים בתוך הטרנספסון המכיל את הפלסטיק8 (וקטור המלכודת) לכבד על ידי הזרקת הידרודינמית(איור 1א). הסרת nitisinone גורמת לפציעה בכבד רעיל שיוצר לחץ בחירה עבור hepatocytes באופן בלתי נשכח לבטא את אח כ כדי לאכלס את הפצועים בתוך כימוא9. כתמים immunofluorescence ...

מתרגם הריבוכמה אהדה הזיקה (מלכודת) מאפשר בידוד מהיר ויעיל של סוג תא ספציפי לתרגם mRNA. כאן, אנו מדגימים שיטה המשלבת הזרקת זנב הידרודינמי במודל העכבר של אוכלוסיית הכבד והמלכודת כדי לבחון את פרופיל הביטוי של אכלוס מחדש של hepatocytes.

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

עם TRAP-seq, אנו יכולים לבודד את ה- RNA מסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes אכלוס מחדש בכבד פצוע כדי לנתח את השינויים ביטוי הגנים המתרחשים בתאים אלה. זה לא דורש שום צעדים כדי להסיר תאים לא רצויים מן הרקמה. ה- RNA הספציפי לסוג התא מבודד על ידי טיהור זיקה מילים שלם של איברים.טכניקה זו מסייעת לנו לקבוע כיצד תאים ספציפיים מגיבים לפציעות, אשר יכול לעזור לזהות אסטרטגיות חדשות או תרופות להילחם במחלות כבד. זה יכול לשמש כדי לזהות כיצד תאי הכבד מגיבים סוגים שונים של פציעות בכבד. נכון לעכשיו, יש מעט אפשרויות לפציעות כבד חמורות ושיטת זה יעזור לרמוז לנו על טיפולים חדשים.מקורה של שיטה זו במוח. בכבד, דמיינו שזה יכול לשמש כדי לבחון שינויים דינמיים במגוון סוגי תאים, hepatocytes, תאי צינור המרה, תאי קופפר, ותאי אנדותל שם כמה. מדגימה את ההליך תהיה אמבר וונג, סטודנטית לתואר שני והתלמידה שלי.כדי להתחיל, תן שימוש חוזר חרוזים מגנטיים על ידי צינורות עדינים. לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, להסיר את צינור microcentrifuge מהעמוד המגנטי ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS, ואחריו צינור למעלה ולמטה לשטוף את חרוזים.מניחים את הצינור בחזרה על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת כדי לאסוף את חרוזים ולהסיר את PBS. להכנת גם 16 מיקרוליטרים של חלבון ביוטינילציה L לחרוזים המגנטיים המתווסתים ושטופים ומוסיפים 1X PBS כדי להפוך את הנפח הסופי למיליליטר אחד, אם משתמשים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, או 1.5 מיליליטר, אם משתמשים בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר. הדגירה את חרוזים מגנטיים עם חלבון biotinylated L במשך 35 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב צינור.לאחר מכן, מניחים את הצינור על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant כדי לאסוף את החלבון L מצופה חרוזים. מוציאים את צינור המיקרוצנטריפוגה מהעמוד המגנטי ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS עם חיץ של 3%BSA, ואחריו צינורות עדינים לפחות חמש פעמים כדי לשטוף את קדילי החלבון מצופים L. שוב, מניחים את הצינור על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant כדי לאסוף את חרוזים מצופים.חזור על שטיפת BSA עוד ארבע פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוגרם נוגדנים לנוגדן GFP 19C8 ונוגדן GFP 19F7 כל אחד לתוך חרוזי החלבון מצופה L, והדגירה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס על מסובב צינור. כדי לאסוף את מטריצת הזיקה, מניחים את הצינור על המגנטי במשך יותר מדקה אחת ומסירים את העל-טבעי.קח את הצינור מהעמוד המגנטי ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ מלח נמוך. יש לשטוף בעדינות את מטריצת הזיקה ולחזור על שטיפת המאגר עם המלח הנמוך פעמיים נוספות. תוכלו להשתמש מחדש ב-200 מיקרוליטרים של מאגר מלח נמוך, כדי ליצור 200 מיקרוליטרים של מטריצת אהדה.ראשית, להגדיר את מטחנת הרקמות, כך צינורות זכוכית PTFE ניתן להציב על קרח במהלך הומוגניזציה. מלא ארבעה מיליליטר של חיץ תזה קרה לתוך צינורות הזכוכית PTFE. מניחים את הכבד על צלחת פטרי.השתמש בסכין כדי לבודד 200 עד 500 מיליגרם של חתיכות כבד ולעבור לתוך צינורות זכוכית PTFE. מניחים את רקמת הכבד הנותרת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש והקפאת פלאש בחנקן נוזלי. הומוגניזציה של הדגימות homogenizer מונחה מנוע, החל מ 300 סל"ד עבור לפחות חמש משיכות כדי לנתק hepatocytes ממבנה הכבד.מנמיך את צינור הזכוכית בכל פעם. מניעת aeration, אשר יכול לגרום denaturation חלבון, על ידי שמירה על העלי מתחת לפתרון. לאחר מכן, להעלות את המהירות ל 900 סל"ד כדי הומוגניזציה מלאה של רקמות הכבד לפחות 12 משיכות מלאות.