סוג תא-ביטוי גנים ספציפי ליצירת פרופיל בכבד העכבר

עם TRAP-seq, אנו יכולים לבודד את ה- RNA מסוגי תאים ספציפיים, כגון hepatocytes אכלוס מחדש בכבד פצוע כדי לנתח את השינויים ביטוי הגנים המתרחשים בתאים אלה. זה לא דורש שום צעדים כדי להסיר תאים לא רצויים מן הרקמה. ה- RNA הספציפי לסוג התא מבודד על ידי טיהור זיקה מילים שלם של איברים.

טכניקה זו מסייעת לנו לקבוע כיצד תאים ספציפיים מגיבים לפציעות, אשר יכול לעזור לזהות אסטרטגיות חדשות או תרופות להילחם במחלות כבד. זה יכול לשמש כדי לזהות כיצד תאי הכבד מגיבים סוגים שונים של פציעות בכבד. נכון לעכשיו, יש מעט אפשרויות לפציעות כבד חמורות ושיטת זה יעזור לרמוז לנו על טיפולים חדשים.

מקורה של שיטה זו במוח. בכבד, דמיינו שזה יכול לשמש כדי לבחון שינויים דינמיים במגוון סוגי תאים, hepatocytes, תאי צינור המרה, תאי קופפר, ותאי אנדותל שם כמה. מדגימה את ההליך תהיה אמבר וונג, סטודנטית לתואר שני והתלמידה שלי.

כדי להתחיל, תן שימוש חוזר חרוזים מגנטיים על ידי צינורות עדינים. לאסוף את חרוזים על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant. לאחר מכן, להסיר את צינור microcentrifuge מהעמוד המגנטי ולהוסיף מיליליטר אחד של PBS, ואחריו צינור למעלה ולמטה לשטוף את חרוזים.

מניחים את הצינור בחזרה על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת כדי לאסוף את חרוזים ולהסיר את PBS. להכנת גם 16 מיקרוליטרים של חלבון ביוטינילציה L לחרוזים המגנטיים המתווסתים ושטופים ומוסיפים 1X PBS כדי להפוך את הנפח הסופי למיליליטר אחד, אם משתמשים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, או 1.5 מיליליטר, אם משתמשים בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר. הדגירה את חרוזים מגנטיים עם חלבון biotinylated L במשך 35 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב צינור.

לאחר מכן, מניחים את הצינור על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant כדי לאסוף את החלבון L מצופה חרוזים. מוציאים את צינור המיקרוצנטריפוגה מהעמוד המגנטי ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS עם חיץ של 3%BSA, ואחריו צינורות עדינים לפחות חמש פעמים כדי לשטוף את קדילי החלבון מצופים L. שוב, מניחים את הצינור על מעמד מגנטי במשך יותר מדקה אחת ולהסיר את supernatant כדי לאסוף את חרוזים מצופים.

חזור על שטיפת BSA עוד ארבע פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוגרם נוגדנים לנוגדן GFP 19C8 ונוגדן GFP 19F7 כל אחד לתוך חרוזי החלבון מצופה L, והדגירה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס על מסובב צינור. כדי לאסוף את מטריצת הזיקה, מניחים את הצינור על המגנטי במשך יותר מדקה אחת ומסירים את העל-טבעי.

קח את הצינור מהעמוד המגנטי ולהוסיף מיליליטר אחד של חיץ מלח נמוך. יש לשטוף בעדינות את מטריצת הזיקה ולחזור על שטיפת המאגר עם המלח הנמוך פעמיים נוספות. תוכלו להשתמש מחדש ב-200 מיקרוליטרים של מאגר מלח נמוך, כדי ליצור 200 מיקרוליטרים של מטריצת אהדה.

ראשית, להגדיר את מטחנת הרקמות, כך צינורות זכוכית PTFE ניתן להציב על קרח במהלך הומוגניזציה. מלא ארבעה מיליליטר של חיץ תזה קרה לתוך צינורות הזכוכית PTFE. מניחים את הכבד על צלחת פטרי.

השתמש בסכין כדי לבודד 200 עד 500 מיליגרם של חתיכות כבד ולעבור לתוך צינורות זכוכית PTFE. מניחים את רקמת הכבד הנותרת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש והקפאת פלאש בחנקן נוזלי. הומוגניזציה של הדגימות homogenizer מונחה מנוע, החל מ 300 סל"ד עבור לפחות חמש משיכות כדי לנתק hepatocytes ממבנה הכבד.

מנמיך את צינור הזכוכית בכל פעם. מניעת aeration, אשר יכול לגרום denaturation חלבון, על ידי שמירה על העלי מתחת לפתרון. לאחר מכן, להעלות את המהירות ל 900 סל"ד כדי הומוגניזציה מלאה של רקמות הכבד לפחות 12 משיכות מלאות.

מעבירים את ה-lysate לצינורות מסומנים ומצוננים מראש עם לא יותר ממיליליטר של ליט כל אחד. כדי להתחיל תמוגה גרעינית, צנטריפוגה הכבד lysate ב 2, 000 פעמים g בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את העל טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה מצונן מראש חדש על קרח. הוסיפו 1/9 מהנפח העל-טבעי של 10%NP-40 לצינור המיקרוצנטריפוגה על הקרח וערבבו את הפתרון על ידי היפוך עדין של הצינור.