מעבירים את ה-lysate לצינורות מסומנים ומצוננים מראש עם לא יותר ממיליליטר של ליט כל אחד. כדי להתחיל תמוגה גרעינית, צנטריפוגה הכבד lysate ב 2, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את העל טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה מצונן מראש חדש על קרח. הוסיפו 1/9 מהנפח העל-טבעי של 10%NP-40 לצינור המיקרוצנטריפוגה על הקרח וערבבו את הפתרון על ידי היפוך עדין של הצינור.סובבו במהירות את צינורות המיקרוצנטריפוגה עם מיני צנטריפוגה והוסיפו 1/9 מנפח הדגימה של 10%DOC. מערבבים על ידי היפוך עדין של צינורות המיקרוצנטריפוגה ומסובבים במהירות את צינורות המיקרוצנטריפוגה והדגירה על הקרח במשך חמש דקות. צנטריפוגה ליאזט גרעיני ב 20, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהעביר את העל טבעי צינורות מיקרוצנטריפוגה מצוננים מראש חדש על קרח.עבור כל צינור, להוציא 1% מהנפח הכולל של העל-טבעי כבקרה טרום אימונו-אימונpreציפציציה. מניחים את פקדי הקדם-אימונו-ציפציה על מסובב צינור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לדאוג במיוחד כדי לעכל בעדינות את מטריצת הזיקה על-ידי צינורות, ולאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטרים לכל דגימה.דגירה lysates בארבע מעלות צלזיוס לילה עם ערבוב עדין על מסובב צינור. כדי לבודד RNA, במהירות לסובב את הצינורות המכילים את lysates בצנטריפוגה מיני ולאסוף את חרוזים על ידי הנחת על המדף המגנטי לפחות דקה אחת. אסוף את העל-טבעי בצינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים.מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ מלח גבוה טרי לכל צינור, ואחריו צינורות עדינים לפחות חמש פעמים מבלי להציג בועות. לאסוף את חרוזים על לעמוד מגנטי על הקרח במשך יותר מדקה ולהסיר את supernatant. חזור על שלבי הכביסה ארבע פעמים נוספות.לאחר מכן, להסיר את צינורות microcentrifuge מהעמוד המגנטי מקום בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להתחמם. תן מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטרים של מאגר תיזה עם 0.7 מיקרוליטרים של בטא-מרפטואתנול כדי לשחרר רנ"א כבול ממטריצת הזיקה. מערבולת הצינורות למשך חמש שניות לפחות במהירות הגבוהה ביותר ומסתובבים במהירות למטה.לאחר מכן, הדגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי לפחות דקה אחת, ואז לאסוף את supernatant ולהמשיך מיד ניקוי RNA על פי פרוטוקול טיהור RNA בערכה. כדי להשיג איכות מרבית של ה- RNA המבודד, בצע את כל השלבים האופציונליים, כולל עיכול DNase וכל שלבי האלוטיון של RNA, כולל ההתחממות המוקדמת המומלצת של מאגר האלוטיון ל-60 מעלות צלזיוס.במחקר זה, היתוך GFP-L10A וטרנסגנס פה נמסרו במשותף בתוך וקטור מלכודת פלסמיד המכיל טרנספוזון לכבדים על ידי הזרקה הידרודינמית. הסרת nitisinone גרמה לפגיעה בכבד רעיל. כתמי שפעת חיסונית אישרו את הדו-דיכוי של חלבון ההיתוך FAH ו- GFP-L10A ואת ההפטוציטים המאכלסים מחדש לאחר שבועיים של אכלס מחדש את הכבד.דגימת ההפוגה ייצרה את התשואה הגבוהה ביותר של חלבון היתוך, שכן כל ההפטוציטים מבטאים GFP-L10A לאחר הזרקת AAV8-TBG-Cre. לעומת זאת, בקושי כל RNA היה מזוהה בפקדים מסוג פראי שלא היה להם את המשדר GFP-L10A, המציין את הליך TRAP הוא ספציפי מאוד ויש לו רקע נמוך. כאשר TRAP שימש על רקמת הכבד עובר התחדשות עם hepatocytes מתמר GFP-L10A, RNA באיכות גבוהה בשפע הושג.לעומת זאת, לא זוהה מעקב RNA באמצעות Bioanalyzer עבור מדגם הבקרה השלילית. ביטוי Gsta1 היה המושרה על ידי למעלה מעשרה פי עשרה בהחזרת hepatocytes לעומת hepatocytes התרדה, בעוד ערכי מחזור סף לא זוהה עם RNA מבודד TRAP מעכבר סוג הבר בשל היעדר RNA קלט. כאשר homogenizing הרקמה, הקפד להזיז את העלי לאט כדי למנוע aeration.לאחר בידוד ה- RNA, ניתן לבצע רצף תפוקה גבוהה או qPCR כדי לנתח ביטוי גנים. עם TRAP-seq, עכשיו יש לנו שיטה לבודד באופן ספציפי RNA מ אכלוס מחדש hepatocytes ולנתח את השינוי בביטוי גנים במהלך אכלוס הכבד. זה מאפשר לנו לזהות גנים שהשתנו במהלך תהליך זה ויעדים טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בפגיעה בכבד.Cycloheximide ו DTT, אשר נמצאים במספר מאגרים, שניהם רעילים. יש לאסוף ולהשליך פסולת בהתאם להנחיות המוסדיים.

cell-type-specific-gene-expression-profiling-in-the-mouse-liver

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

בtransfection vivo של DNA עירום על ידי מסירת גן הידרודינמית מציג גנים לתוך הרקמה של בעלי חיים עם תגובה דלקתית מינימאלית. כמויות מספיקות של מוצר גן נוצרות באופן שתפקוד הגן והרגולציה, כמו גם מבנה חלבון ותפקוד ניתן לנתח.

ביטוי חולף של חלבונים על ידי הידרודינמית ג&#39;ין משלוח בעכברים

אנו מציגים מערכת במבחנה עכבר עוברית erythroblast כבד תרבות שמנתחת את השלבים המוקדמים ומאוחרים של erythropoiesis מסוף השלבים. מערכת זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של גנים מסוימים בשלבי התפתחות שונים.

עכבר עוברי כבד מערכת התרבות לנתח פונקציות היעד ג&#39;ין בשלבים המוקדמים ומאוחרים של המסוף erythropoiesis

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את הביטוי של מגוון רחב של גנים ברמה המשובטת. RT-qPCR מתחיל מתא בודד מייצר תוצאות אמינות ביותר עם רגישות חזקה במשך מאות דגימות וגנים.

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה לייצור פרוסות כבד בר קיימא לחתוך מפני עכברים. Vivo דגימות רקמות לשעבר יכול להישמר תחת רקמת המעבדה התנאים התרבות במשך ימים מרובים, מתן מודל גמיש לבחון פתוביולוגיה בכבד.

מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד RNA מאזורים היסטולוגיים מוגדרים של רקמת כבד עכבר, המוטמעת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בטמפרטורת חיתוך אופטימלית באמצעות מיקרודיסקציה ללכידת לייזר, המאפשרת ניתוח ביטוי גנים ממוקד במורד הזרם.

מיקרודיסקציה בלייזר של רקמת כבד עכבר מקובעת בפרפורמלדהיד לניתוח RNA

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

למדו את שיטת TRAP-seq לבידוד RNA מסוג תא ספציפי מהפטוציטים המתחדשים בכבד העכבר. השיטה מאפשרת ניתוח שינויי ביטוי גנים במהלך התחדשות הכבד וזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות.

סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

גלה סרטונים נוספים