סובבו במהירות את צינורות המיקרוצנטריפוגה עם מיני צנטריפוגה והוסיפו 1/9 מנפח הדגימה של 10%DOC. מערבבים על ידי היפוך עדין של צינורות המיקרוצנטריפוגה ומסובבים במהירות את צינורות המיקרוצנטריפוגה והדגירה על הקרח במשך חמש דקות. צנטריפוגה ליאזט גרעיני ב 20, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולהעביר את העל טבעי צינורות מיקרוצנטריפוגה מצוננים מראש חדש על קרח.

עבור כל צינור, להוציא 1% מהנפח הכולל של העל-טבעי כבקרה טרום אימונו-אימונpreציפציציה. מניחים את פקדי הקדם-אימונו-ציפציה על מסובב צינור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לדאוג במיוחד כדי לעכל בעדינות את מטריצת הזיקה על-ידי צינורות, ולאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטרים לכל דגימה.

דגירה lysates בארבע מעלות צלזיוס לילה עם ערבוב עדין על מסובב צינור. כדי לבודד RNA, במהירות לסובב את הצינורות המכילים את lysates בצנטריפוגה מיני ולאסוף את חרוזים על ידי הנחת על המדף המגנטי לפחות דקה אחת. אסוף את העל-טבעי בצינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים.

מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ מלח גבוה טרי לכל צינור, ואחריו צינורות עדינים לפחות חמש פעמים מבלי להציג בועות. לאסוף את חרוזים על לעמוד מגנטי על הקרח במשך יותר מדקה ולהסיר את supernatant. חזור על שלבי הכביסה ארבע פעמים נוספות.

לאחר מכן, להסיר את צינורות microcentrifuge מהעמוד המגנטי מקום בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי להתחמם. תן מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטרים של מאגר תיזה עם 0.7 מיקרוליטרים של בטא-מרפטואתנול כדי לשחרר רנ"א כבול ממטריצת הזיקה. מערבולת הצינורות למשך חמש שניות לפחות במהירות הגבוהה ביותר ומסתובבים במהירות למטה.

לאחר מכן, הדגירה את הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי לפחות דקה אחת, ואז לאסוף את supernatant ולהמשיך מיד ניקוי RNA על פי פרוטוקול טיהור RNA בערכה. כדי להשיג איכות מרבית של ה- RNA המבודד, בצע את כל השלבים האופציונליים, כולל עיכול DNase וכל שלבי האלוטיון של RNA, כולל ההתחממות המוקדמת המומלצת של מאגר האלוטיון ל-60 מעלות צלזיוס.

במחקר זה, היתוך GFP-L10A וטרנסגנס פה נמסרו במשותף בתוך וקטור מלכודת פלסמיד המכיל טרנספוזון לכבדים על ידי הזרקה הידרודינמית. הסרת nitisinone גרמה לפגיעה בכבד רעיל. כתמי שפעת חיסונית אישרו את הדו-דיכוי של חלבון ההיתוך FAH ו- GFP-L10A ואת ההפטוציטים המאכלסים מחדש לאחר שבועיים של אכלס מחדש את הכבד.

דגימת ההפוגה ייצרה את התשואה הגבוהה ביותר של חלבון היתוך, שכן כל ההפטוציטים מבטאים GFP-L10A לאחר הזרקת AAV8-TBG-Cre. לעומת זאת, בקושי כל RNA היה מזוהה בפקדים מסוג פראי שלא היה להם את המשדר GFP-L10A, המציין את הליך TRAP הוא ספציפי מאוד ויש לו רקע נמוך. כאשר TRAP שימש על רקמת הכבד עובר התחדשות עם hepatocytes מתמר GFP-L10A, RNA באיכות גבוהה בשפע הושג.

לעומת זאת, לא זוהה מעקב RNA באמצעות Bioanalyzer עבור מדגם הבקרה השלילית. ביטוי Gsta1 היה המושרה על ידי למעלה מעשרה פי עשרה בהחזרת hepatocytes לעומת hepatocytes התרדה, בעוד ערכי מחזור סף לא זוהה עם RNA מבודד TRAP מעכבר סוג הבר בשל היעדר RNA קלט. כאשר homogenizing הרקמה, הקפד להזיז את העלי לאט כדי למנוע aeration.

לאחר בידוד ה- RNA, ניתן לבצע רצף תפוקה גבוהה או qPCR כדי לנתח ביטוי גנים. עם TRAP-seq, עכשיו יש לנו שיטה לבודד באופן ספציפי RNA מ אכלוס מחדש hepatocytes ולנתח את השינוי בביטוי גנים במהלך אכלוס הכבד. זה מאפשר לנו לזהות גנים שהשתנו במהלך תהליך זה ויעדים טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בפגיעה בכבד.

Cycloheximide ו DTT, אשר נמצאים במספר מאגרים, שניהם רעילים. יש לאסוף ולהשליך פסולת בהתאם להנחיות המוסדיים